PROSAIC-19 - Valutazione longitudinale prospettica in una coorte infetta da COVID-19 (PROSAIC-19)

INTRODUZIONE

1.1 PREMESSA

La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dall'infezione da SARS-CoV-2 è una nuova malattia infettiva a rapida diffusione senza opzioni terapeutiche comprovate. Il virus causa uno spettro di malattie che vanno da lievi sintomi corizzali a gravi compromissioni respiratorie che richiedono supporto ventilatorio. La guida di Public Health England identifica diversi gruppi che sono a rischio di malattie gravi, inclusi gli anziani e le persone con malattie polmonari croniche. Inoltre, c'è anche un dibattito sul ruolo dei corticosteroidi con alcune linee guida ospedaliere che ne raccomandano l'uso nonostante le linee guida dell'OMS lo contraddicano a causa delle preoccupazioni che possano compromettere l'immunità antivirale e peggiorare la malattia. I meccanismi che guidano la gravità della malattia in alcuni individui infetti da COVID-19 sono poco conosciuti. Abbiamo urgente bisogno di comprendere questi meccanismi per facilitare il rapido sviluppo di nuove terapie e vaccini efficaci

1. Immunosuscettibilità alla grave malattia da COVID-19

Esistono diversi meccanismi presunti attraverso i quali SARS-CoV-2 potrebbe determinare una maggiore gravità della malattia in individui predisposti. Questi includono:

1. Risposte immunitarie antivirali innate compromesse

   Dopo l'ingresso virale, la risposta immunitaria innata ai virus respiratori comporta l'induzione degli interferoni di tipo I e III (IFN). Ciò avvia una cascata che innesca l'espressione di una serie di geni stimolati dall'interferone che esprimono proteine ​​che agiscono di concerto per limitare la replicazione virale. Le malattie polmonari croniche, in particolare l'asma, la fibrosi cistica (FC) e la BPCO sono associate a un'induzione compromessa o disregolata dell'interferone a virus comunemente riscontrati come il rinovirus e l'influenza e una disregolazione simile può verificarsi con SARS-CoV-2. L'interferone beta per via inalatoria è attualmente in sperimentazione come terapia antivirale per l'asma e la BPCO.

2. Risposte infiammatorie esagerate all'infezione virale

   Le comuni infezioni virali respiratorie come l'influenza e il virus respiratorio sinciziale (RSV) possono promuovere la patologia virale mediata da anticorpi e risposte delle cellule T. Le prime prove suggeriscono che la grave malattia da COVID-19 è associata all'iperinfiammazione, una caratteristica che potrebbe essere guidata direttamente dal carico virale o verificarsi a causa dell'iperattivazione indipendente del sistema immunitario. Le infezioni da coronavirus umano, incluso SARS-CoV, possono indurre immunopatologia nei polmoni attraverso una serie di meccanismi diversi, incluso il potenziamento anticorpale dell'infezione da SARS-CoV da parte dei macrofagi umani. Aumenti significativi delle citochine pro-infiammatorie che esprimono CD4 e CD8 sono stati dimostrati nella malattia grave da SARS-CoV rispetto alla malattia lieve/moderata.

   Di conseguenza, c'è stato un notevole interesse per un ruolo potenziale nel riproporre le terapie immunosoppressive esistenti per il trattamento del COVID-19 grave. I mediatori e i percorsi chiave che guidano l'iperinfiammazione in COVID-19 non sono chiari e una maggiore delucidazione di questi processi informerà il riutilizzo delle terapie esistenti o lo sviluppo di nuovi approcci per un trattamento efficace. L'implicazione delle risposte delle cellule T disregolate al basale come quelle osservate nella malattia polmonare cronica (ad es. asma, BPCO, fibrosi cistica) è di nuovo poco chiaro e richiede un'ulteriore comprensione meccanicistica. Pertanto, non è ancora chiaro se le terapie immunosoppressive attualmente in fase di sperimentazione clinica saranno benefiche o dannose in queste ampie coorti di pazienti suscettibili.

3. Funzione endoteliale interferone-dipendente disregolata a COVID-19

   La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è caratterizzata da edema polmonare idrostatico, elevata resistenza vascolare polmonare e coagulopatia, vi è interruzione della funzione endoteliale con rilascio disregolato degli ormoni vasoattivi di derivazione endoteliale. I livelli circolanti di endotelina-1 sono aumentati nei pazienti con ARDS[16], probabilmente a causa dell'aumento della produzione e della ridotta clearance nei polmoni potenzialmente regolati dall'angiopoietina-1.

   L'infezione grave da SARS-CoV-2 è associata alla tempesta di citochine. Livelli sierici aumentati di una serie di citochine infiammatorie chiave tra cui IFN-gamma, TNF-alfa, IP10, IL-8 e IL-10 e livelli elevati di IL-6 sono fortemente associati alla mortalità. Il rilascio di IL-6 è sinergicamente indotto da IFN-gamma e TNF-alfa e in un meccanismo di feedback positivo, una bassa dose di IL-6 migliora fortemente le risposte cellulari all'IFN-alfa e modula l'espressione genica stimolata dall'interferone. In un modello murino sperimentale, abbiamo scoperto che l'infezione da rinovirus con co-stimolazione di IFN porta a livelli elevati di lavaggio broncoalveolare di IL-6 (Singanayagam et al, osservazioni non pubblicate). Questi dati suggeriscono che nei pazienti con COVID-19 grave, ne consegue un processo iperinfiammatorio e ipotizziamo che attraverso la produzione di IFN disregolata e non controllata, i geni chiave vasculo-infiammatori stimolati dall'interferone, inclusi IP10 ed ET-1, determinino esiti peggiori con aumento della vascolarizzazione parenchimale e polmonare infiammazione. Ciò si traduce in una dicotomia per cui è necessaria l'induzione iniziale di IFN per limitare la replicazione virale, ma la produzione tardiva e incontrollata può peggiorare la fisiopatologia. Ciò è supportato da dati clinici emergenti che suggeriscono un fenotipo unico per i pazienti in terapia intensiva SARS-CoV-2 caratterizzati da grave ipossia con compliance polmonare quasi normale.

4. Espressione alterata del recettore dell'ingresso virale: dati recenti indicano che SARS-CoV-2 utilizza l'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE) 2 come recettore per l'attaccamento virale e anche la proteasi TMPRSS2 che scinde la proteina spike (S) per consentire la fusione del virus con il cellulare membrane. ACE2 e TMPRSS2 sono spesso co-espressi nell'epitelio polmonare. Uno studio recente ha anche dimostrato che ACE2 è un gene stimolato dall'interferone (ISG) (cioè direttamente indotta dalla risposta antivirale) e quindi SARS-CoV-2 potrebbe sovraregolare il proprio recettore per propagare l'infezione. Dati recenti indicano che i fumatori e i soggetti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) hanno una maggiore espressione di ACE2 polmonare, suggerendo che la malattia polmonare cronica potrebbe facilitare una maggiore infezione da SARS-CoV-2. Al contrario, l'espressione di ACE2 protegge dal danno polmonare acuto nel contesto dell'aspirazione acida o della sepsi e quindi, se l'induzione di ACE2 da parte di SARS-CoV è compromessa nella malattia polmonare cronica, ciò potrebbe predisporre a esiti avversi.
5. Aumento delle infezioni batteriche e/o fungine secondarie

Nelle prime serie di casi, le infezioni secondarie sono state osservate più frequentemente nei soggetti con grave malattia da COVID-19. L'infezione batterica secondaria è un fenomeno ben noto che segue il rinovirus, l'influenza o il virus respiratorio sinciziale e può essere guidato meccanicamente da una serie di possibili meccanismi tra cui la fagocitosi dei macrofagi o la scissione mediata dall'elastasi dei neutrofili di peptidi antimicrobici. Questi processi possono essere peggiorati dall'uso di corticosteroidi28 e, in particolare, a una percentuale maggiore di pazienti con infezioni secondarie a seguito di COVID-19 erano stati prescritti steroidi.

È stata osservata anche una malattia fungina invasiva coerente con l'aspergillosi sia per il coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2003) che per il coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) e segnalazioni aneddotiche di autopsie in pazienti con COVID-19 da La Cina suggerisce che si verificano infezioni polmonari da Aspergillus. Questi dati sono segnali premonitori che le infezioni fungine invasive secondarie possono presentare una complicanza sempre più grave nei pazienti affetti da COVID-19 con il progredire della pandemia. Comprendere le basi meccanicistiche della suscettibilità immunitaria alle infezioni batteriche/fungine secondarie e la capacità di prevenire queste infezioni secondarie potrebbe essere un passo fondamentale verso il miglioramento degli esiti della malattia.

1.2 RAZIONALE DELLO STUDIO ATTUALE

In questo studio, i ricercatori analizzeranno campioni di sangue e delle vie aeree di individui con COVID-19 confermato per comprendere i meccanismi immunitari che portano a malattie gravi. Chiariremo i meccanismi specifici che guidano la patologia più grave negli individui a rischio più elevato come quelli con malattie polmonari croniche. Attraverso un immunoprofilo dettagliato, identificheremo percorsi chiave e bersagli farmacologici da sfruttare in futuri studi di intervento clinico.

Ipotesi:

1. Gli individui ad alto rischio, compresi gli individui con malattie polmonari croniche, hanno una risposta immunitaria antivirale ridotta al SARS-CoV-2, aumentando l'infiammazione indotta dal virus.
2. La disfunzione endoteliale dipendente dall'interferone determina la patogenicità nell'infezione da SARS-CoV-2.
3. La suscettibilità alle infezioni batteriche e fungine secondarie nella malattia polmonare cronica è correlata a difetti del percorso selettivo nella funzione immunitaria innata.

2. OBIETTIVI DI STUDIO

Obiettivo primario:

1. Comprendere i meccanismi immunitari che guidano la malattia da COVID-19 nei pazienti con una storia di malattia polmonare

Obiettivi secondari

1. Identificare i correlati immunitari di protezione e patologia polmonare nell'infezione da SARS-CoV-2.
2. Analisi della funzione endoteliale in pazienti COVID-19 lievi e gravi ed ex vivo utilizzando cellule endoteliali derivate dal sangue stimolate da virus da pazienti con COVID-19.
3. Valutazione dei cambiamenti nel microbiota e nel micobiota delle vie aeree superiori/inferiori che si verificano durante COVID-19.
4. Valutazione delle risposte immunitarie del sangue periferico ex vivo a stimoli virali, batterici e fungini in pazienti con COVID-19 e malattia polmonare cronica rispetto a pazienti con COVID-19 e nessuna malattia polmonare cronica.
5. Analisi dell'impatto sulla qualità della vita dell'infezione da COVID-19 nella malattia polmonare cronica.

3. PROGETTAZIONE DI STUDIO

Attraverso uno studio osservazionale multicentrico prospettico longitudinale di 24 mesi (Royal Brompton & Harefield NHS Trust Chelsea e Westminster NHS Foundation Trust e Imperial College Healthcare NHS Trusts), il team di studio analizzerà sangue, espettorato e campionamento nasale insieme a test del dispositivo EndoPAT non invasivi in un totale pf 230 soggetti. Il team dello studio otterrà campioni di sangue periferico, espettorato, lavaggio nasale, spazzole e matrice assorbente sintetica nasale (SAM) ed eseguirà test EndoPAT non invasivi il giorno della presentazione in ospedale e a intervalli settimanali durante l'ambiente ospedaliero e quindi durante le visite ambulatoriali post- dimissione in un periodo di follow-up di 12 mesi. Il team dello studio raccoglierà informazioni cliniche tra cui dati demografici, indagini di laboratorio di routine, punteggi dei sintomi clinici e risultati. Anche l'imaging radiologico pseudoanonimizzato collegato sarà trasferito per l'analisi.

Campioni di espettorato spontaneo, lavaggio nasale, spazzolamento e matrice assorbente sintetica nasale (SAM) saranno prelevati e processati come descritto in precedenza e conservati a -80°C per analisi a valle tra cui ELISA/MSD, misurazione della carica virale e analisi del microbioma. Il sangue venoso (60 ml) verrà prelevato in tubi di eparina di litio e tubi di PAXgene RNA e trasferito all'Imperial College (RBH) per l'elaborazione e la conservazione. Le PBMC saranno estratte per saggi di stimolazione in vitro e sangue intero (1 ml) e siero (2 ml) isolati e conservati a -80°C per ulteriori analisi. Le provette PAXgene saranno conservate a -80°C per ulteriori analisi di sequenziamento genetico dell'ospite. Ulteriori analisi immunologiche utilizzando la visualizzazione della superficie del lievito per la profilazione degli anticorpi sierici, l'ordinamento di singole cellule B per generare anticorpi monoclonali ed ELISPOT per analizzare l'ELISPOT delle cellule T CD4 e CD8 nei pool di peptidi SARS CoV-2. Ulteriori profili immunologici approfonditi mediante analisi delle citochine, risposta delle citochine PBMC a stimoli virali (o PRR virali), stimoli fungini, visualizzazione della superficie del lievito per la profilazione degli anticorpi sierici, clonazione dell'espressione di cellule B a memoria singola. L'ELISPOT delle cellule T CD4 e CD8 sarà eseguito come precedentemente descritto. Verranno eseguiti anche test EndoPAT non invasivi come descritto in precedenza.