Keringő tumor DNS-elemzés a vastag- és végbélrákos betegek kezelésének optimalizálására (IMPROVE)

1. BEVEZETÉS A vastag- és végbélrák (CRC) a harmadik leggyakoribb rák világszerte. A betegek megközelítőleg kétharmada kezdetben potenciálisan gyógyítható betegségben jelentkezik, de a gyógyítólag tervezett kezelés ellenére 30-40%-nál jelentkezik a betegség visszaesése. Ha diagnosztizálják, a CRC túlélése alapvetően kétféle módon javítható: 1) a kiújulás kockázatának csökkentésével együtt, pl. a műtét javításával vagy adjuváns kemoterápia felajánlásával a magas kiújulási kockázatú betegeknek, vagy 2) a kiújulás korai felismerésével, amely lehetővé teszi a korai beavatkozást, amely jelentősen javítja a betegek túlélését.

   A radikális műtét a legfontosabb tényező a CRC kiújulása és túlélése szempontjából, és a szabad reszekciós határok kiemelkedően fontosak. Dániában jelenleg is zajlanak a műtét minőségének optimalizálására irányuló kezdeményezések, beleértve a megfelelő síkokban történő reszekciót és a teljes mezokolikus kimetszés koncepciójának betartását a tumort tápláló artériák központi lekötésével. Egyetlen dán központ (Hillerød Kórház), amely ezt a technikát alkalmazta, lényegesen magasabb túlélési arányról számolt be, mint a szokásos műtétet alkalmazó hasonló dán központok.

   Randomizált vizsgálatok kimutatták, hogy az adjuváns kemoterápia terápiás haszna szerény, míg a toxicitás jelentős. Ennek megfelelően a kezelés előnyeit csak azoknál a betegeknél dokumentálták, akiknél a legmagasabb a kiújulás kockázata (III. stádium). Mindazonáltal az I. és II. stádiumú betegek egy része is kiújul, és potenciálisan előnyös lehet az adjuváns terápia. Nagyon kívánatos egy érzékeny megközelítés kidolgozása annak felmérésére, hogy a műtét után fennáll-e az okkult reziduális betegség, hogy azonosítani lehessen a magas kockázatú alcsoportot, akiknek adjuváns terápiát kell ajánlani. Ezenkívül a III. stádiumú betegség esetében jól dokumentált, hogy sok beteget túlkezelnek adjuváns terápiával. A műtét önmagában az ilyen betegek több mint 40%-át gyógyítja meg, és a visszaesés megelőzéséhez szükséges kezelések száma ~7. Ezeknél a betegeknél is szükség van a kiújulás kockázatának jobb és specifikusabb markereire.

   A szilárd daganatok, köztük a CRC, DNS-fragmenseket bocsátanak ki a plazmába. A rákos betegek plazmája normál és rákos sejtekből származó DNS-fragmenseket is tartalmaz. Ezt a DNS-t sejtmentes DNS-nek (cfDNS) nevezik, míg a tumorsejtekből származó specifikus frakciót keringő tumor DNS-nek (ctDNS) nevezik. A kutatók a közelmúltban olyan eredményeket mutattak be, amelyek – másokkal összhangban – arra utalnak, hogy a műtét után ctDNS-t észlelt betegeknél rendkívül magas a későbbi radiológiai recidíva kockázata (HR=37,66; 95% CI, 4,23-335,49; P<0,0001). Ez a kockázat nagyobb, mint azoknál a III. stádiumú vastagbélrákban szenvedő betegeknél, akiket rutinszerűen adjuváns terápiával kezelnek. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a posztoperatív ctDNS-elemzés rendkívül értékes eszközzé válhat az elsődleges műtét minőségének felmérésében és az adjuváns terápia alkalmazásának iránymutatásában.

   Másokkal egyetértésben a kutatók kimutatták, hogy a longitudinális analízissel kimutatott ctDNS-változások szorosan korrelálnak a CT-képalkotással értékelt tumortérfogat változásaival. Így a ctDNS-elemzés eszközt jelent a beavatkozás hatásának felmérésére (pl. kemoterápia, műtét, rádiófrekvenciás abláció (RFA) és sztereotaktikus testterápia (SRBT)). A kutatók kimutatták, hogy a sorozatos ctDNS elemzés lehetővé teszi a kezdődő klinikai betegség kiújulásának kimutatását átlagosan 10 hónappal korábban a hagyományos módszerekkel (elsősorban CT-vizsgálattal. Ennek megfelelően a ctDNS-elemzés kritikus lehetőséget kínál a beavatkozásra egy olyan korai időpontban, amikor a gyógyító módok még mindig lehetségesek.

2. VIZSGÁLATI TERV 2.1 A vizsgálat általános felépítése Az IMPROVE – MEGFIGYELÉSI VIZSGÁLATOK átfogó vérminta- és ctDNS-elemzéssorozaton alapulnak, amelyet CRC-s betegeknél végeznek a műtét előtt és után, az adjuváns kemoterápia alatt és után, valamint a megfigyelés alatt. A betegeket a műtét időpontjától számított 5 évig követik.

Az IMPROVE OBSERVATIONAL SUDIES logisztikailag két részből áll:

A MEGFIGYELÉSI VIZSGÁLAT FEJLESZTÉSE I. RÉSZ – MŰTÉT Ez a rész a műtét előtti és közvetlenül a műtét után (operáció utáni 14. nap) végzett vérmintavételt és ctDNS-elemzést, valamint a szövetminta vételét tartalmazza a kimetszett mintából.

A MEGFIGYELÉSI VIZSGÁLAT FEJLESZTÉSE II. RÉSZ – FELÜGYELET Ez a rész longitudinális vérmintavételt tartalmaz egy 5 éves megfigyelési időszakon keresztül.

AZ INTERVENCIÓS VIZSGÁLAT JOBBÍTÁSA – FEJLESZTÉSE Az IMPROVE I. RÉSZ – SEBÉSZET kategóriában szereplő betegek egy része az IMPROVE INTERVENTIONAL STUTY – IMPROVE IT programban való részvételre jelölt. Az IMPROVE IT tanulmány részletes leírása külön jegyzőkönyvben található.

2.2 Mintanagyság Legalább 1800, I-III. stádiumú betegség gyógyító szándékkal kezelt beteget veszünk figyelembe. Nemrég beszámoltunk egy tanulmányról, amely kimutatta, hogy a ctDNS kimutatható volt a plazmában (röviddel a műtét után) a visszaeső II. és III. stádiumú betegek 57%-ánál és a nem relapszusos betegek 0%-ánál. Jelen tanulmányban nagyobb érzékenységre számítunk, mivel ~8-szor nagyobb vérmennyiséget fogunk elemezni, mint korábban. A következő szakaszeloszlást várjuk: I. szakasz, 28%; szakasz, 37%; III. szakasz, 35%9; és becsült ~223 relapszus esemény (várható relapszusarány: I. stádium, 7%; II. stádium, 12%; III. stádium, 17%). Ha korábbi eredményeinket a javasolt kohorsz méretével, valamint a várható eloszlási és visszaesési eseményekkel kombináljuk, ez 1%-os (kétirányú) pontossági szinten >99,9%-os hatványt jelent a ctDNS prognosztikai jelentőségének megerősítésére a tanulmány vége.

2.3. Biológiai minták gyűjtése (vér és szövet) 2.3.1. A mintavétel időpontjai – AZ I. RÉSZ JAVÍTÁSA – A MŰTÉT Minden, az I. részben (Sebészet) szereplő beteg esetében vérmintát vesznek a műtét előtt és után. Lehetőség szerint friss daganatból és a szomszédos normál nyálkahártya-biopsziából gyűjtünk a műtéti úton eltávolított mintából, ellenkező esetben formalinban rögzített paraffinba ágyazott szöveteket nyerünk az archívumból.

2.3.2 A mintavétel időpontjai – A II. RÉSZ JAVÍTÁSA – FELÜGYELET A II. részben (megfigyelés) szereplő összes betegből vérmintát vesznek longitudinálisan a műtét utáni követési időszakban: háromszor az 1. évben, háromszor a 2. évben, kétszer. a 3. évben, a 4. és 5. évben pedig évente egyszer.

2.3.3 Az IT FEJLESZTÉSÉRE pályázók azonosításának időpontja. A jelöltek I. vagy II. stádiumú betegségben szenvedő, kockázati tényezők NÉLKÜL adjuváns kemoterápiára alkalmasak, és akiknek a 14. napi vérmintája ctDNS-pozitív. Azokat a betegeket, akik hozzájárultak a 14. napi vérminta eredményének átvételéhez, megkeresik, és felkérik az IMPROVE-IT-ben való részvételre. A felvétel előtt a betegeknek PET-CT vizsgálatot kell végezni, hogy megbizonyosodjanak arról, hogy nem hagyták figyelmen kívül a metasztázisokat.

Ha a 14. napi minta ctDNS-negatív, a betegeket tájékoztatják arról, hogy a relapszus kockázata alacsony, és a DCCG-irányelvek szerint felügyelet alatt állnak.

Tájékoztatjuk az adjuváns kemoterápiás javallattal rendelkező betegeket, hogy a 14. napi vérminta elemzési eredményeiről NEM kapnak tájékoztatást, mivel ez nem változtat a tervezett kezelési folyamaton. A betegeket arra kérik, hogy járuljanak hozzá a longitudinális vérmintavételhez és a ctDNS-elemzéshez (beleértve az IMPROVE PART II – FELÜGYELET-be), függetlenül attól, hogy kapnak-e adjuváns kemoterápiát vagy sem.

2.4 Molekuláris analízis 2.4.1 A keringő tumor DNS kimutatása és mennyiségi meghatározása A ctDNS kimutatását és mennyiségi meghatározását a közelmúltban kifejlesztett ultra-érzékeny célzott duplex szekvenálási módszerünkkel végezzük. Ezzel a megközelítéssel több mint 5000 egyedi DNS-molekulát fogunk szekvenálni minden plazmamintából. Ezáltal lehetséges a ~0,1%-os allélgyakoriságig terjedő szomatikus mutációk kimutatása. Továbbfejlesztett módszerünk több lépést is tartalmaz, amelyek célja a hibaarány csökkentése, beleértve az egyedi szál-specifikus molekuláris vonalkódok (UMI-k) használatát és az egyes cfDNS-fragmensek redundáns szekvenálását. Ezáltal meg tudjuk különböztetni a polimeráz által kiváltott hibákat a valódi mutációktól.

A szekvenálási megközelítés az emberi genom 3 milliárd bázisából kevesebb mint 100 000-et céloz meg. A panel az IntOGEN és TCGA adatbázisokban azonosított leggyakoribb és legfontosabb CRC illesztőprogram-mutációkat tartalmazza. Minden génhez több redundáns befogó próbát használnak a lefedettség javítása és a magasabb specifitás biztosítása érdekében. E régiók megcélzása elegendő annak biztosításához, hogy minden CRC-esetben legalább egy szomatikus mutációt azonosítsanak, és ezért lehetővé kell tenni a ctDNS-szint értékelését az összes érintett betegben. A panelben szereplő génrégiók a következők: TP53 exon 5-8 (1792 bázis), KRAS kodonok 12, 13, 61, 117 és 146 (738 bázis), SMAD2 kiválasztott gyakran mutáns régiók (463 bázis), SMAD4 kiválasztott gyakran mutáns régiók (513 bázis), FAM123B kiválasztott gyakran mutáns régiók (669 bázis), SOX9 kiválasztott gyakran mutáns régiók (693 bázis), APC kiválasztott gyakran mutáns régiók (5477 bázis), TCF7L2 kiválasztott gyakran mutáns régiók (920 bázis), NRAS kodonok 12, 13. és 61. (405 bázis), BRAF 600-as kodon és mások a közelben (200 bázis), FBXW7 kiválasztott gyakran mutáns régiók (868 bázis), PIK3CA 8 hotspot mutációk (905 bázis).

2.5 Klinikai információk gyűjtése A projekt központi része a (vérmintákból gyűjtött) ctDNS-értékelések összehasonlítása és korrelációja a kezelésre és kimenetelre vonatkozó klinikai információkkal. A kezeléssel és a kezelés kimenetelével kapcsolatos klinikai információkat a kórházi nyilvántartásokból és egészségügyi nyilvántartásokból gyűjtik össze.

2.6. A prediktorváltozók, a társváltozók és a végpontok meghatározásai 2.6.1. Elsődleges végpont

• Betegségmentes túlélés 3 éves korban (3 év-DFS) 2.6.2 Másodlagos végpontok
• Helyi és/vagy távoli kiújulás (patológiai, radiológiai vagy klinikai)
• Az ismétlődés ideje (TTR)
• Betegségmentes túlélés 1 éves korban (1 év-DFS)
• Teljes túlélés az 5. évben (5 éves életkor)
• Molekuláris reziduális betegség
• A molekuláris kiújulásig eltelt idő (TTMR) 2.6.3 Biztonsági végpont
• A nemkívánatos események (AE) gyakorisága és súlyossága a protokoll szerinti vérvételekhez viszonyítva.

2.6.4 A végpontok meghatározása

• A DFS a műtéttől a következő események bármelyikének első előfordulásáig eltelt idő; loko-regionális kiújulás, távoli áttétek vagy bármilyen okból bekövetkező halál.
• A kiújulásig eltelt időt a műtét időpontjától számítják a loko-regionális kiújulásig vagy a távoli metasztázisok megjelenéséig, vagy a vastagbélrák okozta halálozásig.
• A teljes túlélés a műtéttől a bármilyen okból bekövetkezett halálig eltelt idő.
• A molekuláris reziduális betegség a keringő tumor DNS (ctDNS) kimutatása egy vérmintában, amelyet röviddel a gyógyítólag tervezett kezelés befejezése után vettek (a műtét utáni 1. és 30. nap között, vagy az adjuváns befejezését követő 1. és 30. nap között). terápia).
• A molekuláris kiújulásig eltelt időt a kimutatható ctDNS első megjelenésétől számítjuk a kimutatható ctDNS-ig.

2.7 Statisztikai elemzés 2.7.1 A DFS, az OS, a TTR elemzése A Kaplan-Meier becslések a kiújulásig (klinikai és molekuláris), a betegséghez vagy a halálhoz vezető medián idők és ezek konfidenciaintervallumának becslésére szolgálnak, az UICC-stádium és/vagy réteg szerint. OP utáni ctDNS állapot. A végpontokat log-rank teszttel vagy Cox-regressziós modellel értékelik, válaszváltozóként az eseményig eltelt időt (klinikai vagy molekuláris kiújulás vagy halál), és a műtét utáni ctDNS vagy adjuváns terápia faktorként.