Zirkulierende Tumor-DNA-Analyse zur Optimierung der Behandlung von Patienten mit Darmkrebs (IMPROVE)

1. EINFÜHRUNG Darmkrebs (CRC) ist weltweit die dritthäufigste Krebsart. Ungefähr zwei Drittel der Patienten stellen sich anfänglich mit einer potenziell heilbaren Krankheit vor, aber trotz einer kurativ beabsichtigten Behandlung erleiden 30–40 % einen Rückfall der Krankheit. Nach der Diagnose kann das Überleben von CRC grundsätzlich auf zwei Arten verbessert werden, 1) durch die Reduzierung des Rezidivrisikos insgesamt, z. B. durch Verbesserung der Operation oder durch Angebot einer adjuvanten Chemotherapie für Patienten mit hohem Rezidivrisiko, oder 2) durch Früherkennung eines Rezidivs, wodurch eine frühzeitige Intervention ermöglicht wird, die das Überleben des Patienten signifikant verbessert.

   Die radikale Operation ist der wichtigste Faktor für das Wiederauftreten und Überleben von CRC, und freie Resektionsränder sind von größter Bedeutung. Initiativen zur Optimierung der Operationsqualität, einschließlich der Resektion innerhalb der korrekten Ebenen und der Einhaltung des Konzepts der vollständigen mesokolischen Exzision mit zentraler Ligatur der tumorversorgenden Arterien, werden derzeit in Dänemark umgesetzt. Ein einziges dänisches Zentrum (Krankenhaus Hillerød), das diese Technik implementiert hat, hat im Vergleich zu ähnlichen dänischen Zentren, die Standardoperationen anwenden, erheblich höhere Überlebensraten gemeldet.

   Randomisierte Studien haben gezeigt, dass der therapeutische Nutzen einer adjuvanten Chemotherapie bescheiden ist, während die Toxizität beträchtlich ist. Dementsprechend ist ein Behandlungsnutzen nur für die Patienten mit dem höchsten Rezidivrisiko (Stadium III) dokumentiert. Dennoch tritt auch bei einer Untergruppe von Patienten im Stadium I und II ein Rezidiv auf und könnte möglicherweise von einer adjuvanten Therapie profitieren. Die Entwicklung eines sensitiven Ansatzes zur Beurteilung, ob nach der Operation eine okkulte Resterkrankung vorliegt, ist sehr wünschenswert, um eine Untergruppe mit hohem Risiko zu identifizieren, der eine adjuvante Therapie angeboten werden sollte. Darüber hinaus ist für Stadium-III-Erkrankungen gut dokumentiert, dass viele Patienten mit einer adjuvanten Therapie überbehandelt werden. Eine Operation allein heilt > 40 % dieser Patienten, und die Zahl der Patienten, die behandelt werden müssen, um einen Rückfall zu verhindern, beträgt ~7. Auch für diese Patienten besteht Bedarf an besseren und spezifischeren Markern für das Rezidivrisiko.

   Solide Tumore, einschließlich CRC, setzen DNA-Fragmente ins Plasma frei. Das Plasma von Krebspatienten enthält DNA-Fragmente sowohl von normalen als auch von Krebszellen. Diese DNA wird als zellfreie DNA (cfDNA) bezeichnet, während die spezifische Fraktion, die aus Tumorzellen stammt, als zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) bezeichnet wird. Die Forscher haben kürzlich Ergebnisse vorgelegt, die im Einklang mit anderen darauf hindeuten, dass Patienten mit postoperativ nachgewiesener ctDNA ein extrem hohes Risiko für ein späteres radiologisches Rezidiv haben (HR = 37,66; 95 % KI, 4,23 bis 335,49; P<0,0001). Dieses Risiko ist größer als bei Patienten mit Darmkrebs im Stadium III, die routinemäßig mit einer adjuvanten Therapie behandelt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die postoperative ctDNA-Analyse das Potenzial hat, ein äußerst wertvolles Instrument zur Beurteilung der Qualität der primären Operation und zur Steuerung der Anwendung der adjuvanten Therapie zu werden.

   In Übereinstimmung mit anderen haben die Forscher gezeigt, dass ctDNA-Veränderungen, die durch Längsschnittanalyse festgestellt wurden, eng mit Änderungen des Tumorvolumens korrelieren, wie es durch CT-Bildgebung festgestellt wurde. Daher hat die ctDNA-Analyse Potenzial als Instrument zur Bewertung der Auswirkungen von Interventionen (z. Chemotherapie, Operation, Radiofrequenzablation (RFA) und stereotaktische Körpertherapie (SRBT)). Die Prüfärzte haben gezeigt, dass eine serielle ctDNA-Analyse mit den konventionellen Modalitäten (hauptsächlich CT-Scan) im Durchschnitt 10 Monate zuvor die Erkennung eines beginnenden klinischen Krankheitsrezidivs ermöglicht. Dementsprechend hat die ctDNA-Analyse das Potenzial, ein kritisches Zeitfenster für eine Intervention zu einem frühen Zeitpunkt zu bieten, zu dem kurative Modalitäten noch eine Option sind.

2. UNTERSUCHUNGSPLAN 2.1 Gesamtdesign der Studie Die IMPROVE – BEOBACHTUNGSSTUDIEN basieren auf einer umfassenden Reihe von Blutentnahmen und ctDNA-Analysen, die bei CRC-Patienten vor und nach der Operation, während und nach adjuvanter Chemotherapie und während der Überwachung durchgeführt wurden. Die Patienten werden 5 Jahre ab dem Datum der Operation nachbeobachtet.

Die IMPROVE OBSERVATIONAL STUDIES bestehen logistisch aus zwei Teilen:

VERBESSERUNG DER BEOBACHTUNGSSTUDIE TEIL I – CHIRURGIE Dieser Teil umfasst die Blutentnahme und die ctDNA-Analyse vor der Operation und unmittelbar nach der Operation (Post-OP-Tag 14) sowie die Gewebeentnahme aus der resezierten Probe.

VERBESSERUNG DER BEOBACHTUNGSSTUDIE TEIL II – ÜBERWACHUNG Dieser Teil umfasst Längsblutentnahmen über einen Überwachungszeitraum von 5 Jahren.

VERBESSERUNG DER INTERVENTIONSSTUDIE – VERBESSERUNG EINER Untergruppe von Patienten, die in VERBESSERUNG TEIL I – CHIRURGIE enthalten sind, sind Kandidaten für die Aufnahme in die VERBESSERUNG DER INTERVENTIONSSTUDIE – VERBESSERUNG DER IT. Die IMPROVE IT-Studie wird in einem separaten Protokoll detailliert beschrieben.

2.2 Stichprobenumfang Wir schließen mindestens 1800 Patienten ein, die mit kurativer Absicht für die Krankheit im Stadium I-III behandelt wurden. Wir haben kürzlich über eine Studie berichtet, die zeigt, dass ctDNA im Plasma (entnommen kurz nach der Operation) von 57 % der Patienten mit Rückfällen im Stadium II und III und bei 0 % der Patienten ohne Rückfall nachweisbar war. In der vorliegenden Studie erwarten wir eine höhere Sensitivität, da wir etwa 8-mal größere Blutvolumina als zuvor analysieren werden. Wir erwarten folgende Stufenverteilung: Stufe I, 28 %; Stufe II, 37 %; Stadium III, 35 %9; und geschätzte ~223 Rückfallereignisse (erwartete Rückfallraten: Stadium I, 7 %; Stadium II, 12 %; Stadium III, 17 %). Kombiniert man unsere bisherigen Ergebnisse mit der Größe der vorgeschlagenen Kohorte und mit den erwarteten Verteilungs- und Rückfallereignissen, ergibt sich eine Aussagekraft von > 99,9 % bei einem Präzisionsniveau von 1 % (zweiseitig) zur Bestätigung der prognostischen Signifikanz von ctDNA bei der Ende des Studiums.

2.3 Entnahme biologischer Proben (Blut und Gewebe) 2.3.1 Zeitpunkte für die Probenentnahme – VERBESSERUNG VON TEIL I – CHIRURGIE Für alle Patienten, die in Teil I (Operation) eingeschlossen sind, werden vor und nach der Operation Blutproben entnommen. Wann immer möglich, werden Biopsien von frischem Tumor und benachbarter normaler Schleimhaut aus dem chirurgisch resezierten Präparat entnommen, andernfalls werden formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe aus den Archiven bezogen.

2.3.2 Zeitpunkte für die Probenentnahme – VERBESSERUNG VON TEIL II – ÜBERWACHUNG Bei allen Patienten, die in Teil II (Überwachung) eingeschlossen sind, werden während der postoperativen Nachbeobachtungsphase längsschnittlich Blutproben entnommen: dreimal im Jahr 1, dreimal im Jahr 2, zweimal in der 3. Klasse und einmal jährlich in der 4. und 5. Klasse.

2.3.3 Zeitpunkt zur Identifizierung von Kandidaten für IMPROVE IT. Die Kandidaten sind Patienten im Stadium I oder II der Erkrankung und OHNE Risikofaktoren, die sich für eine adjuvante Chemotherapie qualifizieren, und deren Blutprobe am 14. Tag ctDNA-positiv ist. Patienten, die dem Erhalt des Blutprobenergebnisses von Tag 14 zugestimmt haben, werden angesprochen und zur Teilnahme an IMPROVE-IT eingeladen. Vor dem Einschluss wird den Patientinnen ein PET-CT-Scan angeboten, um sicherzustellen, dass keine Metastasen übersehen wurden.

Wenn die Probe von Tag 14 ctDNA-negativ ist, werden die Patienten darüber informiert, dass ihr Rückfallrisiko gering ist und dass sie gemäß den DCCG-Richtlinien überwacht werden.

Patienten mit Indikationen für eine adjuvante Chemotherapie werden darüber informiert, dass sie KEINE Informationen über die Analyseergebnisse ihrer Blutentnahme am 14. Tag erhalten, da dies ihren geplanten Behandlungsverlauf nicht ändert. Die Patienten werden gebeten, einer Längsschnitt-Blutentnahme und ctDNA-Analyse (Aufnahme in IMPROVE PART II – SURVEILLANCE) zuzustimmen, unabhängig davon, ob sie eine adjuvante Chemotherapie erhalten oder nicht.

2.4 Molekulare Analyse 2.4.1 Nachweis und Quantifizierung von zirkulierender Tumor-DNA Der Nachweis und die Quantifizierung von ctDNA wird unter Verwendung unseres kürzlich entwickelten ultrasensitiven zielgerichteten Duplex-Sequenzierungsansatzes durchgeführt. Mit diesem Ansatz werden wir mehr als 5.000 einzigartige DNA-Moleküle aus jeder Plasmaprobe sequenzieren. Dadurch ist der Nachweis somatischer Mutationen mit Allelfrequenzen bis hinunter zu ~0,1 % möglich. Darüber hinaus umfasst unsere verbesserte Methode mehrere Schritte, die darauf abzielen, die Fehlerrate zu reduzieren, einschließlich der Verwendung einzigartiger strangspezifischer molekularer Barcodes (UMIs) und der redundanten Sequenzierung jedes cfDNA-Fragments. Dadurch können wir Polymerase-induzierte Fehler von echten Mutationen unterscheiden.

Der Sequenzierungsansatz zielt auf <100.000 der 3 Milliarden Basen im menschlichen Genom ab. Das Panel umfasst die häufigsten und wichtigsten CRC-Treibermutationen, die in den IntOGEN- und TCGA-Datenbanken identifiziert wurden. Für jedes Gen werden mehrere redundante Fangsonden verwendet, um die Abdeckung zu verbessern und eine höhere Spezifität bereitzustellen. Die Ausrichtung auf diese Regionen reicht aus, um sicherzustellen, dass in jedem CRC-Fall mindestens eine somatische Mutation identifiziert wird, und sollte daher eine Beurteilung des ctDNA-Spiegels bei allen eingeschlossenen Patienten ermöglichen. Die im Panel enthaltenen Genregionen sind: TP53-Exon 5-8 (1792 Basen), KRAS-Codons 12, 13, 61, 117 und 146 (738 Basen), SMAD2-ausgewählte häufig mutierte Regionen (463 Basen), SMAD4-ausgewählte häufig mutierte Regionen Regionen (513 Basen), FAM123B ausgewählte häufig mutierte Regionen (669 Basen), SOX9 ausgewählte häufig mutierte Regionen (693 Basen), APC ausgewählte häufig mutierte Regionen (5477 Basen), TCF7L2 ausgewählte häufig mutierte Regionen (920 Basen), NRAS-Codons 12, 13 und 61 (405 Basen), BRAF-Codon 600 und andere in der Nähe (200 Basen), FBXW7 selektierte häufig mutierte Regionen (868 Basen), PIK3CA 8 Hotspot-Mutationen (905 Basen).

2.5 Sammlung klinischer Informationen Ein zentraler Teil des Projekts beinhaltet den Vergleich und die Korrelation der ctDNA-Bewertungen (aus den Blutproben gesammelt) mit den klinischen Informationen zu Behandlung und Ergebnis. Klinische Informationen über die Behandlung und das Ergebnis der Behandlung werden aus Krankenhausakten und Gesundheitsregistern gesammelt.

2.6 Definitionen von Prädiktorvariablen, Kovariaten und Endpunkten 2.6.1 Primärer Endpunkt

• Krankheitsfreies Überleben nach 3 Jahren (3-Jahres-DFS) 2.6.2 Sekundäre Endpunkte
• Lokal- und/oder Fernrezidiv (pathologisch, radiologisch oder klinisch)
• Zeit bis zum Rezidiv (TTR)
• Krankheitsfreies Überleben nach 1 Jahr (1y-DFS))
• Gesamtüberleben in Jahr 5 (5-Jahres-OS)
• Molekulare Resterkrankung
• Zeit bis zum molekularen Wiederauftreten (TTMR) 2.6.3 Sicherheitsendpunkt
• Häufigkeit und Schweregrad unerwünschter Ereignisse (AE) in Bezug auf die Per-Protokoll-Blutentnahmen.

2.6.4 Definition von Endpunkten

• DFS ist definiert als die Zeit von der Operation bis zum ersten Auftreten eines der folgenden Ereignisse; lokoregionäres Wiederauftreten, Fernmetastasen oder Tod jeglicher Ursache.
• Die Zeit bis zum Rezidiv wird vom Datum der Operation bis zum lokoregionären Rezidiv oder Fernmetastasen oder Tod durch Darmkrebs berechnet.
• Das Gesamtüberleben ist definiert als die Zeit von der Operation bis zum Tod jeglicher Ursache.
• Molekulare Resterkrankung ist definiert als Nachweis von zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) in einer Blutprobe, die kurz nach Ende einer kurativ beabsichtigten Behandlung (zwischen Tag 1 und Tag 30 nach der Operation oder zwischen Tag 1 und Tag 30 nach Ende der adjuvanten Behandlung) entnommen wird Therapie).
• Die Zeit bis zum molekularen Rezidiv wird vom erstmaligen Fehlen von nachweisbarer ctDNA bis zum Auftreten von nachweisbarer ctDNA berechnet.

2.7 Statistische Analyse 2.7.1 Analyse von DFS, OS, TTR Kaplan-Meier-Schätzungen werden für die Schätzung der medianen Zeiten bis zum Rezidiv (klinisch und molekular), Krankheit oder Tod und deren Konfidenzintervallen verwendet, stratifiziert nach UICC-Stadium und/oder Post-OP-ctDNA-Status. Die Endpunkte werden mithilfe des Log-Rank-Tests oder eines Cox-Regressionsmodells bewertet, wobei die Zeit bis zum Ereignis (klinisches oder molekulares Wiederauftreten oder Tod) als Reaktionsvariable und die ctDNA nach der Operation oder adjuvante Therapie als Faktor berücksichtigt werden.