PROSAIC-19 - Проспективная лонгитюдная оценка когорты инфицированных COVID-19 (PROSAIC-19)

ВСТУПЛЕНИЕ

1.1 ПРЕДПОСЫЛКИ

Коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19), вызванная инфекцией SARS-CoV-2, представляет собой новое быстро распространяющееся инфекционное заболевание, для которого нет проверенных вариантов лечения. Вирус вызывает широкий спектр заболеваний, начиная от легких симптомов насморка и заканчивая тяжелой респираторной недостаточностью, требующей искусственной вентиляции легких. В руководстве Public Health England определены несколько групп, подверженных риску тяжелого течения заболевания, включая пожилых людей и лиц с хроническими заболеваниями легких. Кроме того, также ведутся споры о роли кортикостероидов, и некоторые руководства для больниц рекомендуют их использование, несмотря на то, что руководство ВОЗ противоречит этому из-за опасений, что они могут ослабить противовирусный иммунитет и ухудшить течение заболевания. Механизмы, определяющие тяжесть заболевания у некоторых людей, инфицированных COVID-19, плохо изучены. Нам срочно необходимо понять эти механизмы, чтобы способствовать быстрой разработке новых эффективных методов лечения и вакцин.

1. Иммуночувствительность к тяжелому заболеванию COVID-19

Существует несколько предполагаемых механизмов, с помощью которых SARS-CoV-2 может повышать тяжесть заболевания у предрасположенных к нему людей. К ним относятся:

1. Нарушение врожденного противовирусного иммунного ответа

   После проникновения вируса врожденный иммунный ответ на респираторные вирусы включает индукцию интерферонов I и III типов (IFN). Это инициирует каскад, запускающий экспрессию ряда интерферон-стимулируемых генов, экспрессирующих белки, которые совместно действуют, ограничивая репликацию вируса. Хронические заболевания легких, особенно астма, кистозный фиброз (МВ) и ХОБЛ, связаны с нарушением или нарушением регуляции индукции интерферона в часто встречающиеся вирусы, такие как риновирус и грипп, и подобное нарушение регуляции может наблюдаться при SARS-CoV-2. Ингаляционный интерферон-β в настоящее время проходит испытания в качестве противовирусной терапии при астме и ХОБЛ.

2. Преувеличенные воспалительные реакции на вирусную инфекцию

   Распространенные респираторные вирусные инфекции, такие как грипп и респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), могут способствовать развитию вирусной патологии, опосредованной антителами и ответами Т-клеток. Ранние данные свидетельствуют о том, что тяжелое заболевание COVID-19 связано с гипервоспалением, особенностью, которая может быть непосредственно вызвана вирусной нагрузкой или возникать из-за независимой гиперактивации иммунной системы. Коронавирусные инфекции человека, включая SARS-CoV, могут вызывать иммунопатологию в легких с помощью ряда различных механизмов, включая усиление антителами инфекции SARS-CoV человеческими макрофагами. Значительное увеличение количества CD4 и CD8, экспрессирующих провоспалительные цитокины, было показано при тяжелом течении SARS-CoV по сравнению с заболеванием легкой/умеренной степени тяжести.

   Соответственно, существует значительный интерес к потенциальной роли перепрофилирования существующих иммуносупрессивных методов лечения для лечения тяжелой формы COVID-19. Ключевые медиаторы и пути, которые вызывают гипервоспаление при COVID-19, неясны, и более полное выяснение этих процессов будет способствовать перепрофилированию существующих методов лечения или разработке новых подходов к эффективному лечению. Значение исходных нерегулируемых ответов Т-клеток, таких как наблюдаемые при хронических заболеваниях легких (например, астма, ХОБЛ, кистозный фиброз) снова неясен и требует дальнейшего понимания механизма. Таким образом, пока неясно, будет ли иммуносупрессивная терапия, проходящая в настоящее время клинические испытания, полезной или вредной для этих больших когорт восприимчивых пациентов.

3. Нарушение регуляции интерферонзависимой эндотелиальной функции при COVID-19

   Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) характеризуется гидростатическим отеком легких, повышенным сопротивлением легочных сосудов и коагулопатией, нарушением функции эндотелия с нарушением регуляции высвобождения вазоактивных гормонов эндотелиального происхождения. Циркулирующие уровни эндотелина-1 повышены у пациентов с ОРДС [16], вероятно, из-за увеличения продукции и снижения клиренса в легких, потенциально регулируемых ангиопоэтином-1.

   Тяжелая инфекция SARS-CoV-2 связана с цитокиновым штормом. Повышенные уровни в сыворотке ряда ключевых воспалительных цитокинов, включая IFN-гамма, TNF-альфа, IP10, IL-8 и IL-10, а также повышенные уровни IL-6 тесно связаны со смертностью. Высвобождение IL-6 синергетически индуцируется IFN-гамма и TNF-альфа, и в механизме положительной обратной связи низкая доза IL-6 сильно усиливает клеточный ответ на IFN-альфа и модулирует экспрессию генов, стимулируемую интерфероном. В экспериментальной мышиной модели мы обнаружили, что заражение риновирусом с костимуляцией IFN приводит к повышенным уровням IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже (Singanayagam et al., неопубликованные наблюдения). Эти данные свидетельствуют о том, что у пациентов с тяжелым течением COVID-19 возникает гипервоспалительный процесс, и мы предполагаем, что из-за нерегулируемой и неконтролируемой продукции IFN ключевые гены, стимулирующие васкуловоспалительный интерферон, включая IP10 и ET-1, приводят к худшим результатам с усилением паренхиматозных и легочных сосудов. воспаление. Это приводит к дихотомии, при которой первоначальная индукция IFN необходима для ограничения репликации вируса, а поздняя неконтролируемая продукция может ухудшить патофизиологию. Это подтверждается новыми клиническими данными, свидетельствующими об уникальном фенотипе пациентов с SARS-CoV-2 в интенсивной терапии, характеризующихся тяжелой гипоксией с почти нормальной растяжимостью легких.

4. Измененная экспрессия рецептора входа вируса: последние данные показывают, что SARS-CoV-2 использует ангиотензинпревращающий фермент (ACE)2 в качестве рецептора для прикрепления вируса, а также протеазу TMPRSS2, которая расщепляет белок шипа (S), чтобы обеспечить слияние вируса с клеточным мембраны. ACE2 и TMPRSS2 часто коэкспрессируются в легочном эпителии. Недавнее исследование также показало, что ACE2 является геном, стимулируемым интерфероном (ISG) (т.е. непосредственно индуцируется противовирусным ответом), и, следовательно, SARS-CoV-2 может активировать свой собственный рецептор для распространения инфекции. Недавние данные показывают, что курильщики и люди с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) имеют повышенную легочную экспрессию ACE2, что позволяет предположить, что хроническое заболевание легких может способствовать большему заражению SARS-CoV-2. И наоборот, экспрессия ACE2 защищает от острого повреждения легких в контексте кислотной аспирации или сепсиса, и поэтому, если индукция ACE2 SARS-CoV нарушена при хроническом заболевании легких, это может предрасполагать к неблагоприятному исходу.
5. Увеличение вторичной бактериальной и/или грибковой инфекции

В ранних сериях случаев вторичные инфекции чаще наблюдались у субъектов с тяжелым течением COVID-19. Вторичная бактериальная инфекция является хорошо известным явлением после риновируса, гриппа или респираторно-синцитиального вируса и может быть механически обусловлена ​​рядом возможных механизмов, включая фагоцитоз макрофагов или опосредованное нейтрофильной эластазой расщепление антимикробных пептидов. Эти процессы могут усугубляться при использовании кортикостероидов28, и, что примечательно, большей части пациентов с вторичными инфекциями после COVID-19 были назначены стероиды.

Инвазивное грибковое заболевание, соответствующее аспергиллезу, также наблюдалось как при коронавирусе тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2003), так и при коронавирусе ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), а также в отдельных сообщениях о вскрытиях пациентов с COVID-19 от Китай предполагает, что возникают легочные инфекции Aspergillus. Эти данные являются ранним предупреждением о том, что вторичные инвазивные грибковые инфекции могут вызывать все более серьезные осложнения у пациентов с COVID-19 по мере развития пандемии. Понимание механистической основы иммунной восприимчивости к вторичным бактериальным/грибковым инфекциям и способность предотвращать эти вторичные инфекции могут стать ключевым шагом на пути к улучшению результатов заболевания.

1.2 ОБОСНОВАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

В этом исследовании исследователи проанализируют образцы крови и дыхательных путей от людей с подтвержденным COVID-19, чтобы понять иммунные механизмы, которые приводят к тяжелому заболеванию. Мы выясним конкретные механизмы, которые вызывают более тяжелую патологию у людей с более высоким риском, таких как люди с хроническим заболеванием легких. С помощью подробного иммунопрофилирования мы определим ключевые пути и мишени для лекарств, которые можно будет использовать в будущих исследованиях клинических вмешательств.

Гипотезы:

1. У лиц с высоким риском, в том числе с хроническими заболеваниями легких, нарушен противовирусный иммунный ответ на SARS-CoV-2, что усиливает вызванное вирусом воспаление.
2. Интерферонзависимая эндотелиальная дисфункция определяет патогенность инфекции SARS-CoV-2.
3. Восприимчивость к вторичной бактериальной и грибковой инфекции при хроническом заболевании легких связана с дефектами селективного пути врожденной иммунной функции.

2. ЦЕЛИ ИЗУЧЕНИЯ

Основная цель:

1. Понять иммунные механизмы, вызывающие заболевание COVID-19 у пациентов с заболеваниями легких в анамнезе.

Второстепенные цели

1. Выявить иммунные корреляты защиты и патологии легких при инфекции SARS-CoV-2.
2. Анализ эндотелиальной функции у пациентов с легкой и тяжелой формой COVID-19 и ex vivo с использованием стимулированных вирусом эндотелиальных клеток, полученных из крови пациентов с COVID-19.
3. Оценка изменений микробиоты и микобиоты верхних/нижних дыхательных путей, происходящих во время COVID-19.
4. Оценка ex vivo иммунных ответов периферической крови на вирусные, бактериальные и грибковые стимулы у пациентов с COVID-19 и хроническим заболеванием легких по сравнению с пациентами с COVID-19 и без хронического заболевания легких.
5. Анализ влияния инфекции COVID-19 на качество жизни при хроническом заболевании легких.

3. ДИЗАЙН ИЗУЧЕНИЯ

В ходе 24-месячного проспективного многоцентрового обсервационного исследования (Royal Brompton & Harefield NHS Trust Chelsea and Westminster NHS Foundation Trust и Imperial College Healthcare NHS Trusts) исследовательская группа проанализирует кровь, мокроту и образцы из носа наряду с неинвазивным тестированием устройства EndoPAT в всего 230 предметов. Исследовательская группа получит образцы периферической крови, мокроты, назального смыва, смывов и образцов синтетической абсорбирующей матрицы (SAM) из носа и проведет неинвазивное тестирование EndoPAT в день госпитализации и с недельными интервалами во время стационарного лечения, а затем во время амбулаторных посещений после госпитализации. выписки в течение 12 месяцев наблюдения. Исследовательская группа будет собирать клиническую информацию, включая демографические данные, рутинные лабораторные исследования, оценку клинических симптомов и исходы. Связанные псевдоанонимизированные радиологические изображения также будут переданы для анализа.

Образцы спонтанно отхаркиваемой мокроты, промывания носа, щеток и носовой синтетической абсорбирующей матрицы (SAM) будут взяты и обработаны, как описано ранее, и сохранены при -80°C для последующих анализов, включая ИФА/МСД, измерение вирусной нагрузки и анализ микробиома. Венозная кровь (60 мл) будет взята в пробирки с литий-гепарином и пробирки с РНК PAXgene и передана в Имперский колледж (RBH) для обработки и хранения. PBMC будут извлечены для анализов стимуляции in vitro, а цельная кровь (1 мл) и сыворотка (2 мл) будут выделены и сохранены при -80oC для дальнейшего анализа. Пробирки PAXgene будут храниться при температуре -80°C для дальнейшего генетического секвенирования хозяина. Дальнейший иммунологический анализ с использованием дисплея поверхности дрожжей для определения профиля антител в сыворотке, сортировки отдельных В-клеток для получения моноклональных антител и ELISPOT для анализа ELISPOT CD4 и CD8 T-клеток на пулы пептидов SARS CoV-2. Будет проведено дальнейшее глубокое иммунологическое профилирование с использованием анализа цитокинов, цитокинового ответа РВМС на вирусы (или вирусные агонисты PRR), грибковые стимулы, отображение поверхности дрожжей для профилирования сывороточных антител, клонирование экспрессии единичных В-клеток памяти. ELISPOT для CD4 и CD8 Т-клеток будет выполняться, как описано ранее. Неинвазивное тестирование EndoPAT также будет проводиться, как описано ранее.