Werkzaamheid van Mepolizumab bij ernstige astma (MESILICO) (MESILICO)

Wetenschappelijke grondgedachte Interleukine (IL)-5 is het belangrijkste cytokine dat verantwoordelijk is voor de activering van eosinofielen, vandaar dat er therapeutische strategieën zijn onderzocht en ontwikkeld voor klinisch gebruik. Biologics gericht op IL-5 en zijn receptor (eerst mepolizumab en vervolgens reslizumab en benralizumab) zijn onlangs goedgekeurd en gebruikt als aanvullende therapie voor ernstige eosinofiele astma, resulterend in een vermindering van het aantal circulerende eosinofielen, verbetering van de longfunctie en exacerbatie afname bij patiënten met ernstig astma.

De respons op biologische therapieën bij ernstig astma is variabel, waarbij patiënten non-responders, responders of super-responders zijn. Er is momenteel geen verklaring voor deze grote variatie in respons. Het is van belang na te gaan of deze patiënten kenmerken hebben die de behandelend arts kunnen helpen bij het stellen van de juiste diagnose in de klinische praktijk.

Het doel van deze klinische studie is het evalueren van de werkzaamheid van mepolizumab, een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam tegen de IL-5-antagonist bij patiënten met laat optredend ernstig eosinofiel astma met vaste obstructie, en het identificeren van de kenmerken van non-responders en super-responders onder behandeling met mepolizumab. Deze studie wordt beschouwd als niet-interventioneel en elke procedure die wordt uitgevoerd, vindt plaats in een klinische routine voor de diagnose en fenotypering van astmapatiënten.

Er worden verschillende methoden gebruikt om luchtwegontsteking te onderzoeken: directe metingen (zoals bronchiale biopsieën of bronchoalveolaire lavages) en indirecte methoden (zoals symptoombeoordeling, bloedmonsteranalyse en longfunctietesten). De directe technieken hebben het voordeel dat ze de luchtwegontsteking betrouwbaar kunnen beoordelen, maar ze zijn invasief en niet op grote schaal haalbaar vanwege het ongemak voor de patiënt en het risico dat wordt gelopen. Wat de indirecte methoden betreft, deze correleren slecht met de directe beoordeling van luchtwegontsteking.

In deze studie zullen spirometrie, biomarkers van ontsteking (eosinofielen in het bloed, FeNO, IgE-waarden), impulsoscillometrie (IOS) en de verdikking van de basaalmembraan via bronchoscopie worden geëvalueerd. Er wordt gesuggereerd dat patiënten met ernstig eosinofiel astma met late aanvang en gefixeerde obstructie die niet reageren op de gebruikelijke behandeling (ICS/LABA/LAMA) verschijnen met een verhoogde gladde spiermassa. De precieze effecten van een verhoogde gladde spiermassa van de luchtwegen op luchtwegvernauwing zijn echter niet bekend en kunnen variëren met de ernst van de ziekte. Bovendien zullen biomarkers van ontsteking ook worden geëvalueerd voor en na een behandeling met mepolizumab van 52 weken in biologische vloeistoffen (serum, sputum, sputumsupernatant en bronchiale monsters). Biomarkers van ontsteking zijn erg belangrijk om responders op non-responders te identificeren.

Meer specifiek, IOS is geïntroduceerd als een alternatieve techniek om de longfunctie te beoordelen, met bijzondere toepassing op astma. Deze techniek is niet-invasief, gemakkelijk uit te voeren tijdens getijdenademhaling en vereist slechts minimale medewerking van de patiënt.

Sputumverzameling is een andere manier om cellen uit de luchtwegen te bemonsteren en maakt directe beoordeling van luchtwegontsteking mogelijk. Bovendien omvatten voorbeelden met sputumsupernatant de analyse van mediatoren en de beoordeling van de chemotactische activiteit van het monster voor eosinofielen. De sputumcellen kunnen ook worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie, wat onder andere immunofenotypering en celsortering mogelijk maakt. Bovendien kunnen sputumcellen worden gekweekt en kan hun mediatorproductie in vitro worden gemeten. Het is vermeldenswaard dat in dit geval de inhoud van de mediator verschilt van wat kan worden gevonden in sputumsupernatant. Mediatoren in sputumsupernatant kunnen inderdaad worden beïnvloed door secreties van in de luchtwegen aanwezige cellen en door plasma-exsudatie, in tegenstelling tot het sputumcelkweekmodel. Ten slotte kunnen immunocytochemie en in situ hybridisatie ook worden uitgevoerd met behulp van sputumcellen.

Hoewel fenotypes, eosinofielen in het bloed en serum-IgE-spiegels zijn voorgesteld voor gebruik als referentie, is er een dissociatie tussen het bloed-immuuncelniveau en de immuunreactie van het luchtwegepitheel, zoals bevestigd in eerdere studies. Immunohistochemische kleuring van luchtwegepitheel voor gerichte immuuncellen is gebruikt om verschillende soorten luchtwegontsteking te bepalen; deze techniek wordt echter zelden gebruikt in een klinische setting. Eerdere studies hebben de relatieve veiligheid aangetoond van het uitvoeren van bronchoscopiebiopten bij patiënten met ernstig astma. Van de bemonsteringstechnieken die worden gebruikt voor weefseldiagnose, waaronder nasale biopsieën, neus- of bronchiaal poetsen en bronchoalveolaire lavage, biedt bronchoscopie-geleide bronchiale epitheelbemonstering nauwkeurigere informatie over de epitheel- en ontstekingscellen in de weefselcontext. Het is dus een krachtig hulpmiddel voor het selecteren van de meest geschikte biologische geneesmiddelen in moeilijke klinische omstandigheden.

Bovendien wordt astmatische ziekte gekenmerkt door een chronisch slijmvliesontstekingsproces, dat resulteert in onomkeerbare veranderingen van de bronchiale wand, tegenwoordig bekend als "bronchiale remodellering". Hyperplasie en/of hypertrofie van klier- en gladde spiervezels, hyperplasie van slijmbekercellen en variabele verdikking van het basaalmembraan (BM) aanwezig onder het respiratoire epitheel maken deel uit van deze morfologische veranderingen. de veranderingen die worden gegenereerd op de epitheel-verbindende interface zijn verantwoordelijk voor een "adaptieve respons" op inflammatoire stress en sporadische bronchoconstrictie. De huidige gegevens over BM-reactiviteit bij astmapatiënten zijn echter nog steeds onvolledig voor een nauwkeurige beoordeling van de betrokkenheid ervan bij de pathogenese en in het bijzonder bij de remodellering van de bronchiën, voornamelijk omdat collageenafzettingen in lamina reticularis niet gecorreleerd zijn met de ernst van de ziekte.

Bovendien wordt het steeds duidelijker dat ernstige astma geen enkele ziekte is, zoals blijkt uit de verscheidenheid aan klinische presentaties, fysiologische kenmerken en uitkomsten die worden gezien bij patiënten met astma. Om deze heterogeniteit beter te begrijpen, is het concept van astma-fenotypering en endotypering ontstaan. Fenotypering integreert zowel biologische als klinische kenmerken, van moleculaire, cellulaire, morfologische en functionele tot patiëntgerichte kenmerken met als doel de therapie te verbeteren. Uiteindelijk evolueren deze fenotypes naar astma "endotypes", die klinische kenmerken combineren met identificeerbare mechanistische routes. Biomarkers, gedefinieerd als kenmerken die objectief kunnen worden gemeten en dienen als indicator van onderliggende biologische processen of pathogenese, zijn cruciaal bij het definiëren van fenotypes en endotypes. Bij astma zijn genetische polymorfismen, metingen van luchtwegfysiologie en niveaus van ontstekingsmediatoren in urine, bloed, sputum, weefsel, uitgeademd gas en ademcondensaat allemaal bestudeerd als potentiële markers om de diagnose en het beheer van astma te verbeteren en te objectiveren. Door dergelijke hulpmiddelen te ontwikkelen, kunnen we de verschillende klinische patronen beschreven bij astma fenotyperen en endotyperen, met als uiteindelijk doel de therapie op maat te maken op basis van een specifiek biomarkerprofiel. Biomarkers kunnen vervolgens worden gebruikt om de farmacologische reactie op een interventie beter te begrijpen en de therapie dienovereenkomstig aan te passen.

Biomarkers zijn van cruciaal belang geweest voor studies naar de pathogenese van ziekten en de ontwikkeling van nieuwe therapieën bij ernstig astma. Met name biomarkers van type 2-ontsteking zijn waardevol gebleken voor endotypering en het richten op nieuwe biologische agentia. Vanwege deze successen bij het begrijpen en markeren van type 2-ontsteking, zal een gebrek aan kennis over niet-type 2-ontstekingsmechanismen bij astma binnenkort het grootste obstakel vormen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen en beheersstrategieën bij ernstig astma. Andere potentiële biomarkers zijn onder meer aangeboren lymfoïde cellen, IL-33 of stromale lymfopoëtine van de thymus.

Recente publicaties bevestigden de cruciale regulerende rol van miRNA's in het pathomechanisme van astma. Sommige afzonderlijke miRNA's of hun sets houden de belofte in voor hun gebruik als biomarkers voor astma die de diagnose of voorspelling van behandelingsresultaten vergemakkelijken. Ze zijn ook mogelijk doelwit van toekomstige therapieën. De studies op dit gebied ontbreken echter. Onlangs is aangetoond dat de meeste van de betrokken miRNA's de secretie van Th2-cytokines verhogen, de secretie van Th1-cytokines verminderen, differentiatie van T-cellen naar Th2 bevorderen of een rol spelen bij hyperplasie en hypertrofie van bronchiale gladde spiercellen. De profielen van miRNA's correleren met klinische kenmerken, waaronder longfunctie, fenotype en ernst van astma.

De meeste door de industrie gesponsorde biologische klinische onderzoeken hebben de bovenstaande aanpak effectief gebruikt door proefpersonen te selecteren die lijken op de ernstige astma klinische fenotypes van SARP (medicatieregimes met hoge intensiteit, frequente exacerbaties en lage longfunctie), maar die vervolgens een verhoogde biomarker nodig hebben (in bloed, uitgeademd gas of sputum) die patiënten zouden moeten identificeren die het meest waarschijnlijk reageren op een specifieke immunomodulator binnen die klinische fenotypes. De biologische geneesmiddelen in recent gepubliceerde klinische onderzoeken richten zich op ontstekingsroutes van type 2 en beperken deelname tot proefpersonen met verhoogde type 2-biomarkers (bloed- of sputum-eosinofielen of FeNO). Post hoc responderanalyses om biomarkers te "groeperen" om beter te begrijpen welke patiënten het grootste voordeel hebben van een biologische immunomodulator, zullen leiden tot het inzicht dat gelijktijdige verhogingen in meer dan 1 type 2 inflammatoire biomarker "high responder" patiënten verder kunnen identificeren.

Hypothese omvat de werkzaamheid van behandeling met mepolizumab bij laat optredende ernstige eosinofiele astmapatiënten met gefixeerde obstructie en verband met klinische en inflammatoire biomarkers.

Onderzoeksvragen Is er enige verbetering in het aantal exacerbaties bij patiënten met ernstig eosinofiel astma met late aanvang die mepolizumab-behandeling ondergaan tijdens hun 1e behandelingsjaar en wat zijn de kenmerken van non-responders en super-responders? Is er enige verbetering in de remodellering van gladde spiercellen? Zijn er biomarkers om de respons op behandeling met mepolizumab te voorspellen bij patiënten met ernstig eosinofiel astma met late aanvang? Is er enige verbetering in de ademhalingsparameters? Is er enige verbetering in de astmacontrole en de kwaliteit van leven van de patiënt? Doelstellingen

De primaire doelstellingen van deze studie zijn:

1. Om het effect van behandeling met mepolizumab op het aantal exacerbaties aan te tonen bij patiënten met ernstig eosinofiel astma met late aanvang en gefixeerde obstructie.
2. Kenmerken van non-responders en super-responders identificeren.

De belangrijkste secundaire doelstellingen van deze studie zijn:

1. Elke verbetering in remodellering (verdikking van bronchiale gladde spiercellen).
2. Alle mogelijke biomarkers van respons.
3. Elke verbetering van de ademhalingsparameters bij de controle van astma en de kwaliteit van leven van de patiënt tijdens de behandeling met mepolizumab bij patiënten met ernstig eosinofiel astma met late aanvang en vaste obstructie.

Onderzoeksopzet en methoden Patiënten zullen worden opgehaald bij de poliklinieken voor bronchiale astma van elke locatie (8 in aantal) die de bevolking van Griekenland bestrijken. Al deze klinieken zijn opgenomen om de rekrutering te versterken en om bronchoscopisten met internationale impact op te nemen. Vanwege de huidige situatie met betrekking tot de Covid-19-pandemie gaan de onderzoekers ervan uit dat deze klinische studie de werkdruk in onze klinieken niet verstoort.

Over het algemeen is dit een prospectieve multicenter studie met inbegrip van acht longklinieken. Vijf Pulmonary University Clinics, twee van National Health System en één Army General Hospital.

Het onderzoek omvat een screeningperiode van maximaal 2 weken om te beoordelen of u in aanmerking komt en om schriftelijke geïnformeerde toestemming te verkrijgen, een behandelingsperiode met mepolizumab van 52 weken, eenmaal per 4 weken, inclusief vervolgbezoeken om de 3 maanden tijdens de behandeling.

De studiepopulatie zal bestaan ​​uit 45 patiënten met laat optredend ernstig eosinofiel astma en gefixeerde obstructie die mepolizumab krijgen van 20 jaar en ouder.

Studieparticipatie, beoordeling en opvolging:

Screening: Onderzoekers screenen geselecteerde proefpersonen naar de deelnemende klinieken (poliklinieken Ernstige Astma). Onderwerpen komen binnen om toestemming te ondertekenen. Tijdens de screening vinden klinische beoordeling en procedures en structurele interviews plaats. Proefpersonen die in aanmerking komen/in staat zijn om het screeningsbezoek af te ronden, kunnen dit op dezelfde dag doen en indien nodig zullen zij hun nulmeting binnen 2 weken voltooien. Proefpersonen met een aanhoudende astma-exacerbatie moeten hun bezoek aan de screening en de start van de behandeling uitstellen totdat de onderzoeker van mening is dat de proefpersoon is teruggekeerd naar hun basislijn-astmastatus. Als de screeningperiode van 2 weken is verstreken, moet de proefpersoon worden beschouwd als een screeningsfout. Proefpersonen blijven tijdens de screeningperiodes op hun huidige onderhoudstherapie. De geschiktheid van de patiënten zal worden gebaseerd op de criteria die in de volgende paragrafen worden vermeld.

Astma-exacerbatiegeschiedenis van de afgelopen 12 maanden zal worden gerapporteerd tijdens het screeningsbezoek. Ook zullen exacerbaties worden geëvalueerd bij elk bezoek zoals gerapporteerd.

Vitale functies worden uitgevoerd tijdens het screeningsbezoek, bij baseline en elke 3 maanden. Metingen omvatten systolische en diastolische bloeddruk, hartslag en lichaamstemperatuur.

Bij de screeningsbezoeken worden lengte in centimeters (cm) en lichaamsgewicht in kilogrammen (kg) gemeten. De Body Mass Index (BMI) wordt berekend als het gewicht in kg gedeeld door de lengte in meters in het kwadraat

Laboratoriumevaluatie (hematologie, bloedchemie, urineonderzoek):

Bij baseline wordt veneus bloed en urine verzameld. Hematologie: hemoglobine, hematocriet, aantal rode bloedcellen, aantal witte bloedcellen met differentieel en bloedplaatjes worden gemeten in het laboratorium van het ziekenhuis van elke locatie. Basis klinische chemie en urineanalyse zullen worden geëvalueerd. Het verzamelen van urine voor vrouwelijke proefpersonen zal ook de zwangerschap evalueren.

IgE-niveaus zullen tijdens het screeningsbezoek worden geëvalueerd met behulp van immunoCAP-tests en zullen worden gerapporteerd als IU/mL.

De volgende vragenlijsten worden afgenomen: 1) de Astma Controle Vragenlijst (ACQ-5) en de Astma Controle Test (ACT) om de huidige astmacontrole te beoordelen; 2) de Astma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) om de kwaliteit van leven en psychologische morbiditeit te beoordelen. Om de slaapkwaliteit verder te beoordelen 1) Athens Insomnia Scale (AIS), 2) Epworth Sleepiness Scale (ESS), 3) St. George's Respiratory Questionnaire (SGRQ) en 4) WHO (Five) Well-Being Index (WHO-5), 5) Vermoeidheidsernstschaal (FSS).

Uitgeademd stikstofmonoxide (NO) wordt bij aanvang en elke 3 maanden gemeten volgens de richtlijnen van de American Thoracic Society en zoals gespecificeerd door de fabrikant. FeNO-niveaus worden gerapporteerd als delen per miljard. Er worden metingen gedaan voordat spirometrie wordt uitgevoerd.

Veneuze bloedmonsters zullen worden afgenomen tussen 8 en 10 uur 's ochtends, bij baseline en elke 3 maanden gedurende de periode van 52 weken met behandeling met mepolizumab. Het absolute aantal eosinofielen in het bloed wordt gerapporteerd als cellen/μl.

Spirometrie: Spirometrie A wordt uitgevoerd met de eigen apparatuur van de locatie tijdens de bezoeken (baseline en elke 3 maanden). Alle bezoeken aan de kliniek moeten in de ochtend plaatsvinden. Tijdens de behandelingsperiode zal de spirometrie voldoen aan de huidige ATS/ERS-richtlijnen en moet de spirometer een afdruk maken van alle gegenereerde gegevens, die moeten worden opgeslagen in de aantekeningen van de proefpersoon. De spirometer wordt gekalibreerd volgens de instructies van de fabrikant. Spirometrie moet tegelijkertijd (±1 uur) met de Visit 0-spirometrie worden uitgevoerd. Proefpersonen moeten proberen kortwerkende bèta-2-agonisten (SABA's) gedurende ≥4 uur en LABA's gedurende ≥15 uur voorafgaand aan het bezoek aan de kliniek achterwege te laten, indien mogelijk (GINA 2019). De vast te leggen beoordelingen omvatten FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF en FEF25-75. Post-bronchusverwijdende metingen zullen bij elk bezoek worden uitgevoerd, met behulp van 200-400mcg albuterol of equivalent.

Spirometrie B zal worden uitgevoerd met behulp van de eigen apparatuur van de locatie tijdens de bezoeken (baseline, na 6 maanden en na behandeling na 52 weken). Spirometrie B omvat diffusie, longvolumes en capaciteiten.

Impulsoscillometrie (optioneel):

Impuls-osillometrie (IOS) zal worden uitgevoerd bij baseline en na 52 weken behandeling. IOS omvat weerstand bij 5 Hz - weerstand bij 20 Hz (R5-R20), een maatstaf die de ademhalingsweerstand van kleine tot middelgrote geleidende en perifere luchtwegen weergeeft, AX, een maatstaf die de rekbaarheid van de perifere longen weergeeft (namelijk het parenchym en de kleine perifere luchtwegen) , en de reactantie van het ademhalingssysteem (X5), een maatstaf die inertie en elasticiteit of capaciteit weergeeft (inclusief kleine perifere luchtwegen).

Therapie met biologische middelen:

Na voltooiing van de screeningsbezoeken kan de deelnemer binnen een maand een behandeling met biologische therapie (mepolizumab) starten. Tijdens de therapie staan ​​proefpersonen onder toezicht van de longarts die hen voor deelname aan het onderzoek naar de onderzoeksgroep heeft verwezen. Deze longartsen worden 'geassocieerde longartsen' genoemd. De behandeling zal plaatsvinden volgens de instructies van de fabrikant van het product.

Geassocieerde longartsen die tijdens het onderzoek biologische behandelingen geven, moeten een overeenkomst ondertekenen om het onderzoek uit te voeren in overeenstemming met het protocol, erkennen dat hij/zij verantwoordelijk is voor medisch gedrag en voor het uitvoeren van het onderzoek, en om ervoor te zorgen dat de medewerker (en hun collega's) en werknemers) die assisteren bij de uitvoering van het onderzoek worden geïnformeerd over hun verplichtingen. Er zullen mechanismen aanwezig zijn om ervoor te zorgen dat geassocieerd personeel tijdens het onderzoek de juiste informatie en ondersteuning van de onderzoeksgroep krijgt.

Follow-up tijdens biologische therapie: bij de start en bij elk bezoek voor biologische therapie zal het verzamelen van informatie worden uitgevoerd door de geassocieerde longarts, en met ondersteuning door de onderzoeksgroep op verzoek van de geassocieerde longarts, bijvoorbeeld onderzoekers via telefoon of face-to- face contact zal de patiënt interviewen. Bovendien zal de naleving door de arts worden vastgelegd op basis van de mondelinge bevestiging van de patiënt. Datum van toediening van het medicijn zal bij elk bezoek worden geregistreerd, evenals onmiddellijke en vertraagde bijwerkingen.

Veiligheidsbewaking:

Geregistreerde ongewenste voorvallen (AE's) zullen worden gecontroleerd en verzameld zoals vereist in onderzoeksrapporten. Een ongewenst voorval is het verschijnen of verergeren van een ongewenst teken, symptoom of medische aandoening die optreedt na aanvang van de deelname aan het onderzoek. Medische aandoeningen/ziekten aanwezig vóór het starten van het onderzoeksgeneesmiddel worden alleen als bijwerkingen beschouwd als ze verergeren na het starten van het onderzoeksgeneesmiddel. Abnormale laboratoriumwaarden of testresultaten vormen alleen bijwerkingen als ze klinische tekenen of symptomen veroorzaken, als klinisch significant worden beschouwd of therapie vereisen. Ook bijwerkingen gerelateerd aan Covid-19 zijn inbegrepen. Als een partner-longarts of onderzoekspersoneel zich bewust wordt van een AE die verband houdt met een product, kan dit aan de fabrikant worden gemeld volgens hun lokale standaardpraktijk voor spontane AE-rapportage. Ook dient een kopie van het verslag naar de studiecoördinator gestuurd te worden. Ernstige ongewenste voorvallen (SAE) zullen worden gerapporteerd op de eCRF-pagina's en binnen 24 uur hebben alle onderzoekers de verantwoordelijkheid om het Centraal Comité in Thessaloniki te informeren. Vervolgens zal het Centraal Comité de wetenschappelijke raad en het Griekse medische bureau informeren. Ook zal het medisch en wetenschappelijk oordeel worden uitgeoefend door de hoofdonderzoeker van elk centrum samen met de Centrale Commissie, om te beslissen of de proefpersoon de behandeling moet stoppen of niet.

Zwangerschapsrapport:

Vrouwelijke patiënten bij screening zullen in eerste instantie een zwangerschapstest moeten doen. Als een vrouwelijke proefpersoon tijdens de behandeling een zwangerschap bij ons meldt, wordt haar gevraagd zich terug te trekken uit het onderzoek (om bias te voorkomen). de polikliniek van elk centrum.

Voorscreening en screeningfouten:

Proefpersonen krijgen een studienummer toegewezen op het moment van ondertekening van de toestemming. Proefpersonen die hebben getekend maar niet doorgaan naar de beoordeling van de screeningbezoeken, worden beschouwd als een pre-screen mislukking. Voor deze onderwerpen worden geen gegevens vastgelegd in de database.

Proefpersonen die ten minste één van de twee screeningbezoeken voltooien, maar geen biologische therapie starten, worden aangemerkt als mislukte screening. Informatie die moet worden verzameld voor pre-screening en screeningfouten zal worden beschreven in de database-aanvulling.

Intrekkingsbezoek:

Als een deelnemer tijdens de follow-up besluit zich terug te trekken uit het onderzoek (om een ​​andere reden dan verlies voor follow-up), kan hem/haar worden gevraagd om een ​​terugtrekkingsbezoek bij te wonen (indien dit door de onderzoeker noodzakelijk wordt geacht en met toestemming). Tijdens het bezoek kunnen de deelnemer vragen worden gesteld over hun huidige toestand als onderdeel van het verzamelen van klinische informatie, zoals: astma en nasale symptomen, exacerbaties en de voortgang van de ontvangen behandeling.

Verzameling en verwerking van bloedmonsters:

Bloedmonsters zullen worden verzameld bij het basisbezoek, na 6 maanden en na voltooiing van de behandeling. Na het verzamelen van de bloedmonsters worden ze ongeveer een half uur met rust gelaten voor volledige stolselvorming. Het monster wordt vervolgens gecentrifugeerd om het serum van het stolsel te scheiden. Na centrifugeren wordt het serum bewaard bij -20°C in eppendorf-buisjes totdat de analyse is uitgevoerd. Bloedfenotypering zal ook worden geëvalueerd door middel van flowcytometrie.

Geïnduceerd sputum (optioneel):

Geïnduceerd sputum zal worden uitgevoerd bij baseline vóór aanvang van de behandeling en na voltooiing van de behandeling volgens het rapport van de ERS Task Force, waarin een gedetailleerde op consensus gebaseerde aanbeveling voor geïnduceerde sputumverwerking wordt voorgesteld.

Tijdens de bezoeken zal sputuminductie worden uitgevoerd nadat de routinematige spirometrische beoordelingen zijn voltooid.

Het geïnduceerde sputum wordt binnen twee uur na het einde van de inductieprocedure op de onderzoekslocatie verwerkt. Sputumcellen en supernatant van de celsuspensie worden voor analyse bij -80°C bewaard. Na het verzamelen van het geïnduceerde sputum wordt het supernatant van het monster bewaard bij -20°C in eppendorf-buisjes totdat de analyse is voltooid. Na deze procedures volgt laboratoriumevaluatie van het sputum volgens de richtlijnen.

Bronchoscopie, bronchiale biopsieën en het verzamelen en verwerken van wasmonsters (optioneel): Bij de bezoeken zal endoscopie met bronchiale biopsieën, bronchiaal wasmonster (bezoek 0b) worden uitgevoerd na schriftelijke toestemming van de patiënt. Concreet zal er een afzonderlijke geïnformeerde toestemming worden bijgevoegd die door elke patiënt moet worden ondertekend. Bronchoscopie zal op twee tijdstippen worden uitgevoerd (basislijn vóór aanvang van de behandeling en na voltooiing van de behandeling). Flexibele bronchoscopie en diagnostische technieken werden uitgevoerd onder gecontroleerde anesthesie, zoals aanbevolen door de American Thoracic Society en de British Thoracic Society.

Weefselmonsters worden opgeblazen of ondergedompeld met formaldehyde of glutaaraldehyde en ingebed in paraffine. Luchtwegen worden systematisch bemonsterd of verkregen tijdens diagnostische dissectie naar goeddunken van de patholoog. Opeenvolgende coupes van 0,5, 5 en 30 μm dikte werden uit elk blok gesneden en gekleurd met behulp van de Masson's trichroomtechniek, respectievelijk hematoxyline en eosine, en hematoxyline. Immunohistochemische kleuring zal worden gedaan met de volgende mAb's: anti-mestcel tryptase kloon AA1 (Dako UK), anti-alfa gladde spier actine kloon 1A4 (Dako UK), anti-eosinofiele major basic protein kloon BMK-13 (Monosan, Nederland ), anti-neutrofiel elastase kloon NP57 (Dako UK), en anti-endotheel kloon EN4 (Monosan, Nederland) of geschikte isotype controles werden gebruikt.

De endobronchiale biopsieën zullen worden beoordeeld door een enkele waarnemer die blind is voor de klinische kenmerken (ZEN 2012 beeldanalysesoftware voor lichtmicroscopie, Carl Zeiss AG, Duitsland) en zullen worden uitgedrukt als het gemiddelde van metingen uitgevoerd op minimaal twee secties, ofwel van onafhankelijke biopsieën of als niet-aangrenzende weefselsecties met een afstand van ten minste 20 μm van dezelfde biopsie. De integriteit van het epitheel zal worden beoordeeld door de lengte van intact en ontbloot epitheel te meten. Deze worden uitgedrukt als percentage van de totale lengte van het reticulaire basaalmembraan (RBM). Vasculariteit zal worden gemeten met behulp van de Chalkley-telling, een surrogaat van zowel vaatdichtheid als vasculair gebied. Een Chalkley-oculair-graticule (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, VK) zal worden gebruikt bij x200 om Chalkley-tellingen te meten in vier niet-overlappende vasculaire hotspots (6). De inhoud van de gladde spieren van de luchtwegen zal worden bepaald als het aandeel van het totale gebied. Ontstekingscellen werden uitgedrukt als het aantal cellen met kern/oppervlak van lamina propria.

Bronchiale spoelmonsters worden direct naar het laboratorium getransporteerd, waar ze bij -80 graden worden bewaard. Onderzoek van bronchiale wasvloeistoffen zal in een later stadium worden uitgevoerd om verschillende biomarkers te bepalen.

Analyse van biomarkers van ontsteking met Flow Cytometry Analysis (FACS) of ELIZA:

Biomarkers omvatten voor en na behandeling met mepolizumab op twee of drie tijdstippen (bij baseline, bij behandeling na 6 maanden en na voltooiing van de behandeling): subsets van lymfocyten, Th2/Th17-cytokines, chemokines, microRNA-expressie te kwantificeren met flowcytometrie of ELISA) in biologische vloeistoffen (bloed, serum, bronchiaal wassen, sputum en sputumsupernatant).

Panelkits en geschikte antilichamen zullen worden getest door middel van flowcytometeranalyse met behulp van een BD FACS Calibur-systeem (BD Biosciences, San Jose, CA), volgens de aanbevelingen en instructies van de fabrikant.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is een op platen gebaseerde testtechniek die is ontworpen voor het detecteren en kwantificeren van stoffen zoals peptiden, eiwitten, antilichamen en hormonen. ELISA-kits worden geanalyseerd met behulp van de VICTOR X3-spectrofotometer volgens de aanbevelingen en instructies van de fabrikant.

Allergietesten (indien van toepassing) De atopische status van de patiënt zal worden geëvalueerd (indien niet beschikbaar) tijdens het screeningbezoek door de huidpriktest (SPT) aan een standaardpanel van aeroallergenen voor het detecteren van totale IgE-antilichamen tegen verschillende veel voorkomende inhalatieallergenen.

Database Een elektronisch gegevensverzamelingsplatform zal de methode zijn die wordt gebruikt bij baseline om de 3 maanden tot 1 jaar follow-up voor deze database. Tijdens behandelbezoeken worden papieren formulieren/vragenlijsten ingevuld door de assistent-longarts. Elke site voert specifieke gegevens in een elektronische database in. Elke patiënt wordt uniek geïdentificeerd door een subjectnummer dat is samengesteld uit het sitenummer dat is toegewezen door de verantwoordelijke monitoringsite en een volgnummer dat is toegewezen door de onderzoeker. Na ondertekening van het toestemmingsformulier krijgt de patiënt het volgende volgnummer toegewezen door de onderzoeker. De site moet contact opnemen met het centrale onderzoekspersoneel en de gevraagde identificerende informatie voor de patiënt verstrekken zoals geregistreerd in de elektronische database. De formulieren voor het behandelbezoek worden ook naar het centrale onderzoekspersoneel gestuurd. Het geautoriseerde onderzoekspersoneel is verantwoordelijk voor het verzamelen, bewerken en beschermen van de gegevens die op hun eigen locatie worden verzameld en er wordt dagelijks een back-up van de database gemaakt. Kwaliteitsbeoordeling/controle zal de gezamenlijke verantwoordelijkheid zijn van alle betrokken personen en het centrale onderzoekspersoneel [data custodian].

Berekening van de steekproefomvang G-poweranalyse De steekproefomvang wordt berekend met behulp van de G*Power-software (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Duitsland). Het verschil in jaarlijkse exacerbatiepercentage van de patiënten met late aanvang van ernstige eosinofiele astma voor en na behandeling met Mepolizumab is het primaire eindpunt van de studie. In de DREAM-studie (een van de enige twee studies die tot nu toe resultaten heeft gerapporteerd die vergelijkbaar zijn met ons primaire eindpunt) werd gemeld dat het jaarlijkse aantal exacerbaties van patiënten met ernstig astma afnam van 3,6 naar 1,33 na het starten van de behandeling met mepolizumab. Met behulp van deze gegevens en een tweezijdige test, met een vermogen van 0,95 en een niveau van statistische significantie van 0,05, berekenden de onderzoekers een effectgrootte van 0,556, wat een totale steekproefomvang van 45 deelnemers aangaf.

Statistische plananalyse Statistische analyse wordt uitgevoerd met behulp van SPSS (versie 21.0 IBM SPSS statistische software, Armonk, NY, VS). Categorische variabelen worden weergegeven als getallen (n) en percentages (%), continue variabelen als gemiddelde ± SD indien normaal verdeeld, of mediaan en interkwartielbereiken indien anders. Waar nodig worden variabelen zonder normale verdeling getransformeerd. P < 0,05 werd geaccepteerd als statistisch significant. Shapiro-Wilk-test zal worden uitgevoerd om parametrische variabelen van niet-parametrische variabelen te scheiden. Paired-Samples T-test voor parametrische of Wilcoxon Signed Ranks-test voor niet-parametrische variabelen zal worden gebruikt om verschillen te detecteren in de variabelen die voor en na behandeling met Mepolizumab zijn gemeten.

Er is geen vergelijkingsarm omdat elke patiënt de controle over zichzelf heeft. Er zijn basiskenmerken (klinische en laboratoriumbiomarkers) die bij aanvang, elke 3 maanden en na voltooiing van de behandeling van 52 weken zullen worden gemeten. Studie-eindpunten omvatten de analyse van al die biomarkers als de identificatie van de kenmerken van non-responders en super-responders. Secundaire eindpunten omvatten ook de evaluatie van de biomarkers die in de methoden worden genoemd als beoordelingen. Er zal in eerste instantie een statistische analyse worden uitgevoerd met het aantal patiënten dat de behandelingsperiode van 52 weken heeft voltooid. Ten tweede zullen patiënten die de 52 weken durende behandeling nog niet hebben afgerond afzonderlijk worden geanalyseerd en ten slotte zullen deze twee groepen met elkaar worden vergeleken.

Meer specifiek zullen de onderzoekers met univariate analyse (tweezijdige onafhankelijke steekproeftesten) testen op associaties/correlaties tussen alle uitgangsresultaten in vergelijking met die na mepolizumab-behandelingen (elke 3 maanden tot 1 jaar behandeling): biomarkers in sputum en in bloed , klinische resultaten. Evenzo zullen univariate associaties tussen uitkomsten en persoonlijke/demografische kenmerken worden getest om potentiële confounders te identificeren. Significante associaties worden vervolgens getest met aangepaste regressiemodellen. Associaties/correlaties zullen afzonderlijk worden beoordeeld bij aanvang van klinische kenmerken en elke 3 maanden follow-up tijdens de behandeling, evenals bij aanvang en na 1 jaar behandeling met mepolizumab. Bovendien zal voor elke biomarker een subgroepanalyse worden uitgevoerd voor de identificatie van het biomarkerniveau voor de respons op de behandeling.

Paired-Samples T-test voor parametrische of Wilcoxon Signed Ranks-test voor niet-parametrische variabelen zal worden gebruikt om verschillen te detecteren in de variabelen die voor en na behandeling met Mepolizumab zijn gemeten. In het bijzonder zullen de niveaus van biomarkers bij baseline worden vergeleken met de niveaus na 1 jaar behandeling met mepolizumab.

Algehele respons op behandeling in één jaar (van baseline tot 1 jaar na aanvang van de behandeling) voor elk resultaat zal worden gemeten met een gepaarde test van afhankelijke steekproeven (parametrische en niet-parametrische gepaarde tests) bij elke patiënt. Vervolgens wordt de respons op de behandeling gedefinieerd als de verandering (absolute en % verandering) van de uitkomst in één jaar. De onderzoekers zullen voorspellers beoordelen die de respons op behandeling (verandering) beïnvloeden, zoals biomarkers, door gebruik te maken van meerdere regressiemodellen voor elk klinisch-pathologisch resultaat. Voor uitkomsten met meer dan 2 waarnemingen per proefpersoon gedurende de onderzoeksperiode zullen de onderzoekers gemengde modellen gebruiken waarbij de herhaalde metingen van de uitkomst worden gebruikt. Alle tests zijn tweezijdig met een statistisch significantieniveau van 5%.