Analiza DNA krążących guzów w celu optymalizacji leczenia pacjentów z rakiem jelita grubego (IMPROVE)

1. WPROWADZENIE Rak jelita grubego (CRC) jest trzecim najczęściej występującym nowotworem na świecie. Około dwie trzecie pacjentów początkowo zgłasza się z potencjalnie uleczalną chorobą, ale pomimo leczenia zamierzonego, u 30-40% dochodzi do nawrotu choroby. Po zdiagnozowaniu przeżycie CRC można zasadniczo poprawić na dwa sposoby: 1) poprzez całkowite zmniejszenie ryzyka nawrotu, np. poprzez usprawnienie operacji lub zaproponowanie uzupełniającej chemioterapii pacjentom o wysokim ryzyku nawrotu lub 2) wczesne wykrycie wznowy umożliwiające wczesną interwencję znacznie poprawiającą przeżycie chorych.

   Radykalna operacja jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na nawrót i przeżycie CRC, a wolne marginesy resekcji mają ogromne znaczenie. Obecnie w Danii wdrażane są inicjatywy mające na celu optymalizację jakości operacji, w tym resekcję we właściwych płaszczyznach i przestrzeganie koncepcji całkowitego wycięcia krezki jelita grubego z centralnym podwiązaniem tętnic zasilających guz. Pojedynczy duński ośrodek (szpital Hillerød), który wdrożył tę technikę, odnotował znacznie wyższe wskaźniki przeżywalności w porównaniu z podobnymi duńskimi ośrodkami stosującymi standardowe operacje.

   Randomizowane badania wykazały, że korzyść terapeutyczna chemioterapii adjuwantowej jest niewielka, podczas gdy toksyczność jest znaczna. W związku z tym korzyść z leczenia została udokumentowana tylko w przypadku pacjentów z najwyższym ryzykiem nawrotu (stadium III). Niemniej jednak, również podgrupa pacjentów w stadium I i II ma nawrót i potencjalnie może odnieść korzyść z terapii adjuwantowej. Opracowanie czułego podejścia do oceny, czy po operacji występuje utajona choroba resztkowa, jest wysoce pożądane w celu zidentyfikowania podgrupy wysokiego ryzyka, której należy zaoferować leczenie uzupełniające. Co więcej, w przypadku choroby w stadium III dobrze udokumentowano, że wielu pacjentów jest nadmiernie leczonych terapią adjuwantową. Sama operacja leczy > 40% takich pacjentów, a liczba potrzebna do leczenia, aby zapobiec nawrotowi wynosi ~7. Również dla tych pacjentów potrzebne są lepsze i bardziej specyficzne markery ryzyka nawrotu.

   Guzy lite, w tym CRC, uwalniają fragmenty DNA do osocza. Osocze pacjentów z rakiem zawiera fragmenty DNA zarówno z komórek prawidłowych, jak i nowotworowych. To DNA jest określane jako DNA wolne od komórek (cfDNA), podczas gdy specyficzna frakcja, która pochodzi z komórek nowotworowych, nazywana jest krążącym DNA nowotworu (ctDNA). Badacze przedstawili ostatnio wyniki, które, podobnie jak inne, wskazują, że pacjenci z ctDNA wykrytym po operacji są bardzo narażeni na ryzyko późniejszego nawrotu radiologicznego (HR=37,66; 95% CI, 4,23 do 335,49; P<0,0001). Ryzyko to jest większe niż u pacjentów z rakiem jelita grubego w III stopniu zaawansowania, którzy są rutynowo leczeni terapią adjuwantową. Odkrycia te pokazują, że pooperacyjna analiza ctDNA może stać się bardzo cennym narzędziem do oceny jakości pierwotnego zabiegu chirurgicznego i do kierowania stosowaniem terapii uzupełniającej.

   W porozumieniu z innymi badacze wykazali, że zmiany ctDNA wykryte w analizie podłużnej ściśle korelują ze zmianami objętości guza ocenianymi za pomocą obrazowania CT. Zatem analiza ctDNA ma potencjał jako narzędzie do oceny wpływu interwencji (np. chemioterapia, chirurgia, ablacja częstotliwościami radiowymi (RFA) i stereotaktyczna terapia ciała (SRBT)). Badacze wykazali, że seryjna analiza ctDNA umożliwia wykrycie początkowego klinicznego nawrotu choroby średnio 10 miesięcy wcześniej za pomocą konwencjonalnych metod (głównie tomografii komputerowej). W związku z tym analiza ctDNA może potencjalnie zapewnić krytyczne okno możliwości interwencji we wczesnym punkcie czasowym, w którym metody lecznicze są nadal opcją.

2. PLAN BADANIA 2.1 Ogólny projekt badania BADANIA IMPROVE - OBSERWACYJNE opierają się na kompleksowej serii pobierania próbek krwi i analizie ctDNA przeprowadzonych u pacjentów z CRC przed i po operacji, podczas i po chemioterapii adjuwantowej oraz podczas obserwacji. Pacjentów obserwuje się przez 5 lat od daty operacji.

Projekt IMPROVE OBSERVATIONAL STUDIES logistycznie składa się z dwóch części:

ULEPSZENIE BADANIA OBSERWACYJNEGO CZĘŚĆ I - CHIRURGIA Ta część obejmuje pobieranie krwi i analizę ctDNA przed operacją i bezpośrednio po operacji (14 dzień po operacji) oraz pobieranie tkanki z resekcji.

ULEPSZENIE BADANIA OBSERWACYJNEGO CZĘŚĆ II — NADZÓR Ta część obejmuje podłużne pobieranie krwi w ciągu 5-letniego okresu obserwacji.

POPRAW BADANIE INTERWENCJONALNE – POPRAW TO Podgrupa pacjentów uwzględniona w CZĘŚCI POPRAW I – CHIRURGIA jest kandydatem do włączenia do BADANIA INTERWENCJONALNEGO POPRAW – POPRAW IT. Badanie IMPROVE IT zostało szczegółowo opisane w odrębnym protokole.

2.2 Wielkość próby Włączymy co najmniej 1800 pacjentów leczonych z zamiarem wyleczenia choroby w stadium I-III. Niedawno opisaliśmy badanie wykazujące, że ctDNA było wykrywalne w osoczu (pobranym krótko po operacji) u 57% pacjentów z nawrotem w stadium II i III oraz u 0% pacjentów bez nawrotu. W obecnym badaniu spodziewamy się wyższej czułości, ponieważ będziemy analizować ~8 razy większe objętości krwi niż poprzednio. Spodziewamy się następującego rozkładu etapów: etap I, 28%; etap II, 37%; stadium III, 35%9; i oszacowano ~223 nawrotów (oczekiwane wskaźniki nawrotów: stadium I, 7%; stadium II, 12%; stadium III, 17%). Łącząc nasze poprzednie wyniki z wielkością sugerowanej kohorty oraz oczekiwanymi zdarzeniami dystrybucji i nawrotów, przekłada się to na moc> 99,9% na poziomie precyzji 1% (dwustronny) dla potwierdzenia prognostycznego znaczenia ctDNA w koniec badania.

2.3 Pobieranie próbek biologicznych (Krew i tkanki) 2.3.1 Punkty czasowe pobierania próbek – POPRAWA CZĘŚCI I – CHIRURGIA Od wszystkich pacjentów włączonych do części I (Operacja) zostaną pobrane próbki krwi przed i po operacji. Jeśli to możliwe, biopsje świeżego guza i przylegającej prawidłowej błony śluzowej będą pobierane z wycinka chirurgicznego, w przeciwnym razie tkanki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie zostaną pozyskane z archiwów.

2.3.2 Punkty czasowe pobierania próbek - POPRAW CZĘŚĆ II - NADZÓR Dla wszystkich pacjentów objętych częścią II (nadzór) próbki krwi zostaną pobrane podłużnie w okresie obserwacji pooperacyjnej: trzy razy w roku 1, trzy razy w roku 2, dwukrotnie w 3 roku i raz w roku w 4 i 5 roku.

2.3.3 Punkt czasowy identyfikacji kandydatów do USPRAWNIENIA IT. Kandydatami są chorzy w I lub II stopniu zaawansowania choroby, BEZ czynników ryzyka, kwalifikujący się do chemioterapii uzupełniającej, u których próbka krwi w 14. dobie jest pozytywna pod względem ctDNA. Pacjenci, którzy wyrazili zgodę na otrzymanie wyniku z próbki krwi w 14. dniu, są zgłaszani i zapraszani do udziału w IMPROVE-IT. Przed włączeniem pacjentom proponuje się badanie PET-CT, aby upewnić się, że nie przeoczono żadnych przerzutów.

Jeśli próbka z dnia 14 jest ctDNA ujemna, pacjenci są informowani, że ryzyko nawrotu jest niskie i że będą objęci nadzorem zgodnie z wytycznymi DCCG.

Pacjentów ze wskazaniami do chemioterapii adjuwantowej informuje się, że NIE otrzymają informacji o wynikach analizy próbki krwi z 14 doby, gdyż nie zmieni to planowanego przebiegu leczenia. Pacjenci proszeni są o wyrażenie zgody na podłużne pobieranie krwi i analizę ctDNA (włączenie do CZĘŚCI IMPROVE II - SURVEILLANCE), niezależnie od tego, czy otrzymają chemioterapię uzupełniającą, czy nie.

2.4 Analiza molekularna 2.4.1 Wykrywanie i oznaczanie ilościowe krążącego DNA guza Wykrywanie i oznaczanie ilościowe ctDNA zostanie przeprowadzone przy użyciu naszej niedawno opracowanej, ultraczułej, ukierunkowanej metody sekwencjonowania dupleksu. Korzystając z tego podejścia, zsekwencjonujemy ponad 5000 unikalnych cząsteczek DNA z każdej próbki osocza. W ten sposób możliwe jest wykrycie mutacji somatycznych z częstością alleli do ~ 0,1%. Ponadto nasza ulepszona metoda obejmuje wiele kroków mających na celu zmniejszenie wskaźnika błędów, w tym wykorzystanie unikalnych molekularnych kodów kreskowych (UMI) specyficznych dla nici i nadmiarowe sekwencjonowanie każdego fragmentu cfDNA. W ten sposób możemy odróżnić błędy wywołane przez polimerazę od prawdziwych mutacji.

Podejście oparte na sekwencjonowaniu ma na celu <100 000 z 3 miliardów zasad w ludzkim genomie. Panel obejmuje najczęstsze i najważniejsze mutacje sterowników CRC zidentyfikowane w bazach danych IntOGEN i TCGA. Dla każdego genu stosuje się wiele nadmiarowych sond wychwytujących, aby poprawić pokrycie i zapewnić wyższą specyficzność. Ukierunkowanie na te regiony jest wystarczające, aby zapewnić zidentyfikowanie co najmniej jednej mutacji somatycznej w każdym przypadku CRC, a zatem powinno umożliwić ocenę poziomu ctDNA u wszystkich włączonych pacjentów. Regiony genów uwzględnione w panelu to: ekson TP53 5-8 (1792 zasad), kodony KRAS 12, 13, 61, 117 i 146 (738 zasad), SMAD2 wybrane regiony często mutowane (463 zasad), SMAD4 wybrane często mutowane regiony (513 zasad), FAM123B wybrane regiony często mutowane (669 zasad), SOX9 wybrane regiony często mutowane (693 zasad), APC wybrane regiony często mutowane (5477 zasad), TCF7L2 wybrane regiony często mutowane (920 zasad), kodony NRAS 12, 13 i 61 (405 zasad), BRAF kodon 600 i inne w pobliżu (200 zasad), FBXW7 wybrane często zmutowane regiony (868 zasad), 8 mutacji hotspot PIK3CA (905 zasad).

2.5 Gromadzenie informacji klinicznych Centralna część projektu obejmuje porównanie i korelację ocen ctDNA (zebranych z próbek krwi) z informacjami klinicznymi dotyczącymi leczenia i wyników. Informacje kliniczne dotyczące leczenia i wyników leczenia będą zbierane z dokumentacji szpitalnej i rejestrów zdrowotnych.

2.6 Definicje zmiennych predykcyjnych, współzmiennych i punktów końcowych 2.6.1 Pierwszorzędowy punkt końcowy

• Przeżycie wolne od choroby po 3 latach (3y-DFS) 2.6.2 Drugorzędowe punkty końcowe
• Wznowa miejscowa i/lub odległa (patologiczna, radiologiczna lub kliniczna)
• Czas do nawrotu (TTR)
• Przeżycie wolne od choroby po 1 roku (1y-DFS))
• Całkowite przeżycie w roku 5 (5 lat-OS)
• Choroba resztkowa molekularna
• Czas do nawrotu molekularnego (TTMR) 2.6.3 Punkt końcowy bezpieczeństwa
• Częstotliwość i nasilenie zdarzeń niepożądanych (AE) w odniesieniu do pobierania krwi zgodnie z protokołem.

2.6.4 Definicja punktów końcowych

• DFS definiuje się jako czas od operacji do pierwszego wystąpienia któregokolwiek z poniższych zdarzeń; nawrót lokoregionalny, przerzuty odległe lub śmierć z jakiejkolwiek przyczyny.
• Czas do wznowy liczony jest od daty operacji do wznowy miejscowo-regionalnej lub odległych przerzutów lub zgonu z powodu raka jelita grubego.
• Całkowite przeżycie definiuje się jako czas od operacji do zgonu z dowolnej przyczyny.
• Chorobę resztkową na poziomie molekularnym definiuje się jako wykrycie krążącego DNA nowotworu (ctDNA) w próbce krwi pobranej wkrótce po zakończeniu leczenia mającego na celu wyleczenie (między 1. terapia).
• Czas do nawrotu molekularnego oblicza się od pierwszego razu niewykrywalnego ctDNA do wykrywalnego ctDNA.

2.7 Analiza statystyczna 2.7.1 Analiza DFS, OS, TTR Szacunki Kaplana-Meiera zostaną wykorzystane do oszacowania mediany czasu do nawrotu (klinicznego i molekularnego), choroby lub zgonu oraz ich przedziałów ufności, stratyfikowanych zgodnie z etapem UICC i/lub status ctDNA po operacji. Punkty końcowe zostaną ocenione przy użyciu testu log-rank lub modelu regresji Coxa, z czasem do wystąpienia zdarzenia (nawrót kliniczny lub molekularny lub zgon) jako zmienną odpowiedzi i ctDNA po operacji lub terapii adjuwantowej jako czynnik.