結腸直腸がん患者の治療を最適化する循環腫瘍 DNA 解析 (IMPROVE)

1. はじめに 結腸直腸癌 (CRC) は、世界で 3 番目に多い癌です。 患者の約 3 分の 2 は、治癒の可能性がある疾患を最初に示しますが、治癒を意図した治療にもかかわらず、30 ～ 40% の患者が疾患の再発を経験します。 診断された場合、CRC の生存率は基本的に 2 つの方法で改善できます。手術を改善するか、再発リスクの高い患者に補助化学療法を提供するか、または 2) 再発を早期に検出して早期介入を可能にし、患者の生存率を大幅に改善する。

   根治手術は、CRC の再発と生存にとって最も重要な要素であり、切除の余白が最も重要です。 デンマークでは、正しい面内での切除や腫瘍栄養動脈の中心結紮による完全中結腸切除の概念の順守など、手術の質を最適化するためのイニシアチブが現在実施されています。 この技術を導入したデンマークの 1 つのセンター (Hillerød Hospital) は、標準的な手術を使用する同様のデンマークのセンターと比較して、実質的に高い生存率を報告しています。

   無作為化試験では、補助化学療法の治療効果はわずかであり、毒性は相当なものであることが示されています。 したがって、治療効果は、再発リスクが最も高い患者 (ステージ III) についてのみ記録されています。 それにもかかわらず、ステージ I およびステージ II の患者のサブセットも再発し、補助療法の恩恵を受ける可能性があります。 手術後に潜在的な残存病変が存在するかどうかを評価するための感度の高いアプローチの開発は、補助療法を提供する必要がある高リスクのサブグループを特定するために非常に望ましいです。 さらに、ステージ III の疾患では、多くの患者が補助療法で過剰治療されていることが十分に実証されています。 手術だけでそのような患者の 40% 以上が治癒し、再発を防ぐために治療が必要な患者数は 7 人までです。 これらの患者についても、再発リスクのより優れた、より特異的なマーカーが必要です。

   CRC を含む固形腫瘍は、DNA 断片を血漿中に放出します。 がん患者の血漿には、正常細胞とがん細胞の両方の DNA 断片が含まれています。 この DNA は無細胞 DNA (cfDNA) と呼ばれ、腫瘍細胞に由来する特定の部分は循環腫瘍 DNA (ctDNA) と呼ばれます。 研究者らは最近、他の結果と同様に、ctDNA が手術後に検出された患者は、後の放射線学的再発のリスクが非常に高いことを示す結果を発表しました (HR=37.66; 95% CI、4.23 ～ 335.49。 P<0.0001)。 このリスクは、定期的に補助療法を受けているステージ III の結腸直腸癌患者よりも大きくなります。 これらの発見は、術後ctDNA分析が、一次手術の質を評価し、補助療法の使用を導くための非常に価値のあるツールになる可能性があることを示しています。

   他の研究者と一致して、研究者らは、縦断的分析によって検出された ctDNA の変化が、CT イメージングによって評価される腫瘍体積の変化と密接に相関することを示しました。 したがって、ctDNA 分析は、介入の影響を評価するためのツールとしての可能性を秘めています (例: 化学療法、手術、高周波アブレーション (RFA)、および定位身体療法 (SRBT))。 研究者らは、一連の ctDNA 分析により、従来のモダリティ (主に CT スキャン) によって平均 10 か月前に初期の臨床的疾患の再発を検出できることを示しました。 したがって、ctDNA 解析は、治療法が依然として選択肢である初期の時点で、介入の重要な機会を提供する可能性を秘めています。

2. 調査計画 2.1 全体的な調査デザイン 改善 - 観察調査は、CRC 患者の手術前と手術後、補助化学療法中と後、およびサーベイランス中に実施された包括的な一連の採血と ctDNA 分析に基づいています。 患者は、手術日から 5 年間追跡されます。

IMPROVE OBSERVATIONAL STUDIES は論理的に 2 つの部分で構成されています。

観察研究の改善 パート I - 手術 このパートは、術前と手術直後 (術後 14 日目) の採血と ctDNA 分析、および切除標本からの組織のサンプリングで構成されます。

観察研究の改善 パート II - サーベイランス このパートは、5 年間のサーベイランス期間にわたる縦断的採血で構成されます。

IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT IMPROVE PART I - SURGERY に含まれる患者のサブセットは、IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT に含める候補です。 IMPROVE IT 研究は、別のプロトコルで詳細に説明されています。

2.2 サンプルサイズ 病期 I～III の治療目的で治療を受けた少なくとも 1800 人の患者を含めます。 我々は最近、ctDNAがステージIIおよびIIIの再発患者の57%、非再発患者の0%の血漿(手術直後に採取)で検出可能であることを示す研究を報告した。 現在の研究では、以前よりも最大 8 倍の血液量を分析するため、より高い感度が期待されます。 次のステージの分布が予想されます。ステージ I、28%。ステージ II、37%。ステージ III、35%9。約 223 件の再発イベントが推定されます (予想される再発率: ステージ I、7%、ステージ II、12%、ステージ III、17%)。 以前の結果を提案されたコホートのサイズと予想される分布および再発イベントと組み合わせると、これは、ctDNA の予後的意義を確認するための 1% の精度レベル (両側) で >99.9% の検出力に変換されます。研究の終わり。

2.3 生物学的サンプル (血液および組織) の収集 2.3.1 サンプル収集の時点 - パート I の改善 - 手術 パート I (手術) に含まれるすべての患者について、手術の前後に血液サンプルが採取されます。 可能な限り新鮮な腫瘍と隣接する正常な粘膜の生検は、外科的切除標本から収集されます。それ以外の場合は、アーカイブからホルマリン固定パラフィン包埋組織が取得されます。

2.3.2 サンプル収集の時点 - パート II の改善 - サーベイランス パート II (サーベイランス) に含まれるすべての患者について、手術後のフォローアップ期間中に血液サンプルが縦方向に採取されます: 1 年目に 3 回、2 年目に 3 回、2 回3 年目、4 年目と 5 年目は年 1 回。

2.3.3 IMPROVE IT の候補を特定する時点。 候補者は、ステージ I または II の疾患を持ち、補助化学療法の対象となる危険因子がなく、14 日目の血液サンプルが ctDNA 陽性である患者です。 14 日目の血液サンプルの結果を受け取ることに同意した患者にアプローチし、IMPROVE-IT に参加するよう招待します。 含める前に、転移が見落とされていないことを確認するために、患者に PET-CT スキャンが提供されます。

14 日目のサンプルが ctDNA 陰性である場合、患者は再発リスクが低く、DCCG ガイドラインに従って監視を受けることを通知されます。

補助化学療法の適応がある患者には、14 日目の血液サンプルの分析結果に関する情報は提供されないことが通知されます。これは、予定されている治療コースを変更するものではないためです。 患者は、アジュバント化学療法を受けるかどうかに関係なく、縦断的な採血と ctDNA 分析 (IMPROVE PART II - SURVEILLANCE に含める) に同意するよう求められます。

2.4 分子分析 2.4.1 循環腫瘍 DNA の検出と定量化 ctDNA の検出と定量化は、最近開発された超高感度ターゲット二重シーケンシング アプローチを使用して実行されます。 このアプローチを使用して、各血漿サンプルから 5,000 を超える固有の DNA 分子を配列決定します。 これにより、対立遺伝子頻度が 0.1% までの体細胞変異の検出が可能です。 さらに、私たちの改善された方法には、エラー率を減らすことを目的とした複数のステップが含まれています。これには、一意の鎖固有の分子バーコード (UMI) の使用や各 cfDNA フラグメントの冗長シーケンスが含まれます。 これにより、ポリメラーゼによって誘発されたエラーを真の変異と区別することができます。

配列決定アプローチは、ヒトゲノムの 30 億塩基のうち 100.000 未満を対象としています。 このパネルは、IntOGEN および TCGA データベースで特定された、最も一般的で重要な CRC ドライバー変異で構成されています。 カバレッジを改善し、より高い特異性を提供するために、複数の冗長キャプチャープローブが各遺伝子に使用されます。 これらの領域を標的とすることは、各CRC症例で少なくとも1つの体細胞変異が特定されることを保証するのに十分であり、したがって、含まれるすべての患者のctDNAレベルの評価を可能にするはずです. パネルに含まれる遺伝子領域は次のとおりです: TP53 エクソン 5-8 (1792 塩基)、KRAS コドン 12、13、61、117、および 146 (738 塩基)、選択された頻繁に変異する SMAD2 領域 (463 塩基)、選択された頻繁に変異する SMAD4領域（513 塩基）、FAM123B 選択高頻度変異領域（669 塩基）、SOX9 選択高頻度変異領域（693 塩基）、APC 選択高頻度変異領域（5477 塩基）、TCF7L2 選択高頻度変異領域（920 塩基）、NRAS コドン 12、 13、および61（405塩基）、BRAFコドン600およびその他（200塩基）、FBXW7は頻繁に変異する領域（868塩基）、PIK3CA 8ホットスポット変異（905塩基）を選択しました。

2.5 臨床情報の収集 プロジェクトの中心的な部分には、ctDNA 評価 (血液サンプルから収集されたもの) と治療および結果に関する臨床情報との比較と相関が含まれます。 治療と治療の結果に関する臨床情報は、病院の記録と健康登録簿から収集されます。

2.6 予測変数、共変量、エンドポイントの定義 2.6.1 主要エンドポイント

• 3 年無病生存率 (3y-DFS) 2.6.2 二次エンドポイント
• 局所および/または遠隔再発（病理学的、放射線学的または臨床的）
• 再発までの時間 (TTR)
• 1年無病生存率（1y-DFS）
• 5年目の全生存率（5y-OS）
• 分子遺残症
• 分子再発までの時間 (TTMR) 2.6.3 安全性エンドポイント
• プロトコルごとの採血に関連する有害事象 (AE) の頻度と重症度。

2.6.4 エンドポイントの定義

• DFS は、手術から次のイベントのいずれかが最初に発生するまでの時間として定義されます。局所再発、遠隔転移、またはあらゆる原因による死亡。
• 再発までの時間は、手術日から局所領域再発または遠隔転移、または結腸直腸癌による死亡まで計算されます。
• 全生存期間は、手術から何らかの原因による死亡までの時間として定義されます。
• 分子残存病変は、治癒を目的とした治療の終了直後 (手術後 1 日目から 30 日目の間、または補助療法終了後 1 日目から 30 日目の間) に採取された血液サンプル中の循環腫瘍 DNA (ctDNA) の検出として定義されます。治療）。
• 分子再発までの時間は、最初にctDNAが検出されなくなってからctDNAが検出されるまで計算されます。

2.7 統計分析 2.7.1 DFS、OS、TTR の分析 Kaplan-Meier 推定値は、再発 (臨床的および分子的)、疾患または死亡までの時間の中央値、およびそれらの信頼区間の推定に使用されます。 OP後のctDNAステータス。 エンドポイントは、イベントまでの時間（臨床的または分子的再発または死亡）を応答変数として、ctDNA手術後または補助療法を因子として、ログランク検定またはCox回帰モデルを使用して評価されます。