Sirkulerende tumor-DNA-analyse for å optimalisere behandling for pasienter med tykktarmskreft (IMPROVE)

1. INNLEDNING Kolorektal kreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen på verdensbasis. Omtrent to tredjedeler av pasientene har i utgangspunktet en potensielt helbredelig sykdom, men til tross for kurativt tiltenkt behandling opplever 30-40 % tilbakefall av sykdommen. Ved diagnostisering kan overlevelse av CRC i utgangspunktet forbedres på to måter, 1) ved å redusere risikoen for residiv alt sammen, f.eks. ved å forbedre kirurgi eller ved å tilby adjuvant kjemoterapi til pasienter med høy risiko for residiv, eller 2) ved tidlig påvisning av residiv som muliggjør tidlig intervensjon som forbedrer pasientens overlevelse betydelig.

   Radikal kirurgi er den viktigste faktoren for residiv og overlevelse av CRC, og frie reseksjonsmarginer er av største betydning. Initiativer for å optimalisere kvaliteten på kirurgi, inkludert reseksjon innenfor de riktige planene og overholdelse av konseptet med fullstendig mesokolisk eksisjon med sentral ligering av svulsternæringsarteriene, er for tiden iverksatt i Danmark. Et enkelt dansk senter (Hillerød Hospital) som har implementert denne teknikken har rapportert betydelig høyere overlevelsesrater sammenlignet med tilsvarende danske sentre som bruker standard kirurgi.

   Randomiserte studier har vist at den terapeutiske fordelen med adjuvant kjemoterapi er beskjeden, mens toksisiteten er betydelig. Følgelig er behandlingsgevinst kun dokumentert for pasientene med høyest risiko for tilbakefall (stadium III). Ikke desto mindre kommer også en undergruppe av stadium I og stadium II pasienter tilbake og kan potensielt ha nytte av adjuvant terapi. Utvikling av en sensitiv tilnærming for å vurdere om okkult restsykdom er tilstede etter operasjon er svært ønskelig for å identifisere en høyrisiko-undergruppe som bør tilbys adjuvant terapi. For stadium III sykdom er det dessuten godt dokumentert at mange pasienter overbehandles med adjuvant terapi. Kirurgi alene kurerer > 40 % av slike pasienter, og antallet som trengs for å behandle for å forhindre tilbakefall er ~7. Også for disse pasientene er det behov for bedre og mer spesifikke markører for residivrisiko.

   Solide svulster, inkludert CRC, frigjør DNA-fragmenter til plasma. Plasmaet til kreftpasienter inneholder DNA-fragmenter fra både normale celler og kreftceller. Dette DNAet omtales som cellefritt DNA (cfDNA), mens den spesifikke fraksjonen som stammer fra tumorceller kalles sirkulerende tumor-DNA (ctDNA). Etterforskerne har nylig presentert resultater som, på linje med andre, indikerer at pasienter med ctDNA påvist etter operasjonen har ekstremt høy risiko for et senere radiologisk residiv (HR=37,66; 95 % CI, 4,23 til 335,49; P<0,0001). Denne risikoen er større enn hos pasienter med stadium III kolorektal kreft som rutinemessig behandles med adjuvant terapi. Disse funnene viser at postoperativ ctDNA-analyse har potensial til å bli et svært verdifullt verktøy for vurdering av kvaliteten på den primære operasjonen og for å veilede bruken av adjuvant terapi.

   I samsvar med andre har etterforskerne vist at ctDNA-endringer oppdaget gjennom longitudinell analyse korrelerer tett med endringer i tumorvolum, vurdert ved CT-avbildning. Dermed har ctDNA-analyse potensial som et verktøy for å vurdere virkningen av intervensjon (f. kjemoterapi, kirurgi, radiofrekvensablasjon (RFA) og stereotaktisk kroppsterapi (SRBT)). Etterforskerne har vist at seriell ctDNA-analyse muliggjør påvisning av begynnende tilbakefall av klinisk sykdom i gjennomsnitt 10 måneder før ved konvensjonelle modaliteter (primært CT-skanning. Følgelig har ctDNA-analyse potensial til å gi et kritisk mulighetsvindu for intervensjon på et tidlig tidspunkt der kurative modaliteter fortsatt er et alternativ.

2. UNDERSØKELSESPLAN 2.1 Overordnet studiedesign IMPROVE - OBSERVASJONELLE STUDIER er basert på en omfattende serie med blodprøvetaking og ctDNA-analyser utført hos CRC-pasienter før og etter operasjon, under og etter adjuvant kjemoterapi og under overvåking. Pasientene følges 5 år fra operasjonsdato.

IMPROVE OBSERVATIONSSTUDIENE består logistisk sett av to deler:

FORBEDRE OBSERVASJONELL STUDIE DEL I - KIRURGI Denne delen omfatter blodprøvetaking og ctDNA-analyse preoperativt og umiddelbart etter kirurgi (post-OP dag 14) og prøvetaking av vev fra den resekerte prøven.

FORBEDRE OBSERVASJONSSTUDIE DEL II - OVERVÅKING Denne delen omfatter longitudinell blodprøvetaking over en 5 års overvåkingsperiode.

FORBEDRE INTERVENSJONELL STUDY - FORBEDRE DET En undergruppe av pasienter inkludert i FORBEDRE DEL I - KIRURGI er kandidater for inkludering i FORBEDRE INTERVENSJONELL STUDY - FORBEDRE DET. IMPROVE IT-studien er beskrevet i detalj i en egen protokoll.

2.2 Prøvestørrelse Vi vil inkludere minst 1800 pasienter behandlet med kurativ hensikt for stadium I-III sykdom. Vi har nylig rapportert en studie som viser at ctDNA var påviselig i plasma (tegnet kort tid etter operasjonen) fra 57 % av tilbakefallende stadium II- og III-pasienter og hos 0 % av ikke-tilbakefallspasientene. I denne studien forventer vi en høyere følsomhet da vi vil analysere ~8 ganger større blodvolumer enn tidligere. Vi forventer følgende trinnfordeling: trinn I, 28 %; trinn II, 37%; trinn III, 35%9; og estimerte ~223 tilbakefallshendelser (forventede tilbakefallsrater: stadium I, 7%; stadium II, 12%; stadium III, 17%). Når vi kombinerer våre tidligere resultater med størrelsen på den foreslåtte kohorten og med forventet distribusjon og tilbakefallshendelser, gir dette en kraft på >99,9 % ved et presisjonsnivå på 1 % (to-sidet) for å bekrefte prognostisk betydning av ctDNA ved slutten av studiet.

2.3 Innsamling av biologiske prøver (blod og vev) 2.3.1 Tidspunkter for prøvetaking - FORBEDRE DEL I - KIRURGI For alle pasienter inkludert i del I (Kirurgi) vil det bli tatt blodprøver før og etter operasjonen. Når det er mulig, vil friske svulster og tilstøtende normale slimhinnebiopsier bli samlet inn fra den kirurgiske resekerte prøven, ellers vil formalinfiksert parafininnstøpt vev hentes fra arkivene.

2.3.2 Tidspunkter for prøvetaking - FORBEDRE DEL II - OVERVÅKELSE For alle pasienter inkludert i del II (overvåking) vil det bli tatt blodprøver på langs i løpet av den postoperative oppfølgingsperioden: tre ganger i år 1, tre ganger i år 2, to ganger i år 3, og en gang i året i år 4 og 5.

2.3.3 Tidspunkt for identifisering av kandidater for IMPROVE IT. Kandidatene er pasienter med stadium I eller II sykdom og UTEN risikofaktorer som kvalifiserer for adjuvant kjemoterapi, og hvis blodprøve dag 14 er ctDNA positiv. Pasienter som har samtykket til å motta blodprøveresultatet dag 14 blir kontaktet og invitert til å delta i IMPROVE-IT. Før inkludering tilbys pasientene en PET-CT-skanning, for å sikre at ingen metastaser har blitt oversett.

Hvis dag 14-prøven er ctDNA-negativ, informeres pasientene om at deres tilbakefallsrisiko er lav og at de vil bli overvåket i henhold til DCCG-retningslinjene.

Pasienter med indikasjoner for adjuvant kjemoterapi informeres om at de IKKE vil motta informasjon om analyseresultater av deres dag 14 blodprøve, siden dette ikke vil endre deres planlagte behandlingsforløp. Pasientene blir bedt om å samtykke til longitudinell blodprøvetaking og ctDNA-analyse (inkludert i FORBEDRE DEL II - OVERVÅKELSE), uansett om de skal få adjuvant kjemoterapi eller ikke.

2.4 Molekylær analyse 2.4.1 Påvisning og kvantifisering av sirkulerende tumor-DNA Påvisning og kvantifisering av ctDNA vil bli utført ved å bruke vår nylig utviklede ultrasensitive målrettede dupleks-sekvenseringsmetode. Ved å bruke denne tilnærmingen vil vi sekvensere mer enn 5000 unike DNA-molekyler fra hver plasmaprøve. Derved er påvisning av somatiske mutasjoner med allelfrekvenser ned til ~0,1 % mulig. Videre inkluderer vår forbedrede metode flere trinn som tar sikte på å redusere feilraten, inkludert bruk av unike strengspesifikke molekylære strekkoder (UMI) og redundant sekvensering av hvert cfDNA-fragment. Derved kan vi skille polymerase-induserte feil fra sanne mutasjoner.

Sekvenseringsmetoden retter seg mot <100 000 av de 3 milliarder basene i det menneskelige genomet. Panelet omfatter de vanligste og viktigste CRC-drivermutasjonene identifisert i IntOGEN- og TCGA-databasene. Flere redundante fangprober brukes for hvert gen for å forbedre dekningen og gi høyere spesifisitet. Målretting mot disse regionene er tilstrekkelig til å sikre at minst én somatisk mutasjon vil bli identifisert i hvert CRC-tilfelle og bør derfor muliggjøre vurdering av ctDNA-nivået hos alle inkluderte pasienter. Genregionene som er inkludert i panelet er: TP53 ekson 5-8 (1792 baser), KRAS kodoner 12, 13, 61, 117 og 146 (738 baser), SMAD2 selekterte hyppig muterte regioner (463 baser), SMAD4 selekterte ofte mutert regioner (513 baser), FAM123B selekterte hyppig muterte regioner (669 baser), SOX9 valgte hyppig muterte regioner (693 baser), APC valgte hyppig muterte regioner (5477 baser), TCF7L2 valgte hyppig muterte regioner (920 baser), NRAS-kodoner 12, 13 og 61 (405 baser), BRAF-kodon 600 og andre i nærheten (200 baser), FBXW7 valgte hyppig muterte regioner (868 baser), PIK3CA 8 hotspot-mutasjoner (905 baser).

2.5 Innsamling av klinisk informasjon En sentral del av prosjektet innebærer sammenligning og korrelasjon av ctDNA-vurderingene (innhentet fra blodprøvene) med klinisk informasjon om behandling og utfall. Klinisk informasjon om behandlingen og resultatet av behandlingen vil bli samlet inn fra sykehusjournaler og helseregistre.

2.6 Definisjoner av prediktorvariabler, kovariater og endepunkter 2.6.1 Primært endepunkt

• Sykdomsfri overlevelse ved 3 år (3y-DFS) 2.6.2 Sekundære endepunkter
• Lokalt og/eller fjernt tilbakefall (patologisk, radiologisk eller klinisk)
• Tid til gjentakelse (TTR)
• Sykdomsfri overlevelse ved 1 år (1y-DFS))
• Total overlevelse ved år 5 (5y-OS)
• Molekylær restsykdom
• Tid til molekylært tilbakefall (TTMR) 2.6.3 Sikkerhetsendepunkt
• Frekvens og alvorlighetsgrad av uønskede hendelser (AE) i forhold til blodprøvene per protokoll.

2.6.4 Definisjon av endepunkter

• DFS er definert som tiden fra operasjonen til den første forekomsten av noen av følgende hendelser; lokoregionalt tilbakefall, fjernmetastaser eller død av en hvilken som helst årsak.
• Tid til residiv regnes fra operasjonsdato til lokoregionalt residiv eller fjernmetastaser, eller død fra tykktarmskreft.
• Total overlevelse er definert som tiden fra operasjon til død uansett årsak.
• Molekylær restsykdom er definert som påvisning av sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) i en blodprøve tatt kort tid etter slutten av en kurativt tiltenkt behandling (mellom dag 1 og dag 30 etter operasjonen, eller mellom dag 1 og dag 30 etter avsluttet adjuvans terapi).
• Tid til molekylært tilbakefall beregnes fra første gang uten påvisbart ctDNA til påvisbart ctDNA.

2.7 Statistisk analyse 2.7.1 Analyse av DFS, OS, TTR Kaplan-Meier estimater vil bli brukt for estimering av mediantider til residiv (klinisk og molekylær), sykdom eller død og deres konfidensintervaller, stratifisert i henhold til UICC stadium og/eller post-OP ctDNA-status. Endepunkter vil bli vurdert ved hjelp av log-rank test eller en Cox regresjonsmodell, med tid til hendelse (klinisk eller molekylært tilbakefall eller død) som responsvariabel og ctDNA etter kirurgi eller adjuvant terapi som faktor.