PROSAIC-19 – Prospektivní longitudinální hodnocení u kohorty infikované COVID-19 (PROSAIC-19)

ÚVOD

1.1 POZADÍ

Coronavirové onemocnění 2019 (COVID-19) způsobené infekcí SARS-CoV-2 je nové rychle se šířící infekční onemocnění bez prokázaných možností léčby. Virus způsobuje spektrum onemocnění od mírných koryzálních symptomů až po těžké respirační potíže vyžadující ventilační podporu. Pokyny od Public Health England identifikují několik skupin, které jsou ohroženy závažným onemocněním, včetně starších osob a jedinců s chronickým onemocněním plic. Kromě toho se také diskutuje o úloze kortikosteroidů s některými doporučeními nemocnic, které doporučují jejich použití, přestože pokyny WHO tomu odporují kvůli obavám, že mohou narušit antivirovou imunitu a zhoršit onemocnění. Mechanismy, které řídí závažnost onemocnění u některých jedinců infikovaných COVID-19, nejsou dostatečně pochopeny. Naléhavě potřebujeme porozumět těmto mechanismům, abychom usnadnili rychlý vývoj nových účinných terapií a vakcín

1. Imunosusceptibilita vůči těžkému onemocnění COVID-19

Existuje několik domnělých mechanismů, jejichž prostřednictvím by SARS-CoV-2 mohl způsobit větší závažnost onemocnění u predisponovaných jedinců. Tyto zahrnují:

1. Zhoršená vrozená antivirová imunitní reakce

   Po vstupu viru zahrnuje vrozená imunitní odpověď na respirační viry indukci interferonů typu I a III (IFN). To iniciuje kaskádu, která spouští expresi řady interferonem stimulovaných genů exprimujících proteiny, které působí ve shodě a omezují replikaci viru. Chronická plicní onemocnění, zejména astma, cystická fibróza (CF) a CHOPN jsou spojeny se zhoršenou nebo dysregulovanou indukcí interferonu běžně se vyskytujícími viry, jako je rhinoviry a chřipka, a podobná dysregulace se může vyskytnout u SARS-CoV-2. Inhalační interferon-β je v současné době ve studiích jako antivirová léčba astmatu a CHOPN.

2. Přehnané zánětlivé reakce na virovou infekci

   Běžné respirační virové infekce, jako je chřipka a respirační syncyciální virus (RSV), mohou podporovat virovou patologii zprostředkovanou protilátkami a odpověďmi T buněk. Časné důkazy naznačují, že závažné onemocnění COVID-19 je spojeno s hyperzánětem, což je vlastnost, která by mohla být přímo způsobena virovou zátěží nebo k níž může dojít v důsledku nezávislé hyperaktivace imunitního systému. Lidské koronavirové infekce včetně SARS-CoV mohou indukovat imunopatologii v plicích prostřednictvím řady různých mechanismů, včetně zesílení protilátky proti SARS-CoV infekci lidskými makrofágy. Významné zvýšení prozánětlivých cytokinů exprimujících CD4 a CD8 bylo prokázáno u závažného onemocnění SARS-CoV ve srovnání s mírným/středním onemocněním.

   V souladu s tím existuje značný zájem o potenciální roli přepracování stávajících imunosupresivních terapií pro léčbu těžkého onemocnění COVID-19. Klíčové mediátory a cesty, které řídí hyperzánět u COVID-19, jsou nejasné a větší objasnění těchto procesů bude podkladem pro nové použití stávajících terapií nebo vývoj nových přístupů k účinné léčbě. Důsledek výchozích dysregulovaných T buněčných odpovědí, jako jsou ty pozorované u chronického onemocnění plic (např. astma, CHOPN, cystická fibróza) je opět nejasná a vyžaduje další porozumění mechanismu. Dosud tedy není jasné, zda imunosupresivní terapie, které jsou v současnosti v klinických studiích, budou prospěšné nebo škodlivé u těchto velkých kohort citlivých pacientů.

3. Dysregulovaná endoteliální funkce závislá na interferonu vůči COVID-19

   Syndrom akutní respirační tísně (ARDS) je charakterizován hydrostatickým plicním edémem, zvýšenou plicní vaskulární rezistencí a koagulopatií, dochází k narušení endoteliální funkce s dysregulovaným uvolňováním endoteliálně odvozených vazoaktivních hormonů. Cirkulující hladiny endotelinu-1 jsou zvýšeny u pacientů s ARDS[16], pravděpodobně v důsledku zvýšené produkce a snížené clearance v plicích, které jsou potenciálně regulovány Angiopoetinem-1.

   Závažná infekce SARS-CoV-2 je spojena s cytokinovou bouří. Zvýšené sérové ​​hladiny řady klíčových zánětlivých cytokinů včetně IFN-gama, TNF-alfa, IP10, IL-8 a IL-10 a zvýšené hladiny IL-6 jsou silně spojeny s mortalitou. Uvolňování IL-6 je synergicky indukováno IFN-gama a TNF-alfa a v mechanismu pozitivní zpětné vazby nízká dávka IL-6 silně zvyšuje buněčné odpovědi na IFN-alfa a moduluje interferonem stimulovanou genovou expresi. V experimentálním myším modelu jsme zjistili, že infekce rinovirem s kostimulací IFN vede ke zvýšeným hladinám IL-6 v bronchoalveolární laváži (Singanayagam et al, nepublikovaná pozorování). Tyto údaje naznačují, že u pacientů s těžkou formou COVID-19 následuje hyperzánětlivý proces a my předpokládáme, že prostřednictvím dysregulované a nekontrolované produkce IFN, klíčové vaskulozánětlivé geny stimulované interferonem, včetně IP10 a ET-1, vedou k horším výsledkům se zvýšenou parenchymální a plicní vaskulární zánět. To vede k dichotomii, kdy je nutná počáteční indukce IFN k omezení replikace viru, ale pozdní nekontrolovaná produkce může zhoršit patofyziologii. To je podpořeno novými klinickými údaji, které naznačují jedinečný fenotyp pro pacienty s kritickou péčí SARS-CoV-2 charakterizovaný závažnou hypoxií s téměř normální plicní poddajností.

4. Změněná exprese virového vstupního receptoru: Nedávné údaje naznačují, že SARS-CoV-2 využívá angiotensin-konvertující enzym (ACE)2 jako receptor pro připojení viru a také proteázu TMPRSS2, která štěpí spike(S) protein, aby umožnila fúzi viru s buněčnou membrány. ACE2 a TMPRSS2 jsou často koexprimovány v plicním epitelu. Nedávná studie také ukázala, že ACE2 je interferonem stimulovaný gen (ISG) (tj. přímo indukované antivirovou odpovědí), a proto SARS-CoV-2 může upregulovat svůj vlastní receptor, aby propagoval infekci. Nedávné údaje naznačují, že kuřáci a subjekty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN) mají zvýšenou expresi ACE2 v plicích, což naznačuje, že chronické plicní onemocnění může usnadnit větší infekci SARS-CoV-2. Naopak exprese ACE2 chrání před akutním poškozením plic v souvislosti s aspirací kyseliny nebo sepsí, a proto, pokud je indukce ACE2 SARS-CoV narušena u chronického plicního onemocnění, mohlo by to mít predispozici k nepříznivému výsledku.
5. Zvýšené sekundární bakteriální a/nebo plísňové infekce

V časných sériích případů byly sekundární infekce pozorovány častěji u subjektů se závažným onemocněním COVID-19. Sekundární bakteriální infekce je dobře známým fenoménem po rhinoviru, chřipce nebo respiračním syncytiálním viru a může být mechanicky řízena řadou možných mechanismů včetně fagocytózy makrofágů nebo štěpení antimikrobiálních peptidů zprostředkované neutrofilní elastázou. Tyto procesy mohou být zhoršeny užíváním kortikosteroidů28 a zejména větší části pacientů se sekundární infekcí po COVID-19 byly předepsány steroidy.

Invazivní plísňové onemocnění odpovídající aspergilóze bylo také pozorováno u koronaviru těžkého akutního respiračního syndromu (SARS-CoV-2003) a koronaviru blízkovýchodního respiračního syndromu (MERS-CoV) a neoficiálních zpráv o posmrtných zprávách u pacientů s COVID-19 z Čína naznačuje, že se vyskytují plicní infekce Aspergillus. Tyto údaje jsou časnými varovnými signály, že sekundární invazivní plísňové infekce mohou představovat stále závažnější komplikaci u pacientů postižených COVID-19, jak pandemie postupuje. Pochopení mechanistického základu pro imunitní náchylnost k sekundární bakteriální/houbové infekci a schopnost předcházet těmto sekundárním infekcím by mohlo být klíčovým krokem ke zlepšení výsledků onemocnění.

1.2 ODŮVODNĚNÍ AKTUÁLNÍ STUDIE

V této studii budou vyšetřovatelé analyzovat vzorky krve a dýchacích cest od jedinců s potvrzeným COVID-19, aby pochopili imunitní mechanismy, které vedou k závažnému onemocnění. Objasníme specifické mechanismy, které řídí závažnější patologii u osob s vyšším rizikem, jako jsou pacienti s chronickým onemocněním plic. Prostřednictvím podrobného imunoprofilování identifikujeme klíčové cesty a cíle, které lze podat léky, které lze využít v budoucích klinických intervenčních studiích.

hypotézy:

1. Vysoce rizikoví jedinci, včetně jedinců s chronickým onemocněním plic, mají narušenou antivirovou imunitní odpověď na SARS-CoV-2, což zvyšuje zánět způsobený virem.
2. Endoteliální dysfunkce závislá na interferonu řídí patogenitu infekce SARS-CoV-2.
3. Vnímavost k sekundární bakteriální a plísňové infekci u chronického plicního onemocnění souvisí se selektivními defekty v přirozené imunitní funkci.

2. STUDIJNÍ CÍLE

Primární cíl:

1. Porozumět imunitním mechanismům, které řídí onemocnění COVID-19 u pacientů s onemocněním plic v anamnéze

Sekundární cíle

1. Identifikujte imunitní koreláty ochrany a plicní patologie u infekce SARS-CoV-2.
2. Analýza funkce endotelu u pacientů s mírným a závažným onemocněním COVID-19 a ex vivo pomocí virem stimulovaných endoteliálních buněk získaných z krve od pacientů s COVID-19.
3. Hodnocení změn mikrobioty a mykobioty horních/dolních dýchacích cest, ke kterým dochází během COVID-19.
4. Hodnocení ex vivo imunitních odpovědí periferní krve na virové, bakteriální a plísňové podněty u pacientů s COVID-19 a chronickým plicním onemocněním ve srovnání s pacienty s COVID-19 a bez chronického plicního onemocnění.
5. Analýza dopadu infekce COVID-19 na kvalitu života u chronického onemocnění plic.

3. DESIGN STUDIA

Prostřednictvím 24měsíční prospektivní longitudinální multicentrické observační studie (Royal Brompton & Harefield NHS Trust Chelsea a Westminster NHS Foundation Trust a Imperial College Healthcare NHS Trusts) bude studijní tým analyzovat odběr krve, sputa a nosu spolu s neinvazivním testováním zařízení EndoPAT v celkem pf 230 subjektů. Studijní tým získá vzorky periferní krve, sputa, nosní laváže, kartáčků a nosní syntetické absorpční matrice (SAM) a provede neinvazivní testování EndoPAT v den hospitalizace a v týdenních intervalech během hospitalizace a poté během ambulantních návštěv po propuštění po dobu 12 měsíců sledování. Studijní tým bude shromažďovat klinické informace včetně demografických údajů, rutinních laboratorních vyšetření, skóre klinických příznaků a výsledků. Propojená pseudoanonymizovaná radiologická zobrazení budou také převedena k analýze.

Spontánně expektorované sputum, nosní výplach, kartáčky a nosní syntetická absorpční matrice (SAM) budou odebrány a zpracovány, jak bylo popsáno dříve, a uloženy při -80 °C pro následné analýzy včetně ELISA/MSD, měření virové zátěže a mikrobiomové analýzy. Venózní krev (60 ml) bude odebrána do zkumavek Lithium Heparin a PAXgene RNA a přenesena do Imperial College (RBH) ke zpracování a skladování. PBMC budou extrahovány pro in vitro stimulační testy a plná krev (1 ml) a sérum (2 ml) budou izolovány a skladovány při -80 °C pro další analýzu. Zkumavky PAXgene budou skladovány při -80 °C pro další analýzu genetického sekvenování hostitele. Další imunologická analýza využívající zobrazení povrchu kvasinek pro profilování sérových protilátek, třídění jednotlivých B buněk pro vytvoření monoklonálních protilátek a ELISPOT pro analýzu CD4 a CD8 T buněk ELISPOT na pooly peptidů SARS CoV-2. Dále bude provedeno hluboké imunologické profilování pomocí cytokinové analýzy, cytokinové odpovědi PBMC na virové (nebo virového agonisty PRR), plísňové stimuly, zobrazení povrchu kvasinek pro profilování sérových protilátek, expresní klonování jedné paměťové B buňky. CD4 a CD8 T buněčný ELISPOT bude proveden tak, jak bylo popsáno dříve. Bude také provedeno neinvazivní testování EndoPAT, jak bylo popsáno dříve.