Análise de DNA de tumor circulante para otimizar o tratamento de pacientes com câncer colorretal (IMPROVE)

1. INTRODUÇÃO O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais comum no mundo. Aproximadamente dois terços dos pacientes inicialmente apresentam doença potencialmente curável, mas, apesar do tratamento com intenção curativa, 30-40% apresentam recaída da doença. Quando diagnosticado, a sobrevida do CCR pode ser basicamente melhorada de duas maneiras, 1) reduzindo o risco de recorrência em conjunto, por ex. melhorando a cirurgia ou oferecendo quimioterapia adjuvante aos pacientes com alto risco de recorrência, ou 2) pela detecção precoce da recorrência, permitindo uma intervenção precoce que melhora significativamente a sobrevida do paciente.

   A cirurgia radical é o fator mais importante para a recorrência e sobrevida do CCR, e as margens livres de ressecção são de suma importância. Iniciativas para otimizar a qualidade da cirurgia, incluindo a ressecção nos planos corretos e a adesão ao conceito de excisão mesocólica completa com ligadura central das artérias que alimentam o tumor, estão sendo implementadas na Dinamarca. Um único centro dinamarquês (Hospital Hillerød) que implementou esta técnica relatou taxas de sobrevida substancialmente mais altas em comparação com centros dinamarqueses similares usando cirurgia padrão.

   Ensaios randomizados mostraram que o benefício terapêutico da quimioterapia adjuvante é modesto, enquanto a toxicidade é substancial. Consequentemente, o benefício do tratamento só foi documentado para os pacientes com maior risco de recorrência (estágio III). No entanto, também um subconjunto de pacientes nos estágios I e II recorrem e podem se beneficiar da terapia adjuvante. O desenvolvimento de uma abordagem sensível para avaliar se a doença residual oculta está presente após a cirurgia é altamente desejável para identificar um subgrupo de alto risco que deve receber terapia adjuvante. Além disso, para a doença em estágio III, está bem documentado que muitos pacientes são supertratados com terapia adjuvante. A cirurgia sozinha cura > 40% desses pacientes e o número necessário para tratar para prevenir uma recaída é de aproximadamente 7. Também para esses pacientes, há necessidade de melhores e mais específicos marcadores de risco de recorrência.

   Tumores sólidos, incluindo CRC, liberam fragmentos de DNA no plasma. O plasma de pacientes com câncer contém fragmentos de DNA de células normais e cancerígenas. Este DNA é referido como DNA livre de células (cfDNA), enquanto a fração específica que se origina de células tumorais é chamada de DNA tumoral circulante (ctDNA). Os investigadores apresentaram recentemente resultados que, em consonância com outros, indicam que pacientes com ctDNA detectados após a cirurgia apresentam risco extremamente alto de recorrência radiológica posterior (HR=37,66; IC 95%, 4,23 a 335,49; P<0,0001). Esse risco é maior do que em pacientes com câncer colorretal estágio III tratados rotineiramente com terapia adjuvante. Esses achados mostram que a análise pós-operatória de ctDNA tem potencial para se tornar uma ferramenta altamente valiosa para avaliação da qualidade da cirurgia primária e para orientar o uso de terapia adjuvante.

   De acordo com outros, os investigadores mostraram que as alterações no ctDNA detectadas por meio de análise longitudinal se correlacionam intimamente com as alterações no volume do tumor avaliadas por imagens de TC. Assim, a análise do ctDNA tem potencial como ferramenta para avaliar o impacto da intervenção (por exemplo, quimioterapia, cirurgia, ablação por radiofrequência (RFA) e terapia corporal estereotáxica (SRBT)). Os investigadores mostraram que a análise serial de ctDNA permite a detecção de recorrência clínica incipiente da doença em média 10 meses antes pelas modalidades convencionais (principalmente tomografia computadorizada. Consequentemente, a análise do ctDNA tem o potencial de fornecer uma janela crítica de oportunidade para intervenção em um momento inicial, onde as modalidades curativas ainda são uma opção.

2. PLANO DE INVESTIGAÇÃO 2.1 Desenho geral do estudo Os ESTUDOS OBSERVACIONAIS IMPROVE são baseados em uma série abrangente de amostras de sangue e análises de ctDNA realizadas em pacientes com CRC antes e depois da cirurgia, durante e após a quimioterapia adjuvante e durante a vigilância. Os pacientes são acompanhados por 5 anos a partir da data da cirurgia.

Os ESTUDOS DE OBSERVAÇÃO MELHORADOS consistem logisticamente em duas partes:

APRIMORAR O ESTUDO DE OBSERVAÇÃO PARTE I - CIRURGIA Esta parte compreende amostragem de sangue e análise de ctDNA pré-operatória e imediatamente após a cirurgia (pós-OP dia 14) e amostragem de tecido do espécime ressecado.

MELHORAR O ESTUDO DE OBSERVAÇÃO PARTE II - VIGILÂNCIA Esta parte compreende amostragem de sangue longitudinal durante um período de vigilância de 5 anos.

IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT Um subconjunto de pacientes incluídos no IMPROVE PART I - SURGERY são candidatos para inclusão no IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT. O estudo IMPROVE IT é descrito em detalhes em um protocolo separado.

2.2 Tamanho da amostra Incluiremos pelo menos 1800 pacientes tratados com intenção curativa para doença em estágio I-III. Recentemente, relatamos um estudo mostrando que o ctDNA foi detectável no plasma (colhido logo após a cirurgia) de 57% dos pacientes com recidiva nos estágios II e III e em 0% dos pacientes sem recaída. No presente estudo, esperamos uma sensibilidade maior, pois estaremos analisando volumes de sangue ~ 8 vezes maiores do que anteriormente. Esperamos a seguinte distribuição por estágios: estágio I, 28%; estágio II, 37%; estágio III, 35%9; e aproximadamente 223 eventos de recaída estimados (taxas de recaída esperadas: estágio I, 7%; estágio II, 12%; estágio III, 17%). Ao combinar nossos resultados anteriores com o tamanho da coorte sugerida e com a distribuição esperada e eventos de recaída, isso se traduz em um poder de > 99,9% em um nível de precisão de 1% (bicaudal) para confirmar a significância prognóstica do ctDNA no final do estudo.

2.3 Coleta de amostras biológicas (sangue e tecidos) 2.3.1 Momentos para coleta de amostras - IMPROVE PART I - CIRURGIA Para todos os pacientes incluídos na parte I (Cirurgia) serão coletadas amostras de sangue antes e depois da cirurgia. Sempre que possível, biópsias de tumor fresco e mucosa normal adjacente serão coletadas do espécime cirúrgico ressecado, caso contrário, tecidos embebidos em parafina fixados em formalina serão obtidos dos arquivos.

2.3.2 Pontos de tempo para coleta de amostras - MELHORAR PARTE II - VIGILÂNCIA Para todos os pacientes incluídos na parte II (vigilância), amostras de sangue serão coletadas longitudinalmente durante o período de acompanhamento pós-cirúrgico: três vezes no ano 1, três vezes no ano 2, duas vezes no 3.º ano e uma vez por ano nos 4.º e 5.º anos.

2.3.3 Momento de identificação dos candidatos ao IMPROVE IT. Os candidatos são pacientes com doença em estágio I ou II e SEM fatores de risco que se qualificam para quimioterapia adjuvante, e cuja amostra de sangue no dia 14 é ctDNA positivo. Os pacientes que consentiram em receber o resultado da amostra de sangue no dia 14 são abordados e convidados a participar do IMPROVE-IT. Antes da inclusão, os pacientes recebem uma PET-CT, para garantir que nenhuma metástase tenha sido negligenciada.

Se a amostra do dia 14 for ctDNA negativa, os pacientes serão informados de que seu risco de recaída é baixo e que receberão vigilância de acordo com as diretrizes do DCCG.

Os pacientes com indicação de quimioterapia adjuvante são informados de que NÃO receberão informações sobre os resultados da análise da amostra de sangue do dia 14, pois isso não alterará o curso planejado do tratamento. Os pacientes são convidados a consentir com a amostragem longitudinal de sangue e análise de ctDNA (inclusão em MELHORAR PARTE II - VIGILÂNCIA), independentemente de receberem quimioterapia adjuvante ou não.

2.4 Análise molecular 2.4.1 Detecção e quantificação de DNA tumoral circulante A detecção e quantificação de ctDNA serão realizadas usando nossa abordagem de sequenciamento duplex direcionada ultrassensível recentemente desenvolvida. Usando essa abordagem, sequenciaremos mais de 5.000 moléculas de DNA únicas de cada amostra de plasma. Assim, a detecção de mutações somáticas com frequências alélicas de até ~ 0,1% é possível. Além disso, nosso método aprimorado inclui várias etapas destinadas a reduzir a taxa de erro, incluindo o uso de códigos de barras moleculares específicos de fita (UMIs) exclusivos e sequenciamento redundante de cada fragmento de cfDNA. Assim, podemos distinguir erros induzidos pela polimerase de mutações verdadeiras.

A abordagem de sequenciamento tem como alvo <100.000 dos 3 bilhões de bases do genoma humano. O painel compreende as mutações de driver CRC mais comuns e importantes identificadas nos bancos de dados IntOGEN e TCGA. Múltiplas sondas de captura redundantes são usadas para cada gene para melhorar a cobertura e fornecer maior especificidade. O direcionamento dessas regiões é suficiente para garantir que pelo menos uma mutação somática seja identificada em cada caso de CRC e, portanto, deve permitir a avaliação do nível de ctDNA em todos os pacientes incluídos. As regiões gênicas incluídas no painel são: TP53 exon 5-8 (1792 bases), códons KRAS 12, 13, 61, 117 e 146 (738 bases), SMAD2 selecionou regiões frequentemente mutadas (463 bases), SMAD4 selecionou regiões frequentemente mutadas regiões (513 bases), FAM123B selecionou regiões frequentemente mutadas (669 bases), SOX9 selecionou regiões frequentemente mutadas (693 bases), APC selecionou regiões frequentemente mutadas (5477 bases), TCF7L2 selecionou regiões frequentemente mutadas (920 bases), NRAS códons 12, 13 e 61 (405 bases), códon BRAF 600 e outros próximos (200 bases), FBXW7 selecionou regiões frequentemente mutadas (868 bases), PIK3CA 8 hotspot mutações (905 bases).

2.5 Coleta de informações clínicas Uma parte central do projeto envolve a comparação e correlação das avaliações de ctDNA (coletadas das amostras de sangue) com as informações clínicas sobre tratamento e resultados. Informações clínicas sobre o tratamento e o resultado do tratamento serão coletadas dos registros hospitalares e registros de saúde.

2.6 Definições de variáveis ​​preditoras, covariáveis ​​e endpoints 2.6.1 Endpoint primário

• Sobrevida livre de doença em 3 anos (3 anos-DFS) 2.6.2 Pontos de extremidade secundários
• Recorrência local e/ou à distância (patológica, radiológica ou clínica)
• Tempo para recorrência (TTR)
• Sobrevida livre de doença em 1 ano (1a-DFS))
• Sobrevida global no ano 5 (5 anos-OS)
• Doença residual molecular
• Tempo para recorrência molecular (TTMR) 2.6.3 Ponto final de segurança
• Frequência e gravidade de eventos adversos (EA) em relação às coletas de sangue por protocolo.

2.6.4 Definição de pontos finais

• DFS é definido como o tempo desde a cirurgia até a primeira ocorrência de qualquer um dos seguintes eventos; recorrência locorregional, metástases à distância ou morte por qualquer causa.
• O tempo até a recorrência é calculado a partir da data da cirurgia até a recorrência locorregional ou metástases distantes, ou morte por câncer colorretal.
• A sobrevida global é definida como o tempo desde a cirurgia até a morte por qualquer causa.
• A doença residual molecular é definida como a detecção de DNA tumoral circulante (ctDNA) em uma amostra de sangue coletada logo após o término de um tratamento com intenção curativa (entre o dia 1 e o dia 30 após a cirurgia, ou entre o dia 1 e o dia 30 após o término do tratamento adjuvante terapia).
• O tempo até a recorrência molecular é calculado desde a primeira vez sem ctDNA detectável até o ctDNA detectável.

2.7 Análise estatística 2.7.1 Análise de DFS, OS, TTR As estimativas de Kaplan-Meier serão usadas para estimar os tempos médios de recorrência (clínica e molecular), doença ou morte e seus intervalos de confiança, estratificados de acordo com o estágio UICC e/ou status de ctDNA pós-OP. Os desfechos serão avaliados usando o teste de log-rank ou um modelo de regressão de Cox, com o tempo até o evento (recorrência clínica ou molecular ou morte) como variável de resposta e ctDNA pós-cirurgia ou terapia adjuvante como fator.