Eficácia do Mepolizumabe em Asmáticos Graves (MESILICO) (MESILICO)

Justificativa científica A interleucina (IL)-5 é a principal citocina responsável pela ativação dos eosinófilos, por isso estratégias terapêuticas têm sido investigadas e desenvolvidas para uso clínico. Biológicos direcionados à IL-5 e seu receptor (primeiro mepolizumabe e posteriormente, reslizumabe e benralizumabe) foram recentemente aprovados e usados ​​como terapia complementar para asma eosinofílica grave, resultando em redução na contagem de eosinófilos circulantes, melhora na função pulmonar e exacerbação redução em pacientes com asma grave.

A resposta às terapias biológicas na asma grave é variável, com os pacientes sendo não respondedores, respondedores ou super respondedores. Atualmente, não há explicação para essa ampla variação na resposta. É importante examinar se esses pacientes têm características distintas que possam ajudar o médico assistente a fazer o diagnóstico correto na prática clínica.

O objetivo deste estudo clínico é avaliar a eficácia do mepolizumabe, um anticorpo monoclonal antagonista da IL-5 humanizado em pacientes com asma eosinofílica grave de início tardio com obstrução fixa e identificar as características dos não respondedores e superrespondentes ao tratamento com mepolizumabe. Este estudo é considerado não intervencional e todos os procedimentos incluídos estão ocorrendo na rotina clínica para o diagnóstico e fenotipagem dos pacientes asmáticos.

Vários métodos são usados ​​para investigar a inflamação das vias aéreas: medições diretas (como biópsias brônquicas ou lavagens broncoalveolares) e métodos indiretos (como avaliação de sintomas, análise de amostras de sangue e testes de função pulmonar). As técnicas diretas têm a vantagem de avaliar de forma confiável a inflamação das vias aéreas, mas são invasivas e inviáveis ​​em larga escala devido ao desconforto do paciente e ao risco incorrido. Quanto aos métodos indiretos, eles se correlacionam mal com a avaliação direta da inflamação das vias aéreas.

Neste estudo, entre as características clínicas dos pacientes, serão avaliados a espirometria, os biomarcadores de inflamação (eosinófilos sanguíneos, FeNO, níveis de IgE), a oscilometria de impulso (IOS) e o espessamento da membrana basal via broncoscopia. Sugere-se que pacientes asmáticos eosinofílicos graves de início tardio com obstrução fixa que não respondem ao tratamento usual (ICS/LABA/LAMA) apresentem aumento da massa muscular lisa. No entanto, os efeitos precisos do aumento da massa muscular lisa das vias aéreas no estreitamento das vias aéreas não são conhecidos e podem variar com a gravidade da doença. Além disso, os biomarcadores de inflamação também serão avaliados antes e após 52 semanas de tratamento com mepolizumabe em fluidos biológicos (soro, escarro, sobrenadante de escarro e amostras brônquicas). Biomarcadores de inflamação são muito importantes para identificar respondedores e não respondedores.

Mais especificamente, o IOS foi introduzido como uma técnica alternativa para avaliar a função pulmonar com aplicação particular na asma. Esta técnica é não invasiva, facilmente realizada durante a respiração corrente e requer apenas uma cooperação mínima do paciente.

A coleta de escarro é outra maneira de coletar amostras de células das vias aéreas e permite a avaliação direta da inflamação das vias aéreas. Além disso, exemplos com sobrenadante de escarro incluem a análise de mediadores e a avaliação da atividade quimiotática da amostra para eosinófilos. As células da expectoração também podem ser analisadas por citometria de fluxo que permite, entre outros, a imunofenotipagem e triagem das células. Além disso, células de escarro podem ser cultivadas e sua produção de mediadores pode ser medida in vitro. Vale ressaltar que, neste caso, o conteúdo do mediador é diferente do que pode ser encontrado no sobrenadante do escarro. De fato, os mediadores no sobrenadante do escarro podem ser influenciados por secreções de células residentes nas vias aéreas e pela exsudação plasmática, ao contrário do modelo de cultura de células de escarro. Finalmente, a imunocitoquímica e a hibridização in situ também podem ser realizadas usando células de escarro.

Embora fenótipos, eosinófilos sanguíneos e níveis séricos de IgE tenham sido propostos para uso como referência, há uma dissociação entre o nível de células imunes sanguíneas e a reação imune do epitélio das vias aéreas, conforme confirmado em estudos anteriores. A coloração imuno-histoquímica do epitélio das vias aéreas para células imunes direcionadas tem sido usada para determinar vários tipos de inflamação das vias aéreas; no entanto, essa técnica raramente é usada em um ambiente clínico. Estudos anteriores revelaram a relativa segurança da realização de biópsias por broncoscopia em pacientes com asma grave. Entre as técnicas de amostragem usadas para o diagnóstico de tecidos, incluindo biópsias nasais, escovação nasal ou brônquica e lavagem broncoalveolar, a amostragem do epitélio brônquico guiada por broncoscopia fornece informações mais precisas sobre as células epiteliais e inflamatórias no contexto do tecido. É, portanto, uma ferramenta poderosa para selecionar os biológicos mais adequados em condições clínicas difíceis.

Além disso, a doença asmática caracteriza-se por um processo inflamatório crônico da mucosa, que resulta em alterações irreversíveis da parede brônquica, hoje conhecido como "remodelamento brônquico". A hiperplasia e/ou hipertrofia das fibras musculares lisas e glandulares, a hiperplasia das células caliciformes e o espessamento variável da membrana basal (MB) presente sob o epitélio respiratório fazem parte dessas alterações morfológicas. as mudanças geradas na interface epitélio-conectiva respondem por uma "resposta adaptativa" ao estresse inflamatório e à broncoconstrição esporádica. No entanto, os dados atuais sobre a reatividade da MB em pacientes asmáticos ainda são incompletos para uma avaliação precisa de seu envolvimento na patogênese e especificamente no remodelamento da parede brônquica, principalmente porque os depósitos de colágeno na lâmina reticular não estão correlacionados com o grau de gravidade da doença.

Além disso, é cada vez mais evidente que a asma grave não é uma doença única, conforme evidenciado pela variedade de apresentações clínicas, características fisiológicas e desfechos observados em pacientes com asma. Para entender melhor essa heterogeneidade, surgiu o conceito de fenotipagem e endotipagem da asma. A fenotipagem integra características biológicas e clínicas, desde características moleculares, celulares, morfológicas e funcionais até características orientadas para o paciente com o objetivo de melhorar a terapia. Em última análise, esses fenótipos evoluem para "endótipos" de asma, que combinam características clínicas com vias mecanísticas identificáveis. Os biomarcadores, definidos como características que podem ser medidas objetivamente e servem como um indicador de processos biológicos ou patogênese subjacentes, são cruciais na definição de fenótipos e endótipos. Na asma, polimorfismos genéticos, medidas da fisiologia das vias aéreas e níveis de mediadores inflamatórios na urina, sangue, escarro, tecido, gás exalado e condensado da respiração foram todos estudados como marcadores potenciais para melhorar e objetivar o diagnóstico e o tratamento da asma. O desenvolvimento dessas ferramentas nos permitirá fenotipar e endotipar os vários padrões clínicos descritos na asma, com o objetivo final de adequar a terapia com base em um perfil de biomarcador específico. Os biomarcadores podem então ser usados ​​para ajudar a entender melhor a resposta farmacológica a uma intervenção e ajustar a terapia de acordo.

Os biomarcadores têm sido críticos para estudos da patogênese da doença e para o desenvolvimento de novas terapias na asma grave. Em particular, os biomarcadores da inflamação do tipo 2 provaram ser valiosos para endotipagem e direcionamento de novos agentes biológicos. Devido a esses sucessos na compreensão e marcação da inflamação do tipo 2, a falta de conhecimento sobre os mecanismos inflamatórios não tipo 2 na asma será em breve o principal obstáculo para o desenvolvimento de novos tratamentos e estratégias de manejo na asma grave. Outros potenciais biomarcadores incluem células linfóides inatas, IL-33 ou linfopoietina estromal tímica.

Publicações recentes confirmaram o papel regulatório crucial dos miRNAs no patomecanismo da asma. Alguns miRNAs individuais ou seus conjuntos prometem seu uso como biomarcadores da asma, facilitando o diagnóstico ou a previsão dos resultados do tratamento. Eles também são possíveis alvos de futuras terapias. Os estudos neste campo são escassos embora. Recentemente, foi demonstrado que a maioria dos miRNAs envolvidos aumenta a secreção de citocinas Th2, diminui a secreção de citocinas Th1, promove a diferenciação de células T para Th2 ou desempenha um papel na hiperplasia e hipertrofia de células musculares lisas brônquicas. Os perfis de miRNAs se correlacionam com características clínicas, incluindo função pulmonar, fenótipo e gravidade da asma.

A maioria dos ensaios clínicos biológicos patrocinados pela indústria usou efetivamente a abordagem acima, selecionando sujeitos de estudo que se assemelham aos fenótipos clínicos de asma grave de SARP (regimes de medicação controladora de alta intensidade, exacerbações frequentes e baixa função pulmonar), mas que requerem um biomarcador elevado (em sangue, gás exalado ou escarro) que deve identificar os pacientes com maior probabilidade de responder a um imunomodulador específico dentro desses fenótipos clínicos. Os biológicos em ensaios clínicos publicados recentemente têm como alvo as vias inflamatórias do tipo 2 e restringem a participação a indivíduos com biomarcadores elevados do tipo 2 (sangue ou eosinófilos no escarro ou FeNO). Análises de resposta post hoc para "agrupar" biomarcadores para entender melhor quais pacientes têm o maior benefício de um imunomodulador biológico levará a um entendimento de que elevações simultâneas em mais de 1 biomarcador inflamatório tipo 2 podem identificar ainda mais pacientes com "alta resposta".

A hipótese inclui a eficácia do tratamento com mepolizumabe em pacientes asmáticos eosinofílicos graves de início tardio com obstrução fixa e relação com biomarcadores clínicos e inflamatórios.

Questões de pesquisa Existe alguma melhora na taxa de exacerbação em pacientes asmáticos eosinofílicos graves de início tardio sob tratamento com mepolizumabe durante o primeiro ano de tratamento e quais são as características dos não respondedores e dos superrespondentes? Existe alguma melhora na remodelação das células musculares lisas? Existem biomarcadores para prever a resposta ao tratamento com mepolizumabe em pacientes asmáticos eosinofílicos graves de início tardio? Há alguma melhora nos parâmetros respiratórios? Há melhora no controle da asma e na qualidade de vida dos pacientes? Objetivos

Os objetivos primordiais deste estudo são:

1. Demonstrar o efeito do tratamento com mepolizumabe na taxa de exacerbação em pacientes asmáticos eosinofílicos graves de início tardio com obstrução fixa.
2. Identificar características de não-respondedores e super-respondedores.

Os principais objetivos secundários deste estudo são:

1. Qualquer melhoria na remodelação (espessamento das células do músculo liso brônquico).
2. Quaisquer possíveis biomarcadores de resposta.
3. Qualquer melhora nos parâmetros respiratórios no controle da asma e na qualidade de vida dos pacientes durante o tratamento com mepolizumabe em pacientes asmáticos eosinofílicos graves de início tardio com obstrução fixa.

Desenho do estudo e métodos Os pacientes serão coletados nos ambulatórios de asma brônquica de cada local (8 em número) que cobrem a população da Grécia. Todas estas Clínicas são incluídas para reforçar o recrutamento, bem como para incluir especialistas em broncoscopistas com impacto internacional. Devido à situação atual relativa à pandemia de Covid-19, os investigadores assumem que este estudo clínico não interfere com a carga de trabalho nas nossas Clínicas.

No geral, este é um estudo multicêntrico prospectivo, incluindo oito clínicas pulmonares. Cinco Clínicas Pulmonares Universitárias, duas do Sistema Nacional de Saúde e um Hospital Geral do Exército.

O estudo incluirá um período de triagem de até 2 semanas para avaliar a elegibilidade e obter consentimento informado por escrito, um período de tratamento com mepolizumabe de 52 semanas, uma vez a cada 4 semanas, incluindo visitas de acompanhamento a cada 3 meses durante o tratamento.

A população do estudo consistirá em 45 pacientes com asma eosinofílica grave de início tardio e obstrução fixa recebendo mepolizumabe com 20 anos ou mais.

Participação no estudo, avaliação e acompanhamento:

Triagem: Os investigadores farão a triagem dos indivíduos selecionados para as clínicas participantes (ambulatórios de asma grave). Os sujeitos entrarão para assinar o consentimento. Avaliação clínica e procedimentos e entrevistas estruturais serão realizados durante a triagem. Os indivíduos elegíveis/capazes de concluir a visita de triagem podem fazê-lo no mesmo dia e, se necessário, concluirão sua avaliação inicial em 2 semanas. Indivíduos com exacerbação contínua da asma devem ter sua consulta de triagem e início do tratamento adiada até que o investigador considere que o indivíduo retornou ao seu estado inicial de asma. Se o período de triagem de 2 semanas tiver decorrido, o indivíduo deve ser considerado uma falha na triagem. Os indivíduos permanecerão em sua terapia de manutenção atual durante os períodos de triagem. A elegibilidade dos pacientes será baseada nos critérios listados nas próximas seções.

O histórico de exacerbação da asma nos últimos 12 meses será relatado na consulta de triagem. Além disso, as exacerbações serão avaliadas em cada visita, conforme relatado.

Os sinais vitais serão realizados na visita de triagem, na linha de base e a cada 3 meses. As medições incluirão pressão arterial sistólica e diastólica, pulsação e temperatura corporal.

A altura em centímetros (cm) e o peso corporal em quilogramas (kg) serão medidos nas visitas de triagem. O Índice de Massa Corporal (IMC) será calculado como o peso em kg dividido pela altura em metros ao quadrado

Avaliação laboratorial (Hematologia, Química do sangue, Urinálise):

Sangue venoso e urina serão coletados no início do estudo. Hematologia: Hemoglobina, hematócrito, contagem de glóbulos vermelhos, contagem de glóbulos brancos com diferencial e plaquetas serão medidos no laboratório do hospital de cada local. Química clínica básica e urinálise serão avaliados. A coleta de urina para mulheres também avaliará a gravidez.

Os níveis de IgE serão avaliados na consulta de triagem usando testes imunoCAP e serão relatados como UI/mL.

Serão aplicados os seguintes Questionários: 1) Questionário de Controle da Asma (ACQ-5) e Teste de Controle da Asma (ACT) para avaliar o controle atual da asma; 2) o Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) para avaliar qualidade de vida e morbidade psicológica. Para avaliar ainda mais a qualidade do sono 1) Escala de insônia de Atenas (AIS), 2) Escala de sonolência de Epworth (ESS), 3) Questionário respiratório de St. George (SGRQ) e 4) Índice de bem-estar da OMS (cinco) (OMS-5), 5) Escala de Gravidade da Fadiga (FSS).

O óxido nítrico exalado (NO) será medido na linha de base e a cada 3 meses de acordo com as Diretrizes da American Thoracic Society e conforme especificado pelo fabricante. Os níveis de FeNO serão relatados como partes por bilhão. As medições serão feitas antes da realização da espirometria.

Amostras de sangue venoso serão coletadas entre 8 e 10 horas, no início do estudo e a cada 3 meses durante o período de 52 semanas com tratamento com mepolizumabe. A contagem absoluta de eosinófilos no sangue será relatada como células/μl.

Espirometria: A espirometria A será realizada, utilizando equipamento próprio do local nas visitas (basal e a cada 3 meses). Todas as visitas clínicas devem ocorrer pela manhã. Durante o período de tratamento, a espirometria atenderá às diretrizes atuais da ATS/ERS e o espirômetro deve produzir uma impressão de todos os dados gerados, que devem ser armazenados nas anotações do paciente. O espirômetro será calibrado de acordo com as instruções do fabricante. A espirometria deve ser realizada ao mesmo tempo (±1 hora) da espirometria da Visita 0. Os indivíduos devem tentar suspender os beta-2-agonistas de ação curta (SABAs) por ≥4 horas e os LABAs por ≥15 horas antes da consulta clínica, se possível (GINA 2019). As avaliações a serem registradas incluirão FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF e FEF25-75. Medições pós-broncodilatador serão feitas a cada visita, usando 200-400mcg de salbutamol ou equivalente.

A espirometria B será realizada, usando equipamento próprio do local nas visitas (baseline, após 6 meses e após o tratamento no ponto de tempo de 52 semanas). A espirometria B inclui difusão, volumes e capacidades pulmonares.

Oscilometria de impulso (opcional):

A Osilometria de Impulso (IOS) será realizada no início e após 52 semanas de tratamento. IOS inclui resistência a 5 Hz-resistência a 20 Hz (R5-R20), uma medida que reflete a resistência respiratória de pequenas e médias vias aéreas periféricas e condutivas, AX, uma medida que reflete a distensibilidade dos pulmões periféricos (ou seja, o parênquima e pequenas vias aéreas periféricas) , e a reatância do sistema respiratório (X5), uma medida que reflete a inertância e elasticidade ou capacitância (incluindo pequenas vias aéreas periféricas).

Terapia com biológicos:

Após a conclusão das visitas de triagem, o participante pode iniciar o tratamento com terapia biológica (mepolizumab) dentro de um mês. Durante a terapia os sujeitos estarão sob os cuidados do pneumologista que os encaminhou ao grupo de pesquisa para participar do estudo. Esses pneumologistas serão denominados como 'pneumologistas associados'. O tratamento será fornecido de acordo com as instruções do fabricante do produto.

Os pneumologistas associados que fornecerem tratamento biológico durante o estudo deverão assinar um acordo para conduzir o estudo de acordo com o protocolo, reconhecer que ele/ela é responsável pela conduta médica e pela condução do estudo e garantir que o associado (e seus colegas e funcionários) que auxiliam na condução do estudo são informados sobre suas obrigações. Mecanismos serão implantados para garantir que a equipe associada receba as informações apropriadas e suporte do grupo de pesquisa durante o estudo.

Acompanhamento durante a terapia biológica: No início e em todas as visitas para administração da terapia biológica, a coleta de informações será realizada pelo pneumologista associado e com o apoio do grupo de pesquisa, se solicitado pelo pneumologista associado, por exemplo, pesquisadores por telefone ou pessoalmente contato facial entrevistará o paciente. Além disso, a adesão será registrada pelo médico com base na confirmação oral do paciente. A data e a forma de administração do medicamento serão registradas em cada visita, bem como os efeitos adversos imediatos e tardios.

Monitoramento de segurança:

Os eventos adversos (EAs) registrados serão monitorados e agrupados conforme exigido nos relatórios do estudo. Um evento adverso é o aparecimento ou agravamento de qualquer sinal, sintoma ou condição médica indesejável que ocorre após o início da entrada no estudo. Condições médicas/doenças presentes antes de iniciar o medicamento do estudo são consideradas eventos adversos apenas se piorarem após o início do medicamento do estudo. Valores anormais de laboratório ou resultados de testes constituem eventos adversos apenas se induzirem sinais ou sintomas clínicos, forem considerados clinicamente significativos ou exigirem terapia. Além disso, estão incluídos os eventos adversos relacionados ao Covid-19. Se um pneumologista parceiro ou equipe de pesquisa tomar conhecimento de um EA associado a um produto, ele poderá ser relatado ao fabricante de acordo com a prática padrão local para notificação espontânea de EAs. Uma cópia do relatório também deve ser enviada ao coordenador do estudo. Eventos adversos graves (SAE) serão relatados nas páginas do eCRF e dentro de 24 horas todos os investigadores terão a responsabilidade de informar o Comitê Central em Thessaloniki. Em seguida, o Comitê Central informará o conselho científico e a Agência Médica Grega. Além disso, o julgamento médico e científico será exercido pelo investigador principal de cada centro com o Comitê Central, ao decidir se o sujeito deve interromper o tratamento ou não.

Relatório de gravidez:

Inicialmente, as pacientes do sexo feminino na triagem terão que fazer um teste de gravidez. Durante o tratamento, se uma participante do sexo feminino relatar uma gravidez para nós, ela será solicitada a se retirar do estudo (para evitar viés). ambulatório de cada centro.

Falhas de pré-triagem e triagem:

Os indivíduos receberão um número de estudo no momento da assinatura do consentimento. Os indivíduos que assinaram, mas não progrediram para a avaliação das visitas de triagem, serão considerados uma falha pré-triagem. Nenhum dado será capturado no banco de dados para esses assuntos.

Os indivíduos que concluírem pelo menos uma das duas visitas de triagem, mas não iniciarem a terapia biológica, serão designados como falhas de triagem. As informações a serem coletadas para pré-triagem e triagem de falhas serão detalhadas no preenchimento do banco de dados.

Visita de Retirada:

Se um participante decidir se retirar do estudo durante o acompanhamento (por qualquer motivo que não seja a perda do acompanhamento), ele poderá ser solicitado a comparecer a uma visita de retirada (se considerado necessário pelo investigador e sujeito ao consentimento). Durante a visita, o participante pode ser questionado sobre suas condições atuais como parte da coleta de informações clínicas, como: asma e sintomas nasais, exacerbações e evolução do tratamento recebido.

Coleta e processamento de amostras de sangue:

Amostras de sangue serão coletadas na visita inicial, aos 6 meses e após o término do tratamento. Após a coleta das amostras de sangue, elas serão deixadas em repouso por cerca de meia hora para a formação completa do coágulo. A amostra será então centrifugada para separar o soro do coágulo. Após a centrifugação o soro será armazenado a -20° C em tubos eppendorf até a realização da análise. A fenotipagem sanguínea também será avaliada por citometria de fluxo.

Escarro induzido (opcional):

O escarro induzido será realizado na linha de base antes do início do tratamento e após a conclusão do tratamento de acordo com o relatório da Força-Tarefa da ERS, onde é sugerida uma recomendação detalhada baseada em consenso de especialistas para o processamento do escarro induzido.

Nas visitas, a indução de escarro será realizada após a conclusão das avaliações espirométricas de rotina.

O escarro induzido será processado em até duas horas após o término do procedimento de indução no local da pesquisa. As células de escarro e o sobrenadante da suspensão celular serão armazenados a -80ºC para análise. Após a coleta do escarro induzido, o sobrenadante da amostra será armazenado a -20° C em tubos eppendorf até a realização da análise. Seguindo esses procedimentos, a avaliação laboratorial do escarro é a próxima de acordo com as diretrizes.

Coleta e processamento de broncoscopia, biópsias brônquicas e amostras de lavagem (opcional): Nas consultas, endoscopia com biópsias brônquicas, amostra de lavagem brônquica (Visita 0b) será realizada mediante consentimento por escrito do paciente. Especificamente, um consentimento informado separado será incluído para ser assinado por cada paciente. A broncoscopia será realizada em dois momentos (linha de base antes do início do tratamento e após a conclusão do tratamento). A broncoscopia flexível e as técnicas diagnósticas foram realizadas sob cuidados anestésicos monitorados, conforme recomendado pela American Thoracic Society e pela British Thoracic Society.

As amostras de tecido serão fixadas em insuflação ou imersão com formaldeído ou glutaraldeído e embebidas em parafina. As vias aéreas serão sistematicamente amostradas ou obtidas durante a dissecção diagnóstica, a critério do patologista. Cortes consecutivos de 0,5, 5 e 30 μm de espessura foram cortados de cada bloco e corados usando a técnica de tricrômico de Masson, hematoxilina e eosina e hematoxilina, respectivamente. A coloração imuno-histoquímica será feita com os seguintes mAbs: antimastócitos triptase clone AA1 (Dako UK), anti-alfa músculo liso actina clone 1A4 (Dako UK), anti-eosinophil major basic protein clone BMK-13 (Monosan, Holanda ), clone de elastase anti-neutrófilo NP57 (Dako UK) e clone anti-endotélio EN4 (Monosan, Holanda) ou controles isotípicos apropriados foram usados.

As biópsias endobrônquicas serão avaliadas por um único observador cego para as características clínicas (software de análise de imagem ZEN 2012 para microscopia de luz, Carl Zeiss AG, Alemanha) e serão expressas como a média das medições realizadas a partir de um mínimo de duas seções de cortes independentes biópsias ou como cortes de tecido não contíguos com pelo menos 20 μm de distância da mesma biópsia. A integridade epitelial será avaliada medindo os comprimentos do epitélio intacto e desnudado. Estes serão expressos como porcentagem de todo o comprimento da membrana basal reticular (RBM). A vascularidade será medida usando a contagem de Chalkley, um substituto da densidade dos vasos e da área vascular. Uma retícula de ocular Chalkley (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, Reino Unido) será usada em x200 para medir a contagem de Chalkley em quatro hotspots vasculares não sobrepostos (6). O conteúdo de músculo liso das vias aéreas será determinado como a proporção da área total. As células inflamatórias foram expressas como o número de células nucleadas/área da lâmina própria.

As amostras de lavado brônquico serão imediatamente transportadas para o laboratório, para serem armazenadas a -80 graus. O exame dos fluidos de lavagem brônquica será realizado posteriormente para determinar vários biomarcadores.

Análise de biomarcadores de inflamação com Análise de Citometria de Fluxo (FACS) ou ELIZA:

Biomarcadores incluídos antes e após o tratamento com mepolizumabe em dois ou três momentos (no início do tratamento, aos 6 meses de tratamento e após a visita de conclusão do tratamento): subconjuntos de linfócitos, citocinas Th2/Th17, quimiocinas, expressão de microRNAs a serem quantificados por citometria de fluxo ou ELISA) em fluidos biológicos (sangue, soro, lavagem brônquica, escarro e sobrenadante de escarro).

Os kits de painel e os anticorpos apropriados serão testados por análise de citômetro de fluxo usando um sistema BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA), de acordo com as recomendações e instruções do fabricante.

ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima) é uma técnica de ensaio baseada em placas projetada para detectar e quantificar substâncias como peptídeos, proteínas, anticorpos e hormônios. Os kits ELISA serão analisados ​​usando o espectrofotômetro VICTOR X3 de acordo com as recomendações e instruções do fabricante.

Teste de alergia (se aplicável) O estado atópico dos pacientes será avaliado (se não disponível) na visita de triagem pelo teste cutâneo em picada (SPT) para um painel padrão de aeroalérgenos para detecção de anticorpos IgE totais contra vários alérgenos inalantes comuns.

Banco de dados Uma plataforma eletrônica de coleta de dados será o método usado na linha de base a cada 3 meses até o acompanhamento de 1 ano para esse banco de dados. Durante as visitas de tratamento, formulários/questionários em papel serão preenchidos pelo pneumologista associado. Cada site inserirá dados específicos em um banco de dados eletrônico. Cada paciente é identificado exclusivamente por um número de sujeito que é composto pelo número do local atribuído pelo local de monitoramento responsável e um número sequencial atribuído pelo investigador. Ao assinar o termo de consentimento livre e esclarecido, o investigador recebe o próximo número sequencial. O centro deve entrar em contato com o pessoal da pesquisa central e fornecer as informações de identificação solicitadas para o paciente conforme registrado no banco de dados eletrônico. Os formulários de visita de tratamento também serão enviados ao pessoal de pesquisa central. O pessoal autorizado do estudo será responsável pela coleta de dados, edição e também pela proteção dos dados coletados em seu próprio local e o backup do banco de dados é feito diariamente. A revisão/controle de qualidade será de responsabilidade conjunta de todos os indivíduos envolvidos e do pessoal de pesquisa central [guardião dos dados].

Cálculo do tamanho da amostra Análise do poder G O tamanho da amostra é calculado usando o software G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Alemanha). A diferença na taxa de exacerbação anual dos pacientes com asmáticos eosinofílicos graves de início tardio antes e após o tratamento com Mepolizumabe é o desfecho primário do estudo. No estudo DREAM (um dos dois únicos estudos que relataram resultados semelhantes ao nosso endpoint primário até agora), foi relatado que a taxa de exacerbação anual de pacientes com asma grave diminuiu de 3,6 para 1,33 após o início do tratamento com Mepolizumabe. Usando esses dados e um teste bilateral, com poder de 0,95 e nível de significância estatística de 0,05, os pesquisadores calcularam um tamanho de efeito de 0,556, que indicou um tamanho amostral total de 45 participantes.

Análise do Plano Estatístico A análise estatística será realizada usando o SPSS (software estatístico IBM SPSS versão 21.0, Armonk, NY, EUA). Variáveis ​​categóricas serão expressas como números (n) e porcentagens (%), variáveis ​​contínuas como média ± DP se normalmente distribuídas, ou mediana e intervalos interquartis caso contrário. Quando necessário, variáveis ​​sem distribuição normal serão transformadas. P < 0,05 foi aceito como estatisticamente significativo. O teste de Shapiro-Wilk será realizado para separar as variáveis ​​paramétricas das não paramétricas. O Teste T de Amostras Pareadas para paramétrico ou teste de Wilcoxon Signed Ranks para variáveis ​​não paramétricas será usado para detectar diferenças nas variáveis ​​medidas antes e depois do tratamento com Mepolizumabe.

Não há braço comparador, pois cada paciente é controlado por si mesmo. Existem características de linha de base (biomarcadores clínicos e laboratoriais) que serão medidos na linha de base, a cada 3 meses e após 52 semanas de tratamento. Os endpoints do estudo incluem a análise de todos esses biomarcadores como a identificação das características de não respondedores e super respondedores. Além disso, os endpoints secundários incluem a avaliação dos biomarcadores mencionados nos métodos como avaliações. A análise estatística será realizada inicialmente com o número de pacientes que completaram o período de 52 semanas de tratamento. Em segundo lugar, os pacientes que não completaram o tratamento de 52 semanas serão analisados ​​separadamente e, finalmente, esses dois grupos serão comparados entre si.

Mais especificamente, com análise univariada (testes de amostras independentes bilaterais), os investigadores testarão associações/correlações entre todos os resultados basais em comparação com os resultados após tratamentos com mepolizumabe (a cada 3 meses até 1 ano de tratamento): biomarcadores no escarro e no sangue , os resultados clínicos. Da mesma forma, associações univariadas entre resultados e características pessoais/demográficas serão testadas para identificar possíveis fatores de confusão. Associações significativas serão então testadas com modelos de regressão ajustados. Associações/correlações serão avaliadas separadamente nas características clínicas basais e a cada 3 meses de acompanhamento durante o tratamento, bem como na linha basal e após 1 ano de tratamento com mepolizumabe. Além disso, análises de subgrupos serão realizadas para cada biomarcador para identificação do nível do biomarcador para resposta ao tratamento.

O Teste T de Amostras Pareadas para paramétrico ou teste de Wilcoxon Signed Ranks para variáveis ​​não paramétricas será usado para detectar diferenças nas variáveis ​​medidas antes e depois do tratamento com Mepolizumabe. Especificamente, os níveis de biomarcadores na linha de base serão comparados aos níveis após 1 ano de tratamento com mepolizumabe.

A resposta geral ao tratamento em um ano (da linha de base até 1 ano após o início do tratamento) para cada resultado será medida com teste pareado de amostras dependentes (testes pareados paramétricos e não paramétricos) em cada paciente. Então, a resposta ao tratamento será definida como a mudança (mudança absoluta e %) do resultado em um ano. Os investigadores avaliarão os preditores que influenciam a resposta ao tratamento (mudança), como biomarcadores, usando modelos de regressão múltipla para cada resultado clínico-patológico. Para resultados com mais de 2 observações por sujeito durante o período do estudo, os investigadores usarão modelos mistos usando as medições repetidas do resultado. Todos os testes serão bilaterais com nível de significância estatística de 5%.