PROSAIC-19 – Prospektywna ocena podłużna w kohorcie zakażonej COVID-19 (PROSAIC-19)

PRZEDSTAWIENIE SIĘ

1.1 TŁO

Choroba wywołana przez koronawirusa 2019 (COVID-19) spowodowana zakażeniem SARS-CoV-2 to nowa, szybko rozprzestrzeniająca się choroba zakaźna bez sprawdzonych możliwości leczenia. Wirus powoduje spektrum chorób, od łagodnych objawów koryza do ciężkiego upośledzenia oddechowego wymagającego wspomagania wentylacji. Wytyczne Public Health England identyfikują kilka grup zagrożonych ciężką chorobą, w tym osoby starsze i osoby z przewlekłymi chorobami płuc. Ponadto toczy się również debata na temat roli kortykosteroidów, a niektóre wytyczne szpitalne zalecają ich stosowanie, mimo że wytyczne WHO temu zaprzeczają ze względu na obawy, że mogą one osłabiać odporność przeciwwirusową i pogarszać przebieg choroby. Mechanizmy kierujące ciężkością choroby u niektórych osób zakażonych COVID-19 są słabo poznane. Pilnie potrzebujemy zrozumienia tych mechanizmów, aby ułatwić szybki rozwój nowych skutecznych terapii i szczepionek

1. Immunowrażliwość na ciężką chorobę COVID-19

Istnieje kilka domniemanych mechanizmów, dzięki którym SARS-CoV-2 może powodować większe nasilenie choroby u osób predysponowanych. Obejmują one:

1. Upośledzona wrodzona przeciwwirusowa odpowiedź immunologiczna

   Po wejściu wirusa wrodzona odpowiedź immunologiczna na wirusy układu oddechowego obejmuje indukcję interferonów typu I i III (IFN). To inicjuje kaskadę, która wyzwala ekspresję szeregu stymulowanych interferonem genów wyrażających białka, które działają wspólnie w celu ograniczenia replikacji wirusa. Przewlekłe choroby płuc, w szczególności astma, mukowiscydoza (CF) i POChP, są związane z upośledzoną lub rozregulowaną indukcją interferonu do powszechnie spotykanych wirusów, takich jak rinowirus i grypa, a podobne rozregulowanie może wystąpić w przypadku SARS-CoV-2. Wziewny interferon-β jest obecnie w fazie prób jako lek przeciwwirusowy w leczeniu astmy i POChP.

2. Przesadne reakcje zapalne na infekcję wirusową

   Powszechne infekcje wirusowe układu oddechowego, takie jak grypa i syncyitialny wirus oddechowy (RSV), mogą sprzyjać patologii wirusowej, w której pośredniczą przeciwciała i odpowiedzi komórek T. Wczesne dowody sugerują, że ciężka choroba COVID-19 jest związana z hiperzapaleniem, cechą, która może być bezpośrednio spowodowana obciążeniem wirusem lub może wystąpić w wyniku niezależnej hiperaktywacji układu odpornościowego. Zakażenia ludzkimi koronawirusami, w tym SARS-CoV, mogą indukować immunopatologię w płucach poprzez szereg różnych mechanizmów, w tym wzmacnianie przeciwciał zakażenia SARS-CoV przez ludzkie makrofagi. Wykazano znaczny wzrost cytokin prozapalnych wykazujących ekspresję CD4 i CD8 w ciężkiej chorobie SARS-CoV w porównaniu z chorobą łagodną/umiarkowaną.

   W związku z tym istnieje duże zainteresowanie potencjalną rolą zmiany przeznaczenia istniejących terapii immunosupresyjnych w leczeniu ciężkiego COVID-19. Kluczowe mediatory i szlaki, które napędzają hiperzapalenie w COVID-19, są niejasne, a dokładniejsze wyjaśnienie tych procesów pomoże w zmianie przeznaczenia istniejących terapii lub opracowaniu nowych podejść do skutecznego leczenia. Implikacje wyjściowych rozregulowanych odpowiedzi komórek T, takich jak te obserwowane w przewlekłych chorobach płuc (np. astma, POChP, mukowiscydoza) jest ponownie niejasna i wymaga dalszego mechanistycznego zrozumienia. W związku z tym nie jest jeszcze jasne, czy terapie immunosupresyjne będące obecnie w fazie badań klinicznych będą korzystne czy szkodliwe w tych dużych kohortach podatnych pacjentów.

3. Rozregulowana funkcja śródbłonka zależna od interferonu w przypadku COVID-19

   Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) charakteryzuje się hydrostatycznym obrzękiem płuc, podwyższonym płucnym oporem naczyniowym i koagulopatią, zaburzeniem funkcji śródbłonka z rozregulowanym uwalnianiem hormonów wazoaktywnych pochodzących ze śródbłonka. Poziomy krążącej endoteliny-1 są podwyższone u pacjentów z ARDS[16], prawdopodobnie z powodu zwiększonej produkcji i zmniejszonego klirensu w płucach, potencjalnie regulowanego przez Angiopoetynę-1.

   Ciężka infekcja SARS-CoV-2 jest związana z burzą cytokinową. Podwyższone poziomy w surowicy szeregu kluczowych cytokin zapalnych, w tym IFN-gamma, TNF-alfa, IP10, IL-8 i IL-10 oraz podwyższone poziomy IL-6 są silnie związane ze śmiertelnością. Uwalnianie IL-6 jest indukowane synergistycznie przez IFN-gamma i TNF-alfa, aw mechanizmie pozytywnego sprzężenia zwrotnego, niska dawka IL-6 silnie wzmacnia odpowiedzi komórkowe na IFN-alfa i moduluje ekspresję genów stymulowaną interferonem. W eksperymentalnym modelu mysim stwierdziliśmy, że infekcja rinowirusem z kostymulacją IFN prowadzi do podwyższonych poziomów IL-6 w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (Singanayagam i in., niepublikowane obserwacje). Dane te sugerują, że u pacjentów z ciężkim COVID-19 następuje proces hiperzapalny i stawiamy hipotezę, że poprzez rozregulowaną i niekontrolowaną produkcję IFN, kluczowe geny stymulowane przez interferon w zapaleniu naczyń, w tym IP10 i ET-1, prowadzą do gorszych wyników ze zwiększonym miąższem i płucami zapalenie. Powoduje to dychotomię, zgodnie z którą początkowa indukcja IFN jest wymagana do ograniczenia replikacji wirusa, ale późna niekontrolowana produkcja może pogorszyć patofizjologię. Potwierdzają to pojawiające się dane kliniczne sugerujące unikalny fenotyp pacjentów z SARS-CoV-2 na oddziałach intensywnej terapii, charakteryzujący się ciężkim niedotlenieniem z prawie normalną podatnością płuc.

4. Zmieniona ekspresja receptora wejścia wirusa: ostatnie dane wskazują, że SARS-CoV-2 wykorzystuje enzym konwertujący angiotensynę (ACE)2 jako receptor przyłączania się wirusa, a także proteazę TMPRSS2, która rozszczepia białko kolca (S), aby umożliwić fuzję wirusa z komórką membrany. ACE2 i TMPRSS2 są często koeksprymowane w nabłonku płuc. Niedawne badanie wykazało również, że ACE2 jest genem stymulowanym interferonem (ISG) (tj. bezpośrednio indukowane przez odpowiedź przeciwwirusową), a zatem SARS-CoV-2 może regulować w górę swój własny receptor w celu rozprzestrzeniania infekcji. Ostatnie dane wskazują, że palacze i osoby z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP) mają zwiększoną ekspresję ACE2 w płucach, co sugeruje, że przewlekła choroba płuc może ułatwiać większe zakażenie SARS-CoV-2. I odwrotnie, ekspresja ACE2 chroni przed ostrym uszkodzeniem płuc w kontekście aspiracji kwasu lub posocznicy, a zatem jeśli indukcja ACE2 przez SARS-CoV jest upośledzona w przewlekłej chorobie płuc, może to predysponować do niekorzystnego wyniku.
5. Zwiększona wtórna infekcja bakteryjna i/lub grzybicza

We wczesnych seriach przypadków infekcje wtórne obserwowano częściej u osób z ciężką chorobą COVID-19. Wtórne zakażenie bakteryjne jest dobrze znanym zjawiskiem występującym po rinowirusie, grypie lub syncytialnym wirusie oddechowym i może być mechanicznie napędzane przez szereg możliwych mechanizmów, w tym fagocytozę makrofagów lub rozszczepianie peptydów przeciwdrobnoustrojowych za pośrednictwem elastazy neutrofili. Stosowanie kortykosteroidów może pogorszyć te procesy28, a zwłaszcza większy odsetek pacjentów z wtórnymi infekcjami po COVID-19 otrzymał przepisane sterydy.

Inwazyjną chorobę grzybiczą odpowiadającą aspergilozie zaobserwowano również zarówno w przypadku koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2003), jak i koronawirusa zespołu oddechowego na Bliskim Wschodzie (MERS-CoV), a także niepotwierdzonych doniesień o sekcjach zwłok pacjentów z COVID-19 z Chiny sugerują, że występują infekcje płuc Aspergillus. Dane te są wczesnymi sygnałami ostrzegawczymi, że wtórne inwazyjne zakażenia grzybicze mogą stanowić coraz poważniejsze powikłanie u pacjentów dotkniętych COVID-19 w miarę postępu pandemii. Zrozumienie mechanistycznych podstaw podatności immunologicznej na wtórne infekcje bakteryjne/grzybicze oraz umiejętność zapobiegania tym wtórnym infekcjom może być kluczowym krokiem w kierunku poprawy wyników leczenia tej choroby.

1.2 UZASADNIENIE BIEŻĄCEGO BADANIA

W tym badaniu badacze przeanalizują próbki krwi i dróg oddechowych od osób z potwierdzonym COVID-19, aby zrozumieć mechanizmy immunologiczne, które prowadzą do ciężkiej choroby. Wyjaśnimy konkretne mechanizmy, które prowadzą do cięższej patologii u osób z grupy podwyższonego ryzyka, takich jak osoby z przewlekłą chorobą płuc. Dzięki szczegółowemu profilowaniu immunologicznemu zidentyfikujemy kluczowe szlaki i cele, które można wykorzystać w przyszłych klinicznych badaniach interwencyjnych.

hipotezy:

1. Osoby wysokiego ryzyka, w tym osoby z przewlekłą chorobą płuc, mają upośledzoną przeciwwirusową odpowiedź immunologiczną na SARS-CoV-2, nasilając zapalenie wywołane wirusem.
2. Zależna od interferonu dysfunkcja śródbłonka napędza patogenność zakażenia SARS-CoV-2.
3. Podatność na wtórne infekcje bakteryjne i grzybicze w przewlekłych chorobach płuc jest związana z selektywnymi defektami szlaku we wrodzonej funkcji odpornościowej.

2. CELE STUDIÓW

Podstawowy cel:

1. Zrozumieć mechanizmy immunologiczne wywołujące chorobę COVID-19 u pacjentów z chorobami płuc w wywiadzie

Cele drugorzędne

1. Zidentyfikuj immunologiczne korelaty ochrony i patologii płuc w zakażeniu SARS-CoV-2.
2. Analiza funkcji śródbłonka u pacjentów z łagodnym i ciężkim przebiegiem COVID-19 oraz ex vivo przy użyciu komórek śródbłonka krwiopochodnych stymulowanych wirusem od pacjentów z COVID-19.
3. Ocena zmian mikrobiomu i mykobiomu górnych/dolnych dróg oddechowych zachodzących podczas COVID-19.
4. Ocena odpowiedzi immunologicznej ex vivo krwi obwodowej na bodźce wirusowe, bakteryjne i grzybicze u pacjentów z COVID-19 i przewlekłą chorobą płuc w porównaniu z pacjentami z COVID-19 i bez przewlekłej choroby płuc.
5. Analiza wpływu na jakość życia zakażenia COVID-19 w przewlekłych chorobach płuc.

3. PROJEKT STUDIUM

W ramach 24-miesięcznego prospektywnego wieloośrodkowego badania obserwacyjnego (Royal Brompton & Harefield NHS Trust Chelsea i Westminster NHS Foundation Trust oraz Imperial College Healthcare NHS Trusts) zespół badawczy przeanalizuje próbki krwi, plwociny i próbek z nosa oraz nieinwazyjne testy urządzeń EndoPAT w w sumie pf 230 przedmiotów. Zespół badawczy będzie pobierał próbki krwi obwodowej, plwociny, popłuczyn z nosa, wymazów i syntetycznej matrycy absorpcyjnej (SAM) z nosa oraz wykonywał nieinwazyjne badanie EndoPAT w dniu przyjęcia do szpitala oraz w odstępach tygodniowych w warunkach szpitalnych, a następnie podczas wizyt ambulatoryjnych po leczeniu szpitalnym. wypis w ciągu 12-miesięcznego okresu obserwacji. Zespół badawczy zbierze informacje kliniczne, w tym dane demograficzne, rutynowe badania laboratoryjne, wyniki objawów klinicznych i wyniki. Powiązane pseudoanonimowe obrazowanie radiologiczne również zostanie przesłane do analizy.

Spontanicznie odkrztuszona plwocina, popłuczyny z nosa, wyszczoteczki i próbki syntetycznej matrycy absorpcyjnej nosa (SAM) zostaną pobrane i przetworzone zgodnie z wcześniejszym opisem i przechowywane w temperaturze -80°C do dalszych analiz, w tym testu ELISA/MSD, pomiaru miana wirusa i analizy mikrobiomu. Krew żylna (60 ml) zostanie pobrana do probówek z heparyną litową i probówek PAXgene RNA i przeniesiona do Imperial College (RBH) w celu przetworzenia i przechowywania. PBMC zostaną wyekstrahowane do testów stymulacji in vitro, po czym wyizolowana zostanie pełna krew (1 ml) i surowica (2 ml) i będą przechowywane w temperaturze -80oC do dalszej analizy. Probówki PAXgene będą przechowywane w temperaturze -80°C do dalszej analizy sekwencjonowania genetycznego gospodarza. Dalsza analiza immunologiczna z wykorzystaniem prezentacji powierzchniowej drożdży do profilowania przeciwciał w surowicy, sortowania pojedynczych komórek B w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych oraz ELISPOT do analizy ELISPOT limfocytów T CD4 i CD8 do pul peptydów SARS CoV-2. Przeprowadzone zostanie dalsze głębokie profilowanie immunologiczne z wykorzystaniem analizy cytokin, odpowiedzi cytokin PBMC na bodźce wirusowe (lub wirusowego agonisty PRR), grzybów, prezentacji powierzchni drożdży do profilowania przeciwciał w surowicy, klonowania ekspresji komórek B pojedynczej pamięci. ELISPOT komórek T CD4 i CD8 zostanie przeprowadzony zgodnie z wcześniejszym opisem. Nieinwazyjne testy EndoPAT zostaną również przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem.