Účinnost mepolizumabu u těžkých astmatiků (MESILICO) (MESILICO)

Vědecké zdůvodnění Interleukin (IL)-5 je hlavním cytokinem zodpovědným za aktivaci eozinofilů, a proto byly prozkoumány a vyvinuty terapeutické strategie pro klinické použití. Biologická léčiva cílená na IL-5 a jeho receptor (nejprve mepolizumab a následně reslizumab a benralizumab) byla nedávno schválena a používána jako přídavná léčba těžkého eozinofilního astmatu, což vede ke snížení počtu cirkulujících eozinofilů, zlepšení funkce plic a exacerbaci snížení u pacientů s těžkým astmatem.

Reakce na biologickou léčbu u těžkého astmatu je proměnlivá, přičemž pacienti buď nereagují, reagují nebo superreagují. V současné době neexistuje žádné vysvětlení pro tuto širokou variaci v reakci. Je důležité prověřit, zda tito pacienti mají odlišné charakteristiky, které by mohly pomoci ošetřujícímu lékaři při stanovení správné diagnózy v klinické praxi.

Cílem této klinické studie je zhodnotit účinnost mepolizumabu, humanizované monoklonální protilátky antagonisty IL-5 u pacientů s pozdním nástupem těžkého eozinofilního astmatu s fixní obstrukcí a identifikovat charakteristiky non-responderů a super-responderů na léčbu mepolizumabem. Tato studie je považována za neintervenční a každý zahrnutý postup probíhá v klinické rutině pro diagnostiku a fenotypizaci astmatických pacientů.

K vyšetření zánětu dýchacích cest se používá několik metod: přímá měření (jako jsou bronchiální biopsie nebo bronchoalveolární výplachy) a nepřímé metody (jako hodnocení symptomů, analýza vzorků krve a testy funkce plic). Přímé techniky mají tu výhodu, že spolehlivě vyhodnotí zánět dýchacích cest, ale jsou invazivní a nejsou proveditelné ve velkém měřítku kvůli nepohodlí pacienta a souvisejícímu riziku. Pokud jde o nepřímé metody, špatně korelují s přímým hodnocením zánětu dýchacích cest.

V této studii budou z klinických charakteristik pacientů hodnoceny spirometrie, biomarkery zánětu (krevní eozinofily, FeNO, hladiny IgE), impulsní oscilometrie (IOS) a ztluštění bazální membrány pomocí bronchoskopie. Předpokládá se, že u pacientů s pozdním nástupem těžkého eozinofilního astmatu s fixní obstrukcí, kteří nereagují na obvyklou léčbu (ICS/LABA/LAMA), se objeví zvýšená hmota hladkého svalstva. Přesné účinky zvýšené hmoty hladkého svalstva dýchacích cest na zúžení dýchacích cest však nejsou známy a mohou se lišit podle závažnosti onemocnění. Kromě toho budou také hodnoceny biomarkery zánětu před a po 52týdenní léčbě mepolizumabem v biologických tekutinách (sérum, sputum, supernatant sputa a bronchiální vzorky). Biomarkery zánětu jsou velmi důležité pro identifikaci reagujících na nereagující.

Přesněji řečeno, IOS byl zaveden jako alternativní technika k hodnocení funkce plic se zvláštní aplikací na astma. Tato technika je neinvazivní, snadno se provádí během dechového dýchání a vyžaduje pouze minimální spolupráci pacienta.

Odběr sputa je dalším způsobem odběru vzorků buněk z dýchacích cest a umožňuje přímé posouzení zánětu dýchacích cest. Dále příklady supernatantu sputa zahrnují analýzu mediátorů a hodnocení chemotaktické aktivity vzorku na eozinofily. Buňky sputa lze také analyzovat průtokovou cytometrií, která mimo jiné umožňuje imunofenotypizaci a třídění buněk. Kromě toho mohou být kultivovány buňky sputa a jejich produkce mediátorů může být měřena in vitro. Stojí za zmínku, že v tomto případě je obsah mediátoru odlišný od obsahu, který lze nalézt v supernatantu sputa. Mediátory v supernatantu sputa mohou být skutečně ovlivněny sekrety z buněk rezidentních v dýchacích cestách a exsudací plazmy, na rozdíl od modelu buněčné kultury sputa. Konečně, imunocytochemie a in situ hybridizace mohou být také prováděny s použitím buněk sputa.

Ačkoli byly jako referenční hodnoty navrženy fenotypy, krevní eozinofily a hladiny IgE v séru, existuje disociace mezi hladinou imunitních buněk v krvi a imunitní reakcí epitelu dýchacích cest, jak bylo potvrzeno v předchozích studiích. Imunohistochemické barvení epitelu dýchacích cest na cílené imunitní buňky bylo použito k určení různých typů zánětu dýchacích cest; tato technika se však v klinickém prostředí používá jen zřídka. Předchozí studie odhalily relativní bezpečnost provádění bronchoskopických biopsií u pacientů s těžkým astmatem. Mezi technikami odběru vzorků používanými pro diagnostiku tkání, včetně nazálních biopsií, čištění nosu nebo průdušek a bronchoalveolární laváže, poskytuje bronchoskopicky řízený odběr bronchiálního epitelu přesnější informace o epiteliálních a zánětlivých buňkách v kontextu tkáně. Je tak silným nástrojem pro výběr nejvhodnějších biologických látek v obtížných klinických podmínkách.

Kromě toho je astmatické onemocnění charakterizováno chronickým slizničním zánětlivým procesem, jehož výsledkem jsou nevratné změny bronchiální stěny, dnes známé jako "bronchiální remodelace". Hyperplazie a/nebo hypertrofie žlázových a hladkých svalových vláken, hyperplazie pohárkových buněk a variabilní ztluštění bazální membrány (BM) přítomné pod respiračním epitelem jsou součástí těchto morfologických změn. změny generované na rozhraní mezi epitelem a pojivem odpovídají za „adaptivní odpověď“ na zánětlivý stres a sporadickou bronchokonstrikci. Současná data o reaktivitě BM u astmatických pacientů jsou však stále neúplná pro přesné posouzení jejího zapojení do patogeneze a konkrétně do remodelace bronchiální stěny, zejména proto, že depozita kolagenu v lamina reticularis nekorelují se stupněm závažnosti onemocnění.

Navíc je stále více zřejmé, že těžké astma není jediné onemocnění, jak dokazují různé klinické projevy, fyziologické charakteristiky a výsledky pozorované u pacientů s astmatem. Pro lepší pochopení této heterogenity se objevil koncept fenotypizace a endotypizace astmatu. Fenotypizace integruje biologické i klinické vlastnosti, od molekulárních, buněčných, morfologických a funkčních až po charakteristiky orientované na pacienta s cílem zlepšit terapii. Nakonec se tyto fenotypy vyvinou do „endotypů“ astmatu, které kombinují klinické charakteristiky s identifikovatelnými mechanistickými cestami. Biomarkery, definované jako charakteristiky, které lze objektivně měřit a slouží jako indikátor základních biologických procesů nebo patogeneze, jsou klíčové při definování fenotypů a endotypů. U astmatu byly zkoumány genetické polymorfismy, měření fyziologie dýchacích cest a hladiny zánětlivých mediátorů v moči, krvi, sputu, tkáni, vydechovaných plynech a dechovém kondenzátu jako potenciální markery pro zlepšení a objektivizaci diagnózy a léčby astmatu. Vývoj takových nástrojů nám umožní fenotypovat a endotypovat různé klinické vzorce popsané u astmatu s konečným cílem přizpůsobit terapii na základě specifického profilu biomarkerů. Biomarkery pak mohou být použity k tomu, aby pomohly lépe porozumět farmakologické odpovědi na intervenci a podle toho upravit terapii.

Biomarkery byly rozhodující pro studie patogeneze onemocnění a vývoj nových terapií těžkého astmatu. Zejména biomarkery zánětu typu 2 se ukázaly jako cenné pro endotypizaci a zacílení nových biologických látek. Kvůli těmto úspěchům v pochopení a označení zánětu 2. typu bude nedostatek znalostí o zánětlivých mechanismech jiného typu u astmatu brzy hlavní překážkou pro vývoj nových léčebných postupů a strategií léčby těžkého astmatu. Další potenciální biomarkery zahrnují vrozené lymfoidní buňky, IL-33 nebo thymický stromální lymfopoetin.

Nedávné publikace potvrdily zásadní regulační úlohu miRNA v patomechanismu astmatu. Některé jednotlivé miRNA nebo jejich sady jsou příslibem pro jejich použití jako biomarkery astmatu usnadňující diagnostiku nebo predikci výsledků léčby. Jsou také možným cílem budoucích terapií. Studie v této oblasti však chybí. Nedávno bylo prokázáno, že většina zapojených miRNA zvyšuje sekreci Th2 cytokinů, snižuje sekreci Th1 cytokinů, podporuje diferenciaci T buněk vůči Th2 nebo hraje roli při hyperplazii a hypertrofii buněk hladkého svalstva průdušek. Profily miRNA korelují s klinickými charakteristikami, včetně funkce plic, fenotypu a závažnosti astmatu.

Většina průmyslově sponzorovaných biologických klinických studií účinně využívala výše uvedený přístup výběrem subjektů studie, které se podobají klinickému fenotypu těžkého astmatu SARP (režimy s vysokou intenzitou kontrolující medikace, časté exacerbace a nízké plicní funkce), ale pak vyžadují zvýšený biomarker (např. krev, vydechovaný plyn nebo sputum), které by měly identifikovat pacienty, kteří s největší pravděpodobností reagují na specifický imunomodulátor v rámci těchto klinických fenotypů. Biologické látky v nedávno publikovaných klinických studiích se zaměřují na zánětlivé dráhy typu 2 a omezují účast na subjekty se zvýšenými biomarkery typu 2 (eozinofily v krvi nebo sputu nebo FeNO). Post hoc analýzy respondérů na „skupinové“ biomarkery za účelem lepšího pochopení toho, kteří pacienti mají největší přínos z biologického imunomodulátoru, povedou k pochopení, že souběžné zvýšení více než 1 zánětlivého biomarkeru typu 2 může dále identifikovat pacienty s „vysokou odezvou“.

Hypotéza zahrnuje účinnost léčby mepolizumabem u pacientů s těžkým eozinofilním astmatem s pozdním nástupem a fixní obstrukcí a vztah ke klinickým a zánětlivým biomarkerům.

Výzkumné otázky Došlo k nějakému zlepšení v četnosti exacerbací u pacientů s těžkým eozinofilním astmatem s pozdním nástupem léčby mepolizumabem během 1. roku léčby a jaké jsou charakteristiky non-responderů a super-responderů? Existuje nějaké zlepšení v remodelaci buněk hladkého svalstva? Existují nějaké biomarkery pro predikci odpovědi na léčbu mepolizumabem u pacientů s těžkým eozinofilním astmatem s pozdním nástupem? Je nějaké zlepšení respiračních parametrů? Dochází k nějakému zlepšení kontroly astmatu a kvality života pacientů? Cíle

Primární cíle této studie jsou:

1. Prokázat účinek léčby mepolizumabem na četnost exacerbací u pacientů s těžkým eozinofilním astmatem s pozdním nástupem a fixní obstrukcí.
2. Identifikovat charakteristiky non-responderů a super-responderů.

Hlavní sekundární cíle této studie jsou:

1. Jakékoli zlepšení remodelace (ztluštění buněk hladkého svalstva průdušek).
2. Jakékoli možné biomarkery odezvy.
3. Jakékoli zlepšení respiračních parametrů při kontrole astmatu a v kvalitě života pacientů během léčby mepolizumabem u pacientů s těžkým eozinofilním astmatem s pozdním nástupem a fixní obstrukcí.

Návrh studie a metody Pacienti budou shromážděni z ambulancí pro bronchiální astma z každého místa (v počtu 8), které pokrývají populaci Řecka. Všechny tyto kliniky jsou zahrnuty, aby posílily nábor a zahrnovaly odborníky na bronchoskopy s mezinárodním dosahem. Vzhledem k současné situaci týkající se pandemie Covid-19 vyšetřovatelé předpokládají, že tato klinická studie nezasahuje do pracovní zátěže na našich klinikách.

Celkově se jedná o prospektivní multicentrickou studii zahrnující osm plicních klinik. Pět plicních univerzitních klinik, dvě Národního zdravotnického systému a jedna armádní všeobecná nemocnice.

Studie bude zahrnovat období screeningu v délce až 2 týdnů pro posouzení způsobilosti a získání písemného informovaného souhlasu, období léčby mepolizumabem v délce 52 týdnů, jednou za 4 týdny, včetně následných návštěv každé 3 měsíce během léčby.

Populaci studie bude tvořit 45 pacientů s pozdním nástupem těžkého eozinofilního astmatu a fixní obstrukcí užívajících mepolizumab ve věku 20 a více let.

Účast na studii, hodnocení a následné sledování:

Screening: Vyšetřovatelé provedou screening vybraných subjektů na zúčastněných klinikách (ambulancích pro těžké astma). Subjekty přijdou podepsat souhlas. Během screeningu bude provedeno klinické hodnocení a postupy a strukturální rozhovory. Subjekty, které jsou způsobilé/schopné dokončit screeningovou návštěvu, tak mohou učinit ve stejný den, a pokud je to nutné, dokončí své základní hodnocení do 2 týdnů. U subjektů s probíhající exacerbací astmatu by měla být návštěva screeningu a zahájení léčby odložena, dokud zkoušející neuváží, že se subjekt vrátil do výchozího stavu astmatu. Pokud uplynulo 2týdenní období screeningu, měl by být subjekt považován za neúspěšného. Subjekty zůstanou na své současné udržovací terapii během období screeningu. Způsobilost pacientů bude vycházet z kritérií uvedených v následujících částech.

Anamnéza exacerbace astmatu za posledních 12 měsíců bude hlášena při screeningové návštěvě. Také exacerbace budou hodnoceny při každé návštěvě, jak bylo hlášeno.

Vitální funkce budou prováděny při screeningové návštěvě, na začátku a každé 3 měsíce. Měření bude zahrnovat systolický a diastolický krevní tlak, tepovou frekvenci a tělesnou teplotu.

Při screeningových návštěvách bude měřena výška v centimetrech (cm) a tělesná hmotnost v kilogramech (kg). Index tělesné hmotnosti (BMI) se vypočítá jako hmotnost v kg dělená výškou v metrech na druhou

Laboratorní vyšetření (hematologie, krevní chemie, analýza moči):

Venózní krev a moč budou odebírány na začátku. Hematologie: Hemoglobin, hematokrit, počet červených krvinek, počet bílých krvinek s diferenciálem a krevní destičky budou měřeny v laboratořích každé nemocnice. Bude hodnocena základní klinická chemie a analýza moči. Odběr moči u žen bude také hodnotit těhotenství.

Hladiny IgE budou vyhodnoceny při screeningové návštěvě pomocí imunoCAP testů a budou uvedeny jako IU/ml.

Budou poskytnuty následující dotazníky: 1) dotazník kontroly astmatu (ACQ-5) a test kontroly astmatu (ACT) k posouzení současné kontroly astmatu; 2) Astma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) k posouzení kvality života a psychické morbidity. K dalšímu posouzení kvality spánku 1) Aténská škála nespavosti (AIS), 2) Epworthova škála ospalosti (ESS), 3) St. George's Respiratory Questionnaire (SGRQ) a 4) index pohody WHO (pěti) (WHO-5), 5) Stupnice závažnosti únavy (FSS).

Vydechovaný oxid dusnatý (NO) bude měřen na začátku a každé 3 měsíce podle pokynů American Thoracic Society a podle specifikací výrobce. Úrovně FeNO budou uváděny jako částice na miliardu. Před provedením spirometrie budou provedena měření.

Vzorky žilní krve budou odebírány mezi 8. a 10. hodinou ráno, na začátku léčby a každé 3 měsíce během 52týdenního období léčby mepolizumabem. Absolutní počet eozinofilů v krvi bude uveden jako počet buněk/μl.

Spirometrie: Spirometrie A bude prováděna s použitím vlastního zařízení při návštěvách (základní stav a každé 3 měsíce). Všechny návštěvy kliniky musí proběhnout ráno. Během léčebného období bude spirometrie splňovat aktuální směrnice ATS/ERS a spirometr musí vytisknout všechna vygenerovaná data, která by měla být uložena v poznámkách subjektu. Spirometr bude kalibrován v souladu s pokyny výrobce. Spirometrie musí být provedena ve stejnou dobu (±1 hodina) se spirometrií návštěvy 0. Subjekty by se měly pokusit vysadit krátkodobě působící beta-2-agonisty (SABA) na ≥ 4 hodiny a LABA na ≥ 15 hodin před návštěvou kliniky, pokud je to možné (GINA 2019). Zaznamenávaná hodnocení budou zahrnovat FEV1, FVC, FEV1/FVC %, PEF a FEF25-75. Měření po bronchodilataci budou prováděna při každé návštěvě s použitím 200-400 mcg albuterolu nebo ekvivalentu.

Spirometrie B bude prováděna s použitím vlastního zařízení na místě při návštěvách (základní stav, po 6 měsících a po léčbě v časovém bodě 52 týdnů). Spirometrie B zahrnuje difuzi, plicní objemy a kapacity.

Impulzní oscilometrie (volitelné):

Impulzní oscilometrie (IOS) bude provedena na začátku a po 52 týdnech léčby. IOS zahrnuje odpor při 5 Hz-odpor při 20 Hz (R5-R20), měřítko odrážející respirační odpor malých až středně velkých vodivých a periferních dýchacích cest, AX, měřítko odrážející roztažnost periferních plic (jmenovitě parenchymu a malých periferních dýchacích cest) a reaktance dýchacího systému (X5), což je míra odrážející inertanci a elasticitu nebo kapacitu (včetně malých periferních dýchacích cest).

Biologická léčba:

Po dokončení screeningových návštěv může účastník do měsíce zahájit léčbu biologickou terapií (mepolizumab). Během terapie budou subjekty v péči pneumologa, který je poslal do výzkumné skupiny k účasti na studii. Tito pulmonologové budou označováni jako 'asociovaní pulmonologové. Ošetření bude provedeno podle pokynů výrobce produktu.

Pneumologové poskytující biologickou léčbu během studie budou vyžadovat podepsání souhlasu s prováděním studie v souladu s protokolem, potvrzení, že je odpovědný za lékařské chování a vedení studie, a zajistí, aby spolupracovník (a jejich kolegové a zaměstnanci) pomáhající při provádění studie jsou informováni o svých povinnostech. Budou zavedeny mechanismy, které zajistí, že přidružení pracovníci obdrží od výzkumné skupiny v průběhu studie příslušné informace a podporu.

Sledování během biologické léčby: Při zahájení a při každé návštěvě pro podání biologické léčby bude sběr informací proveden přidruženým pneumologem a s podporou výzkumné skupiny, pokud o to přidružený pneumolog požádá, např. výzkumní pracovníci telefonicky nebo osobně. obličejový kontakt provede rozhovor s pacientem. Kromě toho bude compliance zaznamenávána od lékaře na základě ústního potvrzení pacienta. Při každé návštěvě bude zaznamenána forma podání léku, okamžité a opožděné nežádoucí účinky.

Monitorování bezpečnosti:

Zaznamenané nežádoucí příhody (AE) budou monitorovány a srovnávány podle požadavků ve zprávách ze studií. Nežádoucí příhoda je objevení se nebo zhoršení jakéhokoli nežádoucího příznaku, symptomu nebo zdravotního stavu, ke kterému dojde po zahájení vstupu do studie. Zdravotní stavy/onemocnění přítomné před zahájením léčby studovaným lékem jsou považovány za nežádoucí účinky pouze tehdy, pokud se zhorší po zahájení léčby studovaným lékem. Abnormální laboratorní hodnoty nebo výsledky testů představují nežádoucí příhody pouze v případě, že vyvolávají klinické známky nebo symptomy, jsou považovány za klinicky významné nebo vyžadují léčbu. Zahrnuty jsou také nežádoucí příhody související s Covid-19. Pokud partnerský pneumolog nebo výzkumní pracovníci zjistí AE související s produktem, může to být oznámeno výrobci podle jejich místní standardní praxe pro spontánní hlášení AE. Kopie zprávy by měla být zaslána také koordinátorovi studie. Závažné nežádoucí příhody (SAE) budou hlášeny na stránkách eCRF a do 24 hodin budou mít všichni vyšetřovatelé povinnost informovat Ústřední výbor v Soluni. Poté bude ústřední výbor informovat vědeckou radu a Řeckou lékařskou agenturu. Také lékařský a vědecký úsudek bude uplatňován hlavním zkoušejícím každého centra s Ústředním výborem při rozhodování, zda má subjekt léčbu ukončit či nikoli.

Zpráva o těhotenství:

Zpočátku si pacientky při screeningu budou muset udělat těhotenský test. Pokud nám žena během léčby oznámí těhotenství, bude požádána, aby ze studie odstoupila (aby se předešlo zkreslení). Poté bude dotázána, zda by chtěla pokračovat v léčbě mimo tento protokol a být sledována na ambulance každého centra.

Předběžné prověřování a selhání prověřování:

Subjektům bude přiděleno číslo studie při podpisu souhlasu. Subjekty, které podepsaly, ale nepostoupily do hodnocení screeningových návštěv, budou považovány za neúspěšné před screeningem. U těchto subjektů nebudou do databáze zachycena žádná data.

Jedinci, kteří dokončí alespoň jednu ze dvou screeningových návštěv, ale nezahájí biologickou léčbu, budou označeni jako neúspěšní ve screeningu. Informace, které mají být shromažďovány pro předběžné prověřování a selhání prověřování, budou podrobně uvedeny v dokončení databáze.

Návštěva při odstoupení od smlouvy:

Pokud se účastník rozhodne odstoupit ze studie během sledování (z jakéhokoli jiného důvodu, než je ztráta sledování), může být požádán, aby se zúčastnil návštěvy pro ukončení (pokud to zkoušející považuje za nutné a pod podmínkou souhlasu). Během návštěvy mohou být účastníkovi položeny otázky týkající se jejich aktuálního stavu v rámci shromažďování klinických informací, jako jsou: astma a nosní symptomy, exacerbace a postup léčby.

Odběr a zpracování krevních vzorků:

Vzorky krve budou odebrány při základní návštěvě, po 6 měsících a po dokončení léčby. Po odběru vzorků krve budou ponechány v klidu asi půl hodiny, aby se úplně vytvořily sraženiny. Vzorek bude poté odstředěn, aby se oddělilo sérum od sraženiny. Po odstředění bude sérum skladováno při -20 °C v Eppendorfových zkumavkách, dokud nebude provedena analýza. Fenotypizace krve bude také hodnocena průtokovou cytometrií.

Indukovaný sputum (volitelné):

Indukované sputum bude provedeno na počátku léčby před zahájením léčby a po jejím dokončení podle zprávy ERS Task Force, kde je navrženo podrobné doporučení pro zpracování indukovaného sputa založené na odborném konsenzu.

Při návštěvách bude po dokončení rutinních spirometrických vyšetření provedena indukce sputa.

Indukované sputum bude zpracováno do dvou hodin po ukončení indukční procedury na výzkumném místě. Buňky sputa a supernatant buněčné suspenze budou pro analýzu skladovány při -80ºC. Po odebrání indukovaného sputa bude supernatant vzorku uchováván při -20 °C v Eppendorfových zkumavkách, dokud nebude provedena analýza. Po těchto postupech následuje laboratorní hodnocení sputa podle pokynů.

Bronchoskopie, bronchiální biopsie a odběr a zpracování promývacích vzorků (volitelné): Při návštěvách bude na základě písemného souhlasu pacienta provedena endoskopie s bronchiálními biopsiemi, bronchiálním výplachem vzorku (návštěva 0b). Konkrétně bude zahrnut samostatný informativní souhlas, který bude podepsán každým pacientem. Bronchoskopie bude provedena ve dvou časových bodech (základní stav před zahájením léčby a po dokončení léčby). Flexibilní bronchoskopie a diagnostické techniky byly prováděny pod monitorovanou anestezií podle doporučení American Thoracic Society a British Thoracic Society.

Vzorky tkání budou fixovány nafouknutím nebo ponořením pomocí formaldehydu nebo glutaraldehydu a zalité do parafínu. Dýchací cesty budou systematicky odebírány nebo získávány během diagnostické pitvy podle uvážení patologa. Z každého bloku byly vyříznuty po sobě jdoucí řezy o tloušťce 0,5, 5 a 30 μm a obarveny pomocí Massonovy trichromové techniky, hematoxylinu a eosinu, respektive hematoxylinu. Imunohistochemické barvení bude provedeno s následujícími mAb: anti-mastocytární tryptázový klon AA1 (Dako UK), anti-alfa aktinový klon hladkého svalstva 1A4 (Dako UK), anti-eozinofilní hlavní bazický proteinový klon BMK-13 (Monosan, Nizozemsko ), byly použity anti-neutrofilní elastáza klon NP57 (Dako UK) a anti-endotelový klon EN4 (Monosan, Nizozemsko) nebo vhodné izotypové kontroly.

Endobronchiální biopsie budou hodnoceny jediným pozorovatelem zaslepeným klinickými charakteristikami (software pro analýzu obrazu ZEN 2012 pro světelnou mikroskopii, Carl Zeiss AG, Německo) a budou vyjádřeny jako průměr měření provedených z minimálně dvou řezů buď z nezávislých biopsie nebo jako nesouvislé tkáňové řezy vzdálené alespoň 20 μm od stejné biopsie. Integrita epitelu bude hodnocena měřením délek intaktního a obnaženého epitelu. Ty budou vyjádřeny jako procento celkové délky retikulární bazální membrány (RBM). Vaskularita bude měřena pomocí Chalkleyova počtu, což je náhrada jak hustoty cév, tak vaskulární oblasti. Okulárová mřížka Chalkley (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, UK) bude použita na x200 k měření počtu Chalkley ve čtyřech nepřekrývajících se vaskulárních hotspotech (6). Obsah hladkého svalstva dýchacích cest bude stanoven jako podíl z celkové plochy. Zánětlivé buňky byly vyjádřeny jako počet buněk s jádry/plocha lamina propria.

Vzorky výplachu průdušek budou okamžitě převezeny do laboratoře, kde budou skladovány při -80 stupních. Vyšetření bronchiálních výplachových tekutin bude provedeno v pozdější fázi za účelem stanovení několika biomarkerů.

Analýza biomarkerů zánětu pomocí analýzy průtokové cytometrie (FACS) nebo ELIZA:

Biomarkery zahrnuté před a po léčbě mepolizumabem ve dvou nebo třech časových bodech (na začátku, po 6 měsících léčby a po návštěvě po ukončení léčby): podskupiny lymfocytů, cytokiny Th2/Th17, chemokiny, exprese mikroRNA, která má být kvantifikována průtokovou cytometrií nebo ELISA) v biologických tekutinách (krev, sérum, výplach průdušek, sputum a supernatant sputa).

Panelové soupravy a příslušné protilátky budou testovány průtokovou cytometrickou analýzou za použití systému BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) podle doporučení a pokynů výrobce.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) je testovací technika založená na destičkách navržená pro detekci a kvantifikaci látek, jako jsou peptidy, proteiny, protilátky a hormony. Soupravy ELISA budou analyzovány pomocí spektrofotometru VICTOR X3 podle doporučení a pokynů výrobce.

Testování alergie (pokud je to možné) Atopický stav pacientů bude hodnocen (pokud není k dispozici) při screeningové návštěvě kožním prick testem (SPT) na standardním panelu aeroalergenů pro detekci celkových IgE protilátek proti různým běžným inhalačním alergenům.

Databáze Platforma elektronického sběru dat bude metodou používanou ve výchozím stavu každé 3 měsíce až do 1 roku sledování této databáze. Papírové formuláře/dotazníky vyplní při léčebných návštěvách odborný pneumolog. Každý web zanese specifická data do elektronické databáze. Každý pacient je jednoznačně identifikován číslem subjektu, které se skládá z čísla místa přiděleného odpovědným monitorovacím místem a pořadového čísla přiděleného zkoušejícím. Po podepsání formuláře informovaného souhlasu je pacientovi zkoušejícím přiděleno další pořadové číslo. Místo musí kontaktovat centrální výzkumný personál a poskytnout požadované identifikační informace pro pacienta, jak je registrován v elektronické databázi. Formuláře léčebné návštěvy budou také zaslány pracovníkům centrálního výzkumu. Pověřený studijní personál bude odpovědný za sběr dat, úpravu a také ochranu shromažďovaných dat na jejich vlastním pracovišti a databáze je denně zálohována. Kontrola/kontrola kvality bude společnou odpovědností všech zúčastněných jednotlivců a centrálního výzkumného personálu [správce dat].

Výpočet velikosti vzorku Analýza výkonu G Velikost vzorku se vypočítá pomocí softwaru G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Německo). Rozdíl v roční míře exacerbací u pacientů s pozdním nástupem těžkého eozinofilního astmatu před a po léčbě mepolizumabem je primárním cílovým parametrem studie. Ve studii DREAM (jedné z mála dvou studií, které dosud uváděly výsledky podobné našemu primárnímu cíli) bylo hlášeno, že roční míra exacerbací u pacientů s těžkým astmatem klesla z 3,6 na 1,33 po zahájení léčby mepolizumabem. Pomocí těchto dat a oboustranného testu se silou 0,95 a hladinou statistické významnosti 0,05 vyšetřovatelé vypočítali velikost účinku 0,556, což indikovalo celkovou velikost vzorku 45 účastníků.

Statistická analýza plánu Statistická analýza bude provedena pomocí SPSS (verze 21.0 IBM SPSS statistický software, Armonk, NY, USA). Kategoriální proměnné budou uvedeny jako čísla (n) a procenta (%), spojité proměnné jako průměr ± SD, pokud je normálně rozděleno, nebo medián a interkvartilní rozsahy, pokud tomu tak není. V případě potřeby budou transformovány proměnné bez normálního rozdělení. P < 0,05 bylo přijato jako statisticky významné. Shapiro-Wilkův test bude proveden za účelem oddělení parametrických proměnných od neparametrických. Test Paired-Samples T pro parametrické nebo Wilcoxon Signed Ranks test pro neparametrické proměnné bude použit k detekci rozdílů v proměnných měřených před a po léčbě mepolizumabem.

Neexistuje žádné srovnávací rameno, protože každý pacient má kontrolu sám nad sebou. Existují základní charakteristiky (klinické a laboratorní biomarkery), které se budou měřit na začátku, každé 3 měsíce a po 52 týdnech dokončení léčby. Cílové body studie zahrnují analýzu všech těchto biomarkerů jako identifikaci charakteristik non-responderů a super-responderů. Sekundární koncové body také zahrnují hodnocení biomarkerů uvedených v metodách jako hodnocení. Na počátku bude provedena statistická analýza s počtem pacientů, kteří dokončili 52týdenní období léčby. Za druhé, pacienti, kteří nedokončili 52týdenní léčbu, budou analyzováni samostatně a nakonec budou tyto dvě skupiny vzájemně porovnány.

Konkrétněji, pomocí jednorozměrné analýzy (dvoustranné nezávislé testy vzorků) budou vyšetřovatelé testovat asociace/korelace mezi všemi výchozími výsledky ve srovnání s těmi po léčbě mepolizumabem (každé 3 měsíce až do 1 roku léčby): biomarkery ve sputu a v krvi , klinické výsledky. Podobně budou testovány jednorozměrné asociace mezi výsledky a osobními/demografickými charakteristikami za účelem identifikace potenciálních zmatků. Významné souvislosti budou následně testovány pomocí upravených regresních modelů. Asociace/korelace budou vyhodnoceny samostatně při výchozích klinických charakteristikách a každé 3 měsíce sledování během léčby, stejně jako na začátku a po 1 roce léčby mepolizumabem. Kromě toho bude pro každý biomarker provedena analýza podskupin za účelem identifikace úrovně biomarkeru vůči odpovědi na léčbu.

Test Paired-Samples T pro parametrické nebo Wilcoxon Signed Ranks test pro neparametrické proměnné bude použit k detekci rozdílů v proměnných měřených před a po léčbě mepolizumabem. Konkrétně budou hladiny biomarkerů na začátku porovnány s hladinami po 1 roce léčby mepolizumabem.

Celková odpověď na léčbu za jeden rok (od výchozího stavu do 1 roku po zahájení léčby) pro každý výsledek bude měřena párovým testem závislých vzorků (parametrické a neparametrické párové testy) u každého pacienta. Poté bude odpověď na léčbu definována jako změna (absolutní a % změna) výsledku za jeden rok. Vyšetřovatelé vyhodnotí prediktory ovlivňující odpověď na léčbu (změnu), jako jsou biomarkery, pomocí vícenásobných regresních modelů pro každý klinicko-patologický výsledek. Pro výsledky s více než 2 pozorováními na subjekt během studijního období výzkumníci použijí smíšené modely využívající opakovaná měření výsledku. Všechny testy budou 2-stranné s hladinou statistické významnosti 5 %.