PROSAIC-19 - Avaliação longitudinal prospectiva em uma coorte infectada por COVID-19 (PROSAIC-19)

INTRODUÇÃO

1.1 ANTECEDENTES

A doença de coronavírus 2019 (COVID-19) causada pela infecção por SARS-CoV-2 é uma nova doença infecciosa que se espalha rapidamente, sem opções de tratamento comprovadas. O vírus causa um espectro de doenças que variam de sintomas leves de coriza a comprometimento respiratório grave que requer suporte ventilatório. A orientação da Public Health England identifica vários grupos que correm o risco de doenças graves, incluindo idosos e indivíduos com doença pulmonar crônica. Além disso, também há debate sobre o papel dos corticosteróides com algumas diretrizes hospitalares recomendando seu uso, apesar da orientação da OMS contradizer isso devido a preocupações de que eles possam prejudicar a imunidade antiviral e piorar a doença. Os mecanismos que conduzem à gravidade da doença em certos indivíduos infectados com COVID-19 são pouco compreendidos. Precisamos entender urgentemente esses mecanismos para facilitar o rápido desenvolvimento de novas terapias e vacinas eficazes

1. Imunossuscetibilidade à doença grave de COVID-19

Existem vários mecanismos putativos através dos quais o SARS-CoV-2 pode levar a uma maior gravidade da doença em indivíduos predispostos. Esses incluem:

1. Respostas imunes antivirais inatas prejudicadas

   Após a entrada viral, a resposta imune inata aos vírus respiratórios envolve a indução dos interferons tipo I e III (IFN). Isso inicia uma cascata que desencadeia a expressão de uma variedade de genes estimulados por interferon que expressam proteínas que atuam em conjunto para limitar a replicação viral. Doenças pulmonares crônicas, particularmente asma, fibrose cística (FC) e DPOC estão associadas à indução prejudicada ou desregulada de interferon para vírus comumente encontrados, como rinovírus e influenza, e desregulação semelhante pode ocorrer com SARS-CoV-2. O interferon-β inalado está atualmente em testes como uma terapia antiviral para asma e DPOC.

2. Respostas inflamatórias exageradas à infecção viral

   Infecções virais respiratórias comuns, como influenza e vírus sincicial respiratório (VSR), podem promover patologia viral mediada por anticorpos e respostas de células T. Evidências iniciais sugerem que a doença grave de COVID-19 está associada à hiperinflamação, uma característica que pode ser diretamente impulsionada pela carga viral ou ocorrer devido à hiperativação independente do sistema imunológico. As infecções por coronavírus humano, incluindo SARS-CoV, podem induzir imunopatologia nos pulmões por meio de vários mecanismos diferentes, incluindo aumento de anticorpos da infecção por SARS-CoV por macrófagos humanos. Aumentos significativos nas citocinas pró-inflamatórias que expressam CD4 e CD8 foram demonstrados na doença grave por SARS-CoV em comparação com a doença leve/moderada.

   Consequentemente, tem havido um interesse considerável em um papel potencial de redirecionar as terapias imunossupressoras existentes para o tratamento de COVID-19 grave. Os principais mediadores e vias que impulsionam a hiperinflamação no COVID-19 não são claros e uma maior elucidação desses processos informará o reaproveitamento das terapias existentes ou o desenvolvimento de novas abordagens para um tratamento eficaz. A implicação das respostas das células T desreguladas na linha de base, como aquelas observadas na doença pulmonar crônica (por exemplo, asma, DPOC, Fibrose Cística) é novamente obscuro e requer maior compreensão mecanicista. Como tal, ainda não está claro se as terapias imunossupressoras atualmente em ensaios clínicos serão benéficas ou prejudiciais nessas grandes coortes de pacientes suscetíveis.

3. Função endotelial dependente de interferon desregulada para COVID-19

   A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é caracterizada por edema pulmonar hidrostático, resistência vascular pulmonar elevada e coagulopatia, há interrupção da função endotelial com liberação desregulada dos hormônios vasoativos derivados do endotélio. Os níveis circulantes de endotelina-1 são elevados em pacientes com SDRA[16], provavelmente devido ao aumento da produção e diminuição da depuração nos pulmões potencialmente regulados pela Angiopoietina-1.

   A infecção grave por SARS-CoV-2 está associada à tempestade de citocinas. Os níveis séricos elevados de várias citocinas inflamatórias importantes, incluindo IFN-gama, TNF-alfa, IP10, IL-8 e IL-10, e níveis elevados de IL-6 estão fortemente associados à mortalidade. A liberação de IL-6 é sinergicamente induzida por IFN-gama e TNF-alfa e em um mecanismo de feedback positivo, uma dose baixa de IL-6 aumenta fortemente as respostas celulares ao IFN-alfa e modula a expressão gênica estimulada por interferon. Em um modelo experimental murino, descobrimos que a infecção com rinovírus com co-estimulação de IFN leva a níveis elevados de IL-6 no lavado broncoalveolar (Singanayagam et al, observações não publicadas). Esses dados sugerem que em pacientes com COVID-19 grave, ocorre um processo hiperinflamatório e levantamos a hipótese de que, por meio da produção desregulada e descontrolada de IFN, os principais genes estimulados por interferon vasculo-inflamatório, incluindo IP10 e ET-1, conduzem a piores resultados com aumento do parênquima e vascular pulmonar inflamação. Isso resulta em uma dicotomia em que a indução inicial de IFN é necessária para limitar a replicação viral, mas a produção tardia não controlada pode piorar a fisiopatologia. Isso é apoiado por dados clínicos emergentes que sugerem um fenótipo único para pacientes de terapia intensiva com SARS-CoV-2, caracterizados por hipóxia grave com complacência pulmonar quase normal.

4. Expressão alterada do receptor de entrada viral: Dados recentes indicam que o SARS-CoV-2 utiliza a enzima conversora de angiotensina (ACE)2 como um receptor para ligação viral e também a protease TMPRSS2 que cliva a proteína spike (S) para permitir a fusão do vírus com células membranas. ACE2 e TMPRSS2 são freqüentemente co-expressos no epitélio pulmonar. Um estudo recente também mostrou que o ACE2 é um gene estimulado por interferon (ISG) (i.e. induzido diretamente pela resposta antiviral) e, portanto, o SARS-CoV-2 pode regular positivamente seu próprio receptor para propagar a infecção. Dados recentes indicam que fumantes e indivíduos com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) aumentaram a expressão pulmonar de ACE2, sugerindo que a doença pulmonar crônica pode facilitar uma maior infecção por SARS-CoV-2. Por outro lado, a expressão de ACE2 protege contra lesão pulmonar aguda no contexto de aspiração de ácido ou sepse e, portanto, se a indução de ACE2 por SARS-CoVs for prejudicada na doença pulmonar crônica, isso pode predispor a resultados adversos.
5. Aumento de infecções bacterianas e/ou fúngicas secundárias

Em séries iniciais de casos, infecções secundárias foram observadas com mais frequência em indivíduos com doença grave por COVID-19. A infecção bacteriana secundária é um fenômeno bem reconhecido após rinovírus, influenza ou vírus sincicial respiratório e pode ser mecanicamente impulsionado por uma variedade de mecanismos possíveis, incluindo fagocitose de macrófagos ou clivagem de peptídeos antimicrobianos mediada por elastase de neutrófilos. Esses processos podem ser agravados pelo uso de corticosteroides28 e, notavelmente, uma proporção maior de pacientes com infecções secundárias após COVID-19 receberam prescrição de esteroides.

A doença fúngica invasiva consistente com aspergilose também foi observada para o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2003) e para o coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV), e relatos anedóticos de autópsias em pacientes com COVID-19 de China sugerem que infecções pulmonares por Aspergillus ocorrem. Esses dados são sinais de alerta precoce de que infecções fúngicas invasivas secundárias podem apresentar uma complicação cada vez mais grave em pacientes afetados com COVID-19 à medida que a pandemia avança. Compreender a base mecanística da suscetibilidade imunológica à infecção bacteriana/fúngica secundária e a capacidade de prevenir essas infecções secundárias pode ser um passo fundamental para melhorar os resultados da doença.

1.2 FUNDAMENTAÇÃO PARA O ESTUDO ATUAL

Neste estudo, os pesquisadores analisarão amostras de sangue e vias aéreas de indivíduos com COVID-19 confirmado para entender os mecanismos imunológicos que levam a doenças graves. Iremos elucidar os mecanismos específicos que levam a patologias mais graves em indivíduos de maior risco, como aqueles com doença pulmonar crônica. Por meio de imunoperfil detalhado, identificaremos os principais caminhos e alvos drogáveis ​​a serem explorados em futuros estudos de intervenção clínica.

Hipóteses:

1. Indivíduos de alto risco, incluindo indivíduos com doença pulmonar crônica, têm respostas imunes antivirais prejudicadas ao SARS-CoV-2, aumentando a inflamação induzida pelo vírus.
2. A disfunção endotelial dependente de interferon leva à patogenicidade na infecção por SARS-CoV-2.
3. A suscetibilidade à infecção bacteriana e fúngica secundária na doença pulmonar crônica está relacionada a defeitos de vias seletivas na função imune inata.

2. OBJETIVOS DO ESTUDO

Objetivo primário:

1. Compreender os mecanismos imunológicos que conduzem à doença de COVID-19 em pacientes com histórico de doença pulmonar

Objetivos secundários

1. Identifique correlatos imunológicos de proteção e patologia pulmonar na infecção por SARS-CoV-2.
2. Análise da função endotelial em pacientes com COVID-19 leve e grave e ex vivo usando células endoteliais derivadas do sangue estimuladas por vírus de pacientes com COVID-19.
3. Avaliação das mudanças na microbiota das vias aéreas superiores/inferiores e na micobiota que ocorrem durante a COVID-19.
4. Avaliação das respostas imunes do sangue periférico ex vivo a estímulos virais, bacterianos e fúngicos em pacientes com COVID-19 e doença pulmonar crônica em comparação com pacientes com COVID-19 e sem doença pulmonar crônica.
5. Análise do impacto na qualidade de vida da infecção por COVID-19 na doença pulmonar crônica.

3. PROJETO DO ESTUDO

Por meio de um estudo observacional prospectivo longitudinal multicêntrico de 24 meses (Royal Brompton & Harefield NHS Trust Chelsea e Westminster NHS Foundation Trust e Imperial College Healthcare NHS Trusts), a equipe de estudo analisará amostras de sangue, escarro e nasal juntamente com testes de dispositivos EndoPAT não invasivos em um total de 230 indivíduos. A equipe do estudo obterá amostras de sangue periférico, escarro, lavagem nasal, escovação e matriz absortiva sintética nasal (SAM) e realizará testes EndoPAT não invasivos no dia da internação e em intervalos semanais durante a internação e, em seguida, durante as consultas ambulatoriais após a internação. alta durante um período de acompanhamento de 12 meses. A equipe do estudo coletará informações clínicas, incluindo dados demográficos, investigações laboratoriais de rotina, escores de sintomas clínicos e resultados. Imagens radiológicas pseudoanônimas vinculadas também serão transferidas para análise.

Amostras de escarro expectorado espontaneamente, lavagem nasal, escovação e matriz absortiva sintética nasal (SAM) serão coletadas e processadas conforme descrito anteriormente e armazenadas a -800C para análises a jusante, incluindo ELISA/MSD, medição de carga viral e análise de microbioma. Sangue venoso (60mls) será levado para tubos de Heparina de Lítio e tubos de RNA PAXgene e transferido para o Imperial College (RBH) para processamento e armazenamento. As PBMCs serão extraídas para ensaios de estimulação in vitro e sangue total (1ml) e soro (2mls) isolados e armazenados a -80oC para posterior análise. Os tubos PAXgene serão armazenados a -80°C para posterior análise do sequenciamento genético do hospedeiro. Análise imunológica adicional usando exibição de superfície de levedura para perfil de anticorpos séricos, classificação de células B únicas para gerar anticorpos monoclonais e ELISPOT para analisar pools de peptídeos ELISPOT de células T CD4 e CD8 para SARS CoV-2. Perfil imunológico mais profundo usando análise de citocinas, resposta de citocina PBMC a vírus (ou agonista de PRR viral), estímulos fúngicos, exibição de superfície de levedura para perfil de anticorpos séricos, clonagem de expressão de células B de memória única será realizada. O ELISPOT de células T CD4 e CD8 será realizado conforme descrito anteriormente. O teste EndoPAT não invasivo também será realizado conforme descrito anteriormente.