PROSAIC-19 – Prospektiv longitudinell bedömning i en cohort-infekterad kohort (PROSAIC-19)

INTRODUKTION

1.1 BAKGRUND

Coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19) orsakad av SARS-CoV-2-infektion är en ny snabbt spridande infektionssjukdom utan bevisade behandlingsalternativ. Viruset orsakar ett spektrum av sjukdomar som sträcker sig från lindriga koryzala symtom till allvarliga andningsproblem som kräver andningsstöd. Vägledning från Public Health England identifierar flera grupper som löper risk att drabbas av allvarlig sjukdom, inklusive äldre och individer med kronisk lungsjukdom. Dessutom finns det också debatt om kortikosteroidernas roll och vissa sjukhusriktlinjer rekommenderar att de används trots att WHO:s vägledning motsäger detta på grund av farhågor om att de kan försämra den antivirala immuniteten och förvärra sjukdomen. Mekanismerna som driver sjukdomens svårighetsgrad hos vissa individer infekterade med covid-19 är dåligt förstådda. Vi behöver snarast förstå dessa mekanismer för att underlätta snabb utveckling av nya effektiva terapier och vacciner

1. Immunkänslighet för svår covid-19-sjukdom

Det finns flera förmodade mekanismer genom vilka SARS-CoV-2 kan driva större sjukdomsallvarlighet hos pre-disponerade individer. Dessa inkluderar:

1. Nedsatt medfödda antivirala immunsvar

   Efter virusintrång involverar det medfödda immunsvaret mot respiratoriska virus induktion av typ I- och III-interferonerna (IFN). Detta initierar en kaskad som utlöser uttryck av en rad interferonstimulerade gener som uttrycker proteiner som samverkar för att begränsa viral replikation. Kroniska lungsjukdomar, särskilt astma, cystisk fibros (CF) och KOL är associerade med försämrad eller dysreglerad induktion av interferon till vanliga virus som rhinovirus och influensa och liknande dysreglering kan förekomma med SARS-CoV-2. Inhalerat interferon-β är för närvarande i försök som en antiviral terapi för astma och KOL.

2. Överdrivna inflammatoriska svar på virusinfektion

   Vanliga luftvägsvirusinfektioner som influensa och respiratoriskt syncyitialt virus (RSV) kan främja viral patologi som medieras av antikroppar och T-cellssvar. Tidiga bevis tyder på att allvarlig COVID-19-sjukdom är associerad med hyperinflammation, en egenskap som kan vara direkt driven av virusbördan eller uppstå på grund av oberoende hyperaktivering av immunsystemet. Humana coronavirusinfektioner inklusive SARS-CoV kan inducera immunopatologi i lungorna genom ett antal olika mekanismer inklusive antikroppsförstärkning av SARS-CoV-infektion av humana makrofager. Signifikanta ökningar av CD4- och CD8-uttryckande pro-inflammatoriska cytokiner har visats vid svår SARS-CoV-sjukdom jämfört med mild/måttlig sjukdom.

   Följaktligen har det funnits ett stort intresse för en potentiell roll att återanvända befintliga immunsuppressiva terapier för behandling av svår covid-19. De viktigaste mediatorerna och vägarna som driver hyperinflammation i COVID-19 är oklara och en större förtydligande av dessa processer kommer att informera om användning av befintliga terapier eller utveckling av nya metoder för effektiv behandling. Implikationen av dysregulerade T-cellssvar vid baslinjen, såsom de som ses vid kronisk lungsjukdom (t.ex. astma, KOL, cystisk fibros) är återigen oklart och kräver ytterligare mekanistisk förståelse. Som sådan är det ännu oklart om immunsuppressiva terapier som för närvarande är i kliniska prövningar kommer att vara fördelaktiga eller skadliga i dessa stora kohorter av mottagliga patienter.

3. Dysregulerad interferonberoende endotelfunktion till COVID-19

   Acute respiratory distress syndrome (ARDS) kännetecknas av hydrostatiskt lungödem, förhöjt pulmonellt vaskulärt motstånd och koagulopati, det finns störningar i endotelfunktionen med oreglerad frisättning av de endotelhärledda vasoaktiva hormonerna. Cirkulerande nivåer av endotelin-1 höjs hos patienter med ARDS[16], troligen på grund av ökad produktion och minskat clearance i lungorna som potentiellt regleras av Angiopoietin-1.

   Allvarlig SARS-CoV-2-infektion är associerad med cytokinstorm. Förhöjda serumnivåer av ett antal inflammatoriska nyckelcytokiner inklusive IFN-gamma, TNF-alfa, IP10, IL-8 och IL-10 och förhöjda nivåer av IL-6 är starkt associerade med dödlighet. IL-6-frisättning induceras synergistiskt av IFN-gamma och TNF-alfa och i en positiv återkopplingsmekanism förstärker en låg dos av IL-6 starkt de cellulära svaren på IFN-alfa och modulerar interferon-stimulerat genuttryck. I en experimentell murin modell fann vi att infektion med rhinovirus med IFN-samstimulering leder till förhöjda bronkoalveolära sköljnivåer av IL-6 (Singanayagam et al, opublicerade observationer). Dessa data tyder på att hos patienter med svår covid-19 uppstår en hyperinflammatorisk process och vi antar att genom dysreglerad och okontrollerad IFN-produktion, leder viktiga vaskulo-inflammatoriska interferonstimulerade gener inklusive IP10 och ET-1 sämre resultat med ökad parenkymal och pulmonell vaskulär inflammation. Detta resulterar i en dikotomi där initial IFN-induktion krävs för att begränsa viral replikation, men sen okontrollerad produktion kan förvärra patofysiologin. Detta stöds av nya kliniska data som tyder på en unik fenotyp för SARS-CoV-2 intensivvårdspatienter som kännetecknas av svår hypoxi med nästan normal lungkompliance.

4. Ändrad viral ingångsreceptoruttryck: Nya data indikerar att SARS-CoV-2 använder angiotensinomvandlande enzym (ACE)2 som en receptor för viral bindning och även proteaset TMPRSS2 som klyver spike(S)-proteinet för att möjliggöra fusion av viruset med cellulärt membran. ACE2 och TMPRSS2 är ofta samuttryckta i lungepitelet. En nyligen genomförd studie visade också att ACE2 är en interferonstimulerad gen (ISG) (dvs. direkt inducerad av det antivirala svaret) och därför kan SARS-CoV-2 uppreglera sin egen receptor för att sprida infektion. Nya data indikerar att rökare och försökspersoner med kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) har ökat pulmonellt ACE2-uttryck, vilket tyder på att kronisk lungsjukdom kan underlätta större infektion med SARS-CoV-2. Omvänt skyddar ACE2-uttryck mot akut lungskada i samband med sur aspiration eller sepsis och därför, om ACE2-induktion av SARS-CoVs är försämrad vid kronisk lungsjukdom, kan detta predisponera för negativa resultat.
5. Ökade sekundära bakteriella och/eller svampinfektioner

I tidiga fallserier har sekundära infektioner observerats oftare hos personer med svår covid-19-sjukdom. Sekundär bakterieinfektion är ett välkänt fenomen efter rhinovirus, influensa eller respiratoriskt syncytialvirus och kan drivas mekaniskt av en rad möjliga mekanismer inklusive makrofagfagocytos eller neutrofil elastasmedierad klyvning av antimikrobiella peptider. Dessa processer kan förvärras av användning av kortikosteroider28 och framför allt hade en större andel av patienterna med sekundära infektioner efter covid-19 ordinerats steroider.

Invasiv svampsjukdom förenlig med aspergillos har också observerats för både allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus (SARS-CoV-2003) och Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV), och anekdotiska rapporter om obduktioner hos patienter med COVID-19 från Kina föreslår att Aspergillus lunginfektioner förekommer. Dessa data är tidiga varningstecken på att sekundära invasiva svampinfektioner kan ge en allt allvarligare komplikation hos patienter som drabbats av covid-19 allt eftersom pandemin fortskrider. Att förstå den mekanistiska grunden för immunkänslighet för sekundär bakteriell/svampinfektion och en förmåga att förhindra dessa sekundära infektioner kan vara ett viktigt steg mot att förbättra resultaten av sjukdomen.

1.2 MOTIVERING FÖR NUVARANDE STUDIE

I den här studien kommer utredarna att analysera blod- och luftvägsprover från individer med bekräftad covid-19 för att förstå de immunmekanismer som leder till allvarlig sjukdom. Vi kommer att belysa specifika mekanismer som driver mer allvarlig patologi hos individer med högre risk såsom de med kronisk lungsjukdom. Genom detaljerad immunprofilering kommer vi att identifiera nyckelvägar och läkemedelsbara mål att utnyttja i framtida kliniska interventionsstudier.

Hypoteser:

1. Högriskindivider inklusive individer med kronisk lungsjukdom har försämrade antivirala immunsvar mot SARS-CoV-2, vilket ökar virusinducerad inflammation.
2. Interferonberoende endoteldysfunktion driver patogenicitet vid SARS-CoV-2-infektion.
3. Mottaglighet för sekundär bakteriell och svampinfektion vid kronisk lungsjukdom är relaterad till selektiva vägdefekter i medfödd immunfunktion.

2. STUDIENS MÅL

Huvudmål:

1. Förstå immunmekanismerna som driver COVID-19-sjukdomen hos patienter med en historia av lungsjukdom

Sekundära mål

1. Identifiera immunkorrelat av skydd och lungpatologi vid SARS-CoV-2-infektion.
2. Analys av endotelfunktion hos milda och svåra COVID-19-patienter och ex vivo med hjälp av virusstimulerade blodhärledda endotelceller från patienter med COVID-19.
3. Utvärdering av förändringar i övre/nedre luftvägsmikrobiota och mykobiota som inträffar under covid-19.
4. Utvärdering av ex vivo perifert blods immunsvar på virala, bakteriella och svampstimuli hos patienter med COVID-19 och kronisk lungsjukdom jämfört med patienter med COVID-19 och ingen kronisk lungsjukdom.
5. Analys av livskvalitetseffekten av COVID-19-infektion vid kronisk lungsjukdom.

3. STUDIEDESIGN

Genom en 24-månaders prospektiv longitudinell multicenter (Royal Brompton & Harefield NHS Trust Chelsea och Westminster NHS Foundation Trust, och Imperial College Healthcare NHS Trusts) observationsstudie kommer studieteamet att analysera blod-, sputum- och nasala provtagningar tillsammans med icke-invasiv EndoPAT-enhetstester i totalt pf 230 ämnen. Studiegruppen kommer att erhålla perifert blod, sputum, nässköljning, borstar och nasal syntetisk absorptiv matris (SAM)-prover och utföra icke-invasiva EndoPAT-tester på dagen för sjukhuspresentationen och med veckovisa intervaller under slutenvård och sedan under polikliniska besök efter behandling. utskrivning under en 12 månaders uppföljningsperiod. Studiegruppen kommer att samla in klinisk information inklusive demografi, rutinmässiga laboratorieundersökningar, kliniska symptompoäng och resultat. Länkad pseudoanonymiserad röntgenavbildning kommer också att överföras för analys.

Spontant expektorat sputum, nässköljning, borstar och nasal syntetisk absorptiv matris (SAM)-prover kommer att tas och bearbetas enligt tidigare beskrivning och lagras vid -800°C för nedströmsanalyser inklusive ELISA/MSD, viral belastningsmätning och mikrobiomanalys. Venöst blod (60 ml) kommer att tas in i litiumheparinrör och PAXgene RNA-rör och överföras till Imperial College (RBH) för bearbetning och lagring. PBMC kommer att extraheras för in vitro-stimuleringsanalyser och helblod (1 ml) och serum (2 ml) isoleras och lagras vid -80oC för vidare analys. PAXgene-rör kommer att lagras vid -80C för ytterligare genetisk sekvensanalys av värdvärden. Ytterligare immunologisk analys med användning av jäst-ytdisplay för serumantikroppsprofilering, enstaka B-cellssortering för att generera monoklonala antikroppar och ELISPOT för att analysera CD4 och CD8 T-cell ELISPOT till SARS CoV-2 peptidpooler. Ytterligare djupgående immunologisk profilering med användning av cytokinanalys, PBMC-cytokinsvar på viral (eller viral PRR-agonist), svampstimuli, jästytvisning för serumantikroppsprofilering, kloning av uttryck av enstaka minnes-B-celler. CD4 och CD8 T-cell ELISPOT kommer att utföras som tidigare beskrivits. Icke-invasiv EndoPAT-testning kommer också att utföras som tidigare beskrivits.