Analisi del DNA tumorale circolante per ottimizzare il trattamento per i pazienti con cancro del colon-retto (IMPROVE)

1. INTRODUZIONE Il cancro del colon-retto (CRC) è il terzo tumore più comune al mondo. Circa due terzi dei pazienti presentano inizialmente una malattia potenzialmente curabile, ma nonostante il trattamento mirato alla cura, il 30-40% sperimenta una ricaduta della malattia. Una volta diagnosticata, la sopravvivenza del CRC può sostanzialmente essere migliorata in due modi, 1) riducendo del tutto il rischio di recidiva, ad es. migliorando la chirurgia o offrendo la chemioterapia adiuvante ai pazienti ad alto rischio di recidiva, o 2) individuando precocemente la recidiva consentendo un intervento precoce che migliora significativamente la sopravvivenza del paziente.

   La chirurgia radicale è il fattore più importante per la recidiva e la sopravvivenza del CRC e i margini liberi di resezione sono di fondamentale importanza. In Danimarca sono attualmente in corso iniziative per ottimizzare la qualità della chirurgia, inclusa la resezione entro i piani corretti e l'adesione al concetto di escissione mesocolica completa con legatura centrale delle arterie che alimentano il tumore. Un singolo centro danese (Hillerød Hospital) che ha implementato questa tecnica ha riportato tassi di sopravvivenza sostanzialmente più elevati rispetto a centri danesi simili che utilizzano la chirurgia standard.

   Studi randomizzati hanno dimostrato che il beneficio terapeutico della chemioterapia adiuvante è modesto, mentre la tossicità è sostanziale. Di conseguenza, il beneficio del trattamento è stato documentato solo per i pazienti con il più alto rischio di recidiva (stadio III). Tuttavia, anche un sottogruppo di pazienti in stadio I e II recidiva e potrebbe potenzialmente trarre beneficio dalla terapia adiuvante. Lo sviluppo di un approccio sensibile per valutare se la malattia residua occulta è presente dopo l'intervento chirurgico è altamente desiderabile per identificare un sottogruppo ad alto rischio a cui dovrebbe essere offerta una terapia adiuvante. Inoltre, per la malattia in stadio III è ben documentato che molti pazienti sono sovratrattati con terapia adiuvante. La chirurgia da sola cura > 40% di tali pazienti e il numero necessario da trattare per prevenire una ricaduta è ~7. Anche per questi pazienti c'è bisogno di marcatori di rischio di recidiva migliori e più specifici.

   I tumori solidi, compreso il CRC, rilasciano frammenti di DNA nel plasma. Il plasma dei malati di cancro contiene frammenti di DNA di cellule normali e tumorali. Questo DNA è indicato come DNA libero da cellule (cfDNA), mentre la frazione specifica che origina dalle cellule tumorali è chiamata DNA tumorale circolante (ctDNA). I ricercatori hanno recentemente presentato risultati che, in linea con altri, indicano che i pazienti con ctDNA rilevato dopo l'intervento chirurgico sono a rischio estremamente elevato di una successiva recidiva radiologica (HR=37,66; IC 95%, da 4,23 a 335,49; P<0,0001). Questo rischio è maggiore rispetto a quello dei pazienti con carcinoma del colon-retto in stadio III che vengono trattati di routine con terapia adiuvante. Questi risultati mostrano che l'analisi post-operatoria del ctDNA ha il potenziale per diventare uno strumento di grande valore per la valutazione della qualità della chirurgia primaria e per guidare l'uso della terapia adiuvante.

   In accordo con altri, i ricercatori hanno dimostrato che i cambiamenti del ctDNA rilevati attraverso l'analisi longitudinale sono strettamente correlati ai cambiamenti nel volume del tumore valutati dall'imaging TC. Pertanto, l'analisi del ctDNA ha il potenziale come strumento per valutare l'impatto dell'intervento (ad es. chemioterapia, chirurgia, ablazione con radiofrequenza (RFA) e terapia corporea stereotassica (SRBT)). I ricercatori hanno dimostrato che l'analisi seriale del ctDNA consente il rilevamento di una recidiva clinica incipiente della malattia in media 10 mesi prima mediante le modalità convenzionali (principalmente TAC. Di conseguenza, l'analisi del ctDNA ha il potenziale per fornire una finestra critica di opportunità di intervento in un momento iniziale in cui le modalità curative sono ancora un'opzione.

2. PIANO DI INVESTIGAZIONE 2.1 Disegno complessivo dello studio Gli STUDI OSSERVAZIONALI IMPROVE si basano su una serie completa di prelievi di sangue e analisi del ctDNA eseguiti in pazienti con CRC prima e dopo l'intervento chirurgico, durante e dopo la chemioterapia adiuvante e durante la sorveglianza. I pazienti vengono seguiti per 5 anni dalla data dell'intervento.

Gli IMPROVE OBSERVATIONAL STUDIES sono logisticamente composti da due parti:

STUDIO OSSERVAZIONALE IMPROVE PARTE I - CHIRURGIA Questa parte comprende il prelievo di sangue e l'analisi del ctDNA prima dell'intervento e immediatamente dopo l'intervento (giorno 14 dopo l'intervento) e il prelievo di tessuto dal campione resecato.

MIGLIORARE LO STUDIO OSSERVAZIONALE PARTE II - SORVEGLIANZA Questa parte comprende il prelievo longitudinale di sangue per un periodo di sorveglianza di 5 anni.

IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT Un sottogruppo di pazienti inclusi in IMPROVE PART I - SURGERY sono candidati per l'inclusione in IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT. Lo studio IMPROVE IT è descritto in dettaglio in un protocollo separato.

2.2 Dimensione del campione Includeremo almeno 1800 pazienti trattati con intento curativo per malattia in stadio I-III. Abbiamo recentemente riportato uno studio che mostra che il ctDNA era rilevabile nel plasma (prelevato subito dopo l'intervento chirurgico) dal 57% dei pazienti con recidiva in stadio II e III e nello 0% dei pazienti senza recidiva. Nel presente studio, ci aspettiamo una maggiore sensibilità poiché analizzeremo volumi di sangue ~ 8 volte maggiori rispetto a prima. Ci aspettiamo la seguente distribuzione per stadi: stadio I, 28%; stadio II, 37%; stadio III, 35%9; e circa 223 eventi di recidiva stimati (tassi di recidiva attesi: stadio I, 7%; stadio II, 12%; stadio III, 17%). Quando si combinano i nostri risultati precedenti con la dimensione della coorte suggerita e con la distribuzione prevista e gli eventi di ricaduta, ciò si traduce in una potenza >99,9% con un livello di precisione dell'1% (a due code) per confermare il significato prognostico del ctDNA al fine dello studio.

2.3 Raccolta di campioni biologici (sangue e tessuto) 2.3.1 Punti temporali per la raccolta del campione - MIGLIORARE PARTE I - CHIRURGIA Per tutti i pazienti inclusi nella parte I (chirurgia) verranno prelevati campioni di sangue prima e dopo l'intervento chirurgico. Quando possibile, dal campione resecato chirurgicamente verranno prelevate biopsie fresche del tumore e della mucosa normale adiacente, altrimenti verranno ottenuti dagli archivi tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina.

2.3.2 Punti temporali per la raccolta del campione - MIGLIORARE LA PARTE II - SORVEGLIANZA Per tutti i pazienti inclusi nella parte II (sorveglianza) i campioni di sangue verranno prelevati longitudinalmente durante il periodo di follow-up post-chirurgico: tre volte nell'anno 1, tre volte nell'anno 2, due volte al 3° anno e una volta all'anno al 4° e al 5° anno.

2.3.3 Punto temporale per l'identificazione dei candidati per IMPROVE IT. I candidati sono pazienti con malattia in stadio I o II e SENZA fattori di rischio idonei per la chemioterapia adiuvante, e il cui campione di sangue al giorno 14 è positivo al ctDNA. I pazienti che hanno acconsentito a ricevere il risultato del campione di sangue del giorno 14 vengono contattati e invitati a partecipare a IMPROVE-IT. Prima dell'inclusione, ai pazienti viene offerta una scansione PET-TC, per garantire che nessuna metastasi sia stata trascurata.

Se il campione del giorno 14 è ctDNA negativo, i pazienti vengono informati che il loro rischio di ricaduta è basso e che riceveranno la sorveglianza secondo le linee guida DCCG.

I pazienti con indicazioni per la chemioterapia adiuvante sono informati che NON riceveranno informazioni sui risultati dell'analisi del loro prelievo di sangue del giorno 14, poiché ciò non cambierà il loro corso di trattamento pianificato. Ai pazienti viene chiesto di acconsentire al prelievo di sangue longitudinale e all'analisi del ctDNA (inclusione in IMPROVE PART II - SORVEILLANCE), indipendentemente dal fatto che riceveranno o meno la chemioterapia adiuvante.

2.4 Analisi molecolare 2.4.1 Rilevamento e quantificazione del DNA tumorale circolante Il rilevamento e la quantificazione del ctDNA saranno eseguiti utilizzando il nostro approccio di sequenziamento duplex mirato ultra sensibile recentemente sviluppato. Utilizzando questo approccio, sequenzieremo più di 5.000 molecole di DNA uniche da ciascun campione di plasma. Pertanto, è possibile il rilevamento di mutazioni somatiche con frequenze alleliche fino a ~ 0,1%. Inoltre, il nostro metodo migliorato include più passaggi volti a ridurre il tasso di errore, compreso l'uso di codici a barre molecolari specifici del filamento (UMI) e il sequenziamento ridondante di ciascun frammento di cfDNA. In tal modo possiamo distinguere gli errori indotti dalla polimerasi dalle vere mutazioni.

L'approccio di sequenziamento mira a <100.000 dei 3 miliardi di basi nel genoma umano. Il pannello comprende le mutazioni del driver CRC più comuni e importanti identificate nei database IntOGEN e TCGA. Per ogni gene vengono utilizzate più sonde di cattura ridondanti per migliorare la copertura e fornire una maggiore specificità. Mirare a queste regioni è sufficiente per garantire che almeno una mutazione somatica venga identificata in ciascun caso di CRC e dovrebbe quindi consentire la valutazione del livello di ctDNA in tutti i pazienti inclusi. Le regioni geniche incluse nel pannello sono: TP53 esone 5-8 (1792 basi), codoni KRAS 12, 13, 61, 117 e 146 (738 basi), SMAD2 regioni frequentemente mutate (463 basi), SMAD4 selezionate frequentemente mutate regioni (513 basi), FAM123B ha selezionato regioni frequentemente mutate (669 basi), SOX9 ha selezionato regioni frequentemente mutate (693 basi), APC ha selezionato regioni frequentemente mutate (5477 basi), TCF7L2 ha selezionato regioni frequentemente mutate (920 basi), NRAS codoni 12, 13 e 61 (405 basi), BRAF codone 600 e altri vicini (200 basi), FBXW7 ha selezionato regioni frequentemente mutate (868 basi), mutazioni hotspot PIK3CA 8 (905 basi).

2.5 Raccolta di informazioni cliniche Una parte centrale del progetto prevede il confronto e la correlazione delle valutazioni del ctDNA (raccolte dai campioni di sangue) con le informazioni cliniche sul trattamento e sull'esito. Le informazioni cliniche relative al trattamento e all'esito del trattamento saranno raccolte dalle cartelle cliniche e dai registri sanitari.

2.6 Definizioni di variabili predittive, covariate ed endpoint 2.6.1 Endpoint primario

• Sopravvivenza libera da malattia a 3 anni (3y-DFS) 2.6.2 Endpoint secondari
• Recidiva locale e/o distante (patologica, radiologica o clinica)
• Tempo alla ricorrenza (TTR)
• Sopravvivenza libera da malattia a 1 anno (1y-DFS))
• Sopravvivenza globale all'anno 5 (5a-OS)
• Malattia molecolare residua
• Tempo alla recidiva molecolare (TTMR) 2.6.3 Endpoint di sicurezza
• Frequenza e gravità degli eventi avversi (AE) in relazione ai prelievi di sangue per protocollo.

2.6.4 Definizione degli endpoint

• La DFS è definita come il tempo dall'intervento chirurgico alla prima occorrenza di uno qualsiasi dei seguenti eventi; recidiva loco-regionale, metastasi a distanza o morte per qualsiasi causa.
• Il tempo alla recidiva è calcolato dalla data dell'intervento fino alla recidiva loco-regionale o alle metastasi a distanza, o alla morte per cancro del colon-retto.
• La sopravvivenza globale è definita come il tempo che intercorre tra l'intervento chirurgico e la morte per qualsiasi causa.
• La malattia molecolare residua è definita come il rilevamento del DNA tumorale circolante (ctDNA) in un campione di sangue prelevato poco dopo la fine di un trattamento a scopo curativo (tra il giorno 1 e il giorno 30 post-operatorio, o tra il giorno 1 e il giorno 30 dopo la fine del trattamento adiuvante terapia).
• Il tempo alla recidiva molecolare viene calcolato dalla prima volta in cui non è stato rilevato ctDNA fino a quando non è stato rilevato ctDNA.

2.7 Analisi statistica 2.7.1 Analisi di DFS, OS, TTR Le stime di Kaplan-Meier saranno utilizzate per la stima dei tempi mediani alla recidiva (clinica e molecolare), alla malattia o alla morte e i relativi intervalli di confidenza, stratificati in base allo stadio UICC e/o stato del ctDNA post-operatorio. Gli endpoint saranno valutati utilizzando il log-rank test o un modello di regressione di Cox, con il tempo all'evento (recidiva clinica o molecolare o morte) come variabile di risposta e ctDNA post-operatorio o terapia adiuvante come fattore.