Effekten af ​​Mepolizumab til svær astmatikere (MESILICO) (MESILICO)

Videnskabeligt rationale Interleukin (IL)-5 er det primære cytokin, der er ansvarligt for aktiveringen af ​​eosinofiler, og terapeutiske strategier er derfor blevet undersøgt og udviklet til klinisk brug. Biologiske lægemidler rettet mod IL-5 og dets receptor (først mepolizumab og efterfølgende reslizumab og benralizumab), er for nylig blevet godkendt og brugt som tillægsbehandling til svær eosinofil astma, hvilket resulterer i en reduktion i det cirkulerende eosinofiltal, forbedring af lungefunktion og eksacerbation. reduktion af patienter med svær astma.

Respons på biologiske behandlinger ved svær astma er variabel, hvor patienter enten er non-respondere, respondere eller superrespondere. Der er i øjeblikket ingen forklaring på denne brede variation i svaret. Det er vigtigt at undersøge, om disse patienter har særskilte karakteristika, der kan hjælpe den behandlende læge med at stille den korrekte diagnose i klinisk praksis.

Formålet med denne kliniske undersøgelse er at evaluere effektiviteten af ​​mepolizumab, et humaniseret IL-5-antagonist monoklonalt antistof hos patienter med sent-debuterende svær eosinofil astma med fast obstruktion og at identificere karakteristika af non-responders og super-responders under mepolizumab-behandling. Denne undersøgelse betragtes som ikke-interventionel, og hver procedure, der er inkluderet, foregår i en klinisk rutine til diagnosticering og fænotypning af astmatiske patienter.

Der bruges flere metoder til at undersøge luftvejsbetændelse: direkte målinger (såsom bronkialbiopsier eller bronchoalveolære udskylninger) og indirekte metoder (såsom symptomvurdering, blodprøveanalyse og lungefunktionstest). De direkte teknikker har den fordel, at de pålideligt vurderer luftvejsinflammationen, men de er invasive og ikke gennemførlige i stor skala på grund af patientens ubehag og risikoen. Hvad angår de indirekte metoder, korrelerer de dårligt med den direkte vurdering af luftvejsbetændelse.

I denne undersøgelse vil blandt patienters kliniske karakteristika spirometri, biomarkører for inflammation (blod eosinofiler, FeNO, IgE niveauer), impulsoscillometri (IOS) og fortykkelse af basalmembran via bronkoskopi blive evalueret. Det foreslås, at sent opståede svære eosinofile astmatiske patienter med fast obstruktion, som ikke reagerer på den sædvanlige behandling (ICS/LABA/LAMA), viser sig med øget glat muskelmasse. De præcise virkninger af øget glat muskelmasse i luftvejene på luftvejsindsnævring kendes dog ikke og kan variere med sygdommens sværhedsgrad. Derudover vil biomarkører for inflammation også blive evalueret før og efter 52 ugers mepolizumab-behandling i biologiske væsker (serum, sputum, sputumsupernatant og bronkialprøver). Biomarkører for inflammation er meget vigtige for at identificere respondere på ikke-respondere.

Mere specifikt er IOS blevet introduceret som en alternativ teknik til at vurdere lungefunktionen med særlig anvendelse på astma. Denne teknik er ikke-invasiv, udføres let under tidevandsånding og kræver kun minimalt patientsamarbejde.

Sputumopsamling er en anden måde at prøve celler fra luftvejene og tillader direkte vurdering af luftvejsbetændelse. Ydermere inkluderer eksempler med sputumsupernatant analyse af mediatorer og vurdering af prøvens kemotaktiske aktivitet for eosinofiler. Sputumcellerne kan også analyseres ved flowcytometri, som blandt andet tillader immunfænotyping og sortering af celler. Ydermere kan sputumceller dyrkes, og deres mediatorproduktion kan måles in vitro. Det er værd at bemærke, at i dette tilfælde er mediatorindholdet forskelligt fra det, der kan findes i sputumsupernatanten. Faktisk kan mediatorer i sputumsupernatanten være påvirket af sekreter fra luftvejsresidente celler og af plasmaekssudation, i modsætning til sputumcellekulturmodellen. Endelig kan immuncytokemi og in situ hybridisering også udføres under anvendelse af sputumceller.

Selvom fænotyper, blodeosinofiler og serum-IgE-niveauer er blevet foreslået til brug som reference, er der en dissociation mellem blodets immuncelleniveau og luftvejsepitelimmunreaktionen, som bekræftet i tidligere undersøgelser. Luftvejsepitel immunhistokemi farvning for målrettede immunceller er blevet brugt til at bestemme forskellige typer af luftvejsbetændelse; denne teknik bruges dog sjældent i kliniske omgivelser. Tidligere undersøgelser har afsløret den relative sikkerhed ved at udføre bronkoskopibiopsier for patienter med svær astma. Blandt de prøveudtagningsteknikker, der anvendes til vævsdiagnostik, herunder nasale biopsier, nasal eller bronchial børstning og bronkoalveolær udskylning, giver bronkoskopi-guidet bronchial epitelprøvetagning mere nøjagtig information om epitelceller og inflammatoriske celler i vævssammenhæng. Det er således et stærkt værktøj til at udvælge de bedst egnede biologiske lægemidler under vanskelige kliniske forhold.

Desuden er astmatisk sygdom karakteriseret ved en kronisk slimhindebetændelsesproces, som resulterer i irreversible ændringer af bronkialvæggen, kendt i dag som "bronkial remodeling". Hyperplasi og/eller hypertrofi af kirtel- og glatmuskelfibre, hyperplasi af bægerceller og variabel fortykkelse af basalmembranen (BM), der er til stede under det respiratoriske epitel, er en del af disse morfologiske ændringer. de ændringer, der genereres ved den epitel-forbindelsesgrænseflade, er årsag til en "adaptiv reaktion" på inflammatorisk stress og sporadisk bronkokonstriktion. De nuværende data om BM-reaktivitet hos astmatiske patienter er dog stadig ufuldstændige til en nøjagtig vurdering af dens involvering i patogenese og specifikt i ombygning af bronkialvæggen, hovedsageligt da kollagenaflejringer i lamina reticularis ikke er korreleret til graden af ​​sygdommens sværhedsgrad.

Desuden er det i stigende grad tydeligt, at svær astma ikke er en enkelt sygdom, hvilket fremgår af de mange forskellige kliniske præsentationer, fysiologiske karakteristika og resultater, der ses hos patienter med astma. For bedre at forstå denne heterogenitet er begrebet astmafænotyping og endotyping opstået. Fænotyping integrerer både biologiske og kliniske egenskaber, fra molekylære, cellulære, morfologiske og funktionelle til patientorienterede karakteristika med det mål at forbedre behandlingen. I sidste ende udvikler disse fænotyper sig til astma-"endotyper", som kombinerer kliniske karakteristika med identificerbare mekanistiske veje. Biomarkører, defineret som egenskaber, der kan måles objektivt og tjene som en indikator for underliggende biologiske processer eller patogenese, er afgørende for at definere fænotyper og endotyper. Ved astma er genetiske polymorfismer, mål for luftvejsfysiologi og niveauer af inflammatoriske mediatorer i urin, blod, opspyt, væv, udåndet gas og åndedrætskondensat alle blevet undersøgt som potentielle markører til at forbedre og objektivere astmadiagnose og behandling. Udvikling af sådanne værktøjer vil give os mulighed for at fænotype og endotype de forskellige kliniske mønstre beskrevet i astma, med det ultimative mål at skræddersy terapi baseret på en specifik biomarkørprofil. Biomarkører kan derefter bruges til bedre at forstå den farmakologiske reaktion på en intervention og justere behandlingen i overensstemmelse hermed.

Biomarkører har været kritiske for undersøgelser af sygdomspatogenese og udvikling af nye behandlingsformer ved svær astma. Især biomarkører af type 2-inflammation har vist sig værdifulde til endotyping og målretning mod nye biologiske agenser. På grund af disse succeser med at forstå og markere type 2-betændelse, vil manglende viden om ikke-type 2-inflammatoriske mekanismer ved astma snart være den største hindring for udviklingen af ​​nye behandlinger og håndteringsstrategier ved svær astma. Andre potentielle biomarkører omfatter medfødte lymfoide celler, IL-33 eller tymisk stromal lymfopoietin.

Nylige publikationer bekræftede en afgørende regulerende rolle for miRNA'er i astmas patomekanisme. Nogle enkelte miRNA'er eller deres sæt holder løftet om deres brug som astmabiomarkører, der letter diagnose eller forudsigelse af behandlingsresultater. De er også mulige mål for fremtidige terapier. Undersøgelserne på dette område mangler dog. For nylig er det blevet vist, at de fleste af de involverede miRNA'er øger sekretion af Th2-cytokiner, mindsker sekretion af Th1-cytokiner, fremmer differentiering af T-celler mod Th2 eller spiller en rolle i hyperplasi og hypertrofi af bronchiale glatte muskelceller. Profilerne af miRNA'er korrelerer med kliniske karakteristika, herunder lungefunktion, fænotype og sværhedsgrad af astma.

De fleste industrisponserede biologiske kliniske forsøg har effektivt brugt ovennævnte tilgang ved at udvælge forsøgspersoner, der ligner de svære astma-kliniske fænotyper af SARP (høj-intensitets-kontrollerende medicinbehandlingsregimer, hyppige eksacerbationer og lav lungefunktion), men derefter kræver en forhøjet biomarkør (i blod, udåndet gas eller opspyt), der skal identificere patienter, der med størst sandsynlighed reagerer på en specifik immunmodulator inden for disse kliniske fænotyper. De biologiske lægemidler i nyligt offentliggjorte kliniske forsøg retter sig mod type 2-inflammatoriske veje og begrænser deltagelse til forsøgspersoner med forhøjede type 2-biomarkører (eosinofiler i blod eller sputum eller FeNO). Post hoc responder-analyser til at "gruppere" biomarkører for bedre at forstå, hvilke patienter der har størst udbytte af en biologisk immunmodulator, vil føre til en forståelse af, at samtidige stigninger i mere end 1 type 2 inflammatorisk biomarkør yderligere kan identificere "high responder" patienter.

Hypotesen omfatter effekten af ​​mepolizumab-behandling hos sent-debuterende svær eosinofile astmatiske patienter med fast obstruktion og relation til kliniske og inflammatoriske biomarkører.

Forskningsspørgsmål Er der nogen forbedring i eksacerbationsraten hos sent-debuterende svære eosinofile astmatiske patienter under mepolizumab-behandling i løbet af deres 1. behandlingsår, og hvad er karakteristika ved non-responders og super-responders? Er der nogen forbedring i omdannelsen af ​​glatte muskelceller? Er der nogen biomarkører til at forudsige respons på mepolizumab-behandling hos sent-debuterende svær eosinofile astmatiske patienter? Er der nogen forbedring i respiratoriske parametre? Er der nogen forbedring i astmakontrol og patienters livskvalitet? Mål

De primære mål for denne undersøgelse er:

1. For at demonstrere effekten af ​​mepolizumab-behandling med hensyn til eksacerbationshastighed hos sent-debuterende svær eosinofile astmatiske patienter med fast obstruktion.
2. At identificere karakteristika for ikke-respondere og super-respondere.

De vigtigste sekundære mål for denne undersøgelse er:

1. Enhver forbedring af remodeling (fortykkelse af bronkial glatte muskelceller).
2. Eventuelle biomarkører for respons.
3. Enhver forbedring af respiratoriske parametre i astmakontrol og i patienters livskvalitet under mepolizumab-behandling hos sent-debuterende svær eosinofile astmatiske patienter med fast obstruktion.

Undersøgelsesdesign og -metoder Patienter vil blive indsamlet fra ambulatorier for bronkial astma fra hvert sted (8 i antal), som dækker befolkningen i Grækenland. Alle disse klinikker er inkluderet for at styrke rekrutteringen samt for at inkludere bronkoskopeksperter med international gennemslagskraft. På grund af den aktuelle situation vedrørende Covid-19-pandemien, antager efterforskerne, at denne kliniske undersøgelse ikke forstyrrer arbejdsbyrden i vores klinikker.

Samlet set er dette en prospektiv multicenterundersøgelse, der omfatter otte lungeklinikker. Fem lungeuniversitetsklinikker, to af National Health System og et Army General Hospital.

Undersøgelsen vil omfatte en screeningsperiode på op til 2 uger for at vurdere egnethed og indhente skriftligt informeret samtykke, en mepolizumab-behandlingsperiode på 52 uger, en gang hver 4. uge, inklusive opfølgningsbesøg hver 3. måned under behandlingen.

Studiepopulationen vil bestå af 45 patienter med sent indsættende svær eosinofil astma og fast obstruktion, som får mepolizumab på 20 år og derover.

Studiedeltagelse, vurdering og opfølgning:

Screening: Undersøgere vil screene udvalgte forsøgspersoner til de deltagende klinikker (ambulatorier for svær astma). Forsøgspersoner vil komme ind for at underskrive samtykke. Klinisk vurdering og procedurer og strukturelle interviews vil blive udført under screeningen. Forsøgspersoner, der er kvalificerede/i stand til at gennemføre screeningsbesøget, kan gøre det samme dag, og om nødvendigt vil de afslutte deres baseline-vurdering inden for 2 uger. Forsøgspersoner med en igangværende astmaeksacerbation bør have deres screening og behandlingsstartbesøg udsat, indtil investigator vurderer, at forsøgspersonen er vendt tilbage til deres baseline astmastatus. Hvis den 2-ugers screeningsperiode er udløbet, skal forsøgspersonen betragtes som en screeningsfejl. Forsøgspersonerne vil forblive på deres nuværende vedligeholdelsesbehandling i hele screeningsperioderne. Patienternes berettigelse vil være baseret på kriterierne anført i de næste afsnit.

Astmaeksacerbationshistorie for de sidste 12 måneder vil blive rapporteret ved screeningsbesøget. Desuden vil eksacerbationer blive evalueret ved hvert besøg som rapporteret.

Vitale tegn vil blive udført ved screeningsbesøg, ved baseline og hver 3. måned. Målinger vil omfatte systolisk og diastolisk blodtryk, puls og kropstemperatur.

Højde i centimeter (cm) og kropsvægt i kilogram (kg) vil blive målt ved screeningsbesøg. Body Mass Index (BMI) vil blive beregnet som vægten i kg divideret med højden i meter i kvadrat

Laboratorieevaluering (hæmatologi, blodkemi, urinanalyse):

Venøst ​​blod og urin vil blive opsamlet ved baseline. Hæmatologi: Hæmoglobin, hæmatokrit, antal røde blodlegemer, antal hvide blodlegemer med differential og blodplader vil blive målt i laboratoriet på hvert hospitals hospital. Grundlæggende klinisk kemi og urinanalyse vil blive evalueret. Indsamling af urin til kvindelige forsøgspersoner vil også evaluere graviditet.

IgE-niveauer vil blive evalueret ved screeningsbesøg ved hjælp af immunoCAP-tests og vil blive rapporteret som IE/ml.

Følgende spørgeskemaer vil blive administreret: 1) Astmakontrolspørgeskemaet (ACQ-5) og Astmakontroltest (ACT) for at vurdere den aktuelle astmakontrol; 2) Astma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) til vurdering af livskvalitet og psykologisk sygelighed. For yderligere at vurdere søvnkvalitet 1) Athens Insomnia Scale (AIS), 2) Epworth Sleepiness Scale (ESS), 3) St. George's Respiratory Questionnaire (SGRQ) og 4) WHO (Fem) Well-Being Index (WHO-5), 5) Fatigue Severity Scale (FSS).

Udåndet nitrogenoxid (NO) vil blive målt ved baseline og hver 3. måned i henhold til American Thoracic Society Guidelines og som specificeret af producenten. FeNO-niveauer vil blive rapporteret som dele pr. milliard. Der vil blive foretaget målinger før spirometri udføres.

Venøse blodprøver vil blive udtaget mellem kl. 8 til 10, ved baseline og hver 3. måned i løbet af 52-ugers perioden med mepolizumab-behandling. Absolut eosinofiltal i blodet vil blive rapporteret som celler/μl.

Spirometri: Spirometri A vil blive udført ved brug af stedets eget udstyr ved besøgene (baseline og hver 3. måned). Alle klinikbesøg skal ske om morgenen. I behandlingsperioden vil spirometrien opfylde de gældende ATS/ERS retningslinjer, og spirometeret skal producere en udskrift af alle genererede data, som skal gemmes i forsøgspersonens noter. Spirometeret vil blive kalibreret i overensstemmelse med producentens instruktioner. Spirometri skal udføres på samme tidspunkt (±1 time) med Visit 0-spirometrien. Forsøgspersoner bør forsøge at tilbageholde korttidsvirkende beta-2-agonister (SABA'er) i ≥4 timer og LABA'er i ≥15 timer før klinikbesøg, hvis det er muligt (GINA 2019). De vurderinger, der skal registreres, vil omfatte FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF og FEF25-75. Post-bronkodilatatormålinger vil blive taget ved hvert besøg med 200-400mcg albuterol eller tilsvarende.

Spirometri B vil blive udført ved brug af stedets eget udstyr ved besøgene (baseline, efter 6 måneder og efter behandling på 52 ugers tidspunkt). Spirometri B omfatter diffusion, pulmonale volumener og kapaciteter.

Impulsoscillometri (valgfrit):

Impulsosillometri (IOS) vil blive udført ved baseline og efter 52 ugers behandling. IOS inkluderer modstand ved 5 Hz-modstand ved 20 Hz (R5-R20), et mål, der afspejler respirationsmodstand i små til mellemstore ledende og perifere luftveje, AX, et mål, der afspejler udspilning af de perifere lunger (nemlig parenkymet og små perifere luftveje) og respirationssystemets reaktans (X5), et mål, der afspejler inertans og elasticitet eller kapacitans (inklusive små perifere luftveje).

Behandling med biologiske lægemidler:

Efter afslutning af screeningsbesøgene kan deltageren påbegynde behandling med biologisk terapi (mepolizumab) inden for en måned. Under terapien vil forsøgspersoner være under behandling af lungelægen, som havde henvist dem til forskergruppen for at deltage i undersøgelsen. Disse lungelæger vil blive betegnet som 'associerede lungelæger. Behandling vil blive givet i henhold til produktproducentens instruktioner.

Associerede lungelæger, der yder biologisk behandling i løbet af undersøgelsen, skal underskrive en aftale om at udføre undersøgelsen i overensstemmelse med protokollen, for at anerkende, at han/hun er ansvarlig for medicinsk adfærd og for undersøgelsesudførelse, og for at sikre, at partneren (og deres kollegaer) og medarbejdere), der hjælper med at gennemføre undersøgelsen, informeres om deres forpligtelser. Mekanismer vil være på plads for at sikre, at associeret personale modtager den relevante information og støtte fra forskergruppen under hele undersøgelsen.

Opfølgning under biologisk terapi: Ved påbegyndelse og ved hvert besøg til biologisk terapi vil indsamling af information blive udført af den associerede lungelæge og med støtte fra forskergruppen, hvis den associerede lungelæge anmoder om det, f.eks. forskere via telefon eller ansigt til- ansigtskontakt vil interviewe patienten. Ydermere vil overholdelse blive registreret fra lægen baseret på patientens mundtlige bekræftelse. Datoform for lægemiddeladministration vil blive registreret ved hvert besøg, såvel som øjeblikkelige og forsinkede bivirkninger.

Sikkerhedsovervågning:

Registrerede uønskede hændelser (AE'er) vil blive overvåget og sammenstillet efter behov i undersøgelsesrapporter. En uønsket hændelse er forekomsten eller forværringen af ​​ethvert uønsket tegn, symptom eller medicinsk tilstand, der opstår efter start af undersøgelsen. Medicinske tilstande/sygdomme, der er til stede før påbegyndelse af forsøgslægemidlet, betragtes kun som bivirkninger, hvis de forværres efter påbegyndelse af forsøgslægemidlet. Unormale laboratorieværdier eller testresultater udgør kun bivirkninger, hvis de inducerer kliniske tegn eller symptomer, anses for at være klinisk signifikante eller kræver behandling. Også bivirkninger relateret til Covid-19 er inkluderet. Hvis en partner lungelæge eller forskningspersonale bliver opmærksom på en AE forbundet med et produkt, kan det rapporteres til producenten i henhold til deres lokale standardpraksis for spontan AE-rapportering. En kopi af rapporten skal også sendes til studiekoordinatoren. Alvorlige uønskede hændelser (SAE) vil blive rapporteret på eCRF-siderne, og inden for 24 timer vil alle efterforskere have ansvaret for at informere centralkomiteen i Thessaloniki. Derefter vil centralkomiteen informere den videnskabelige bestyrelse og det græske lægeagentur. Ligeledes vil den medicinske og videnskabelige vurdering blive udøvet af hvert centers hovedefterforsker sammen med centralkomiteen for at beslutte, om forsøgspersonen skal stoppe behandlingen eller ej.

Graviditetsrapport:

I første omgang skal kvindelige patienter ved screening lave en graviditetstest. Under behandlingen, hvis en kvindelig forsøgsperson rapporterer en graviditet til os, vil hun blive bedt om at trække sig fra undersøgelsen (for at forhindre skævhed). Derefter vil hun blive spurgt, om hun gerne vil fortsætte med at få behandlingen uden for denne protokol og blive overvåget kl. hvert centers ambulatorium.

Pre-screening og screeningsfejl:

Forsøgspersonerne vil blive tildelt et undersøgelsesnummer på tidspunktet for underskrivelsen af ​​samtykket. Forsøgspersoner, der har underskrevet, men ikke går videre til vurderingen af ​​screeningsbesøg, vil blive betragtet som en fejl på forhånd. Ingen data vil blive fanget i databasen for disse emner.

Forsøgspersoner, der gennemfører mindst et af de to screeningsbesøg, men ikke påbegynder biologisk behandling, vil blive udpeget som screeningsfejl. Oplysninger, der skal indsamles til forudgående screening og screeningsfejl, vil blive beskrevet i databaseudfyldelsen.

Tilbagetrækningsbesøg:

Hvis en deltager beslutter at trække sig fra undersøgelsen under opfølgningen (af en hvilken som helst anden grund end tab for at følge op), kan de blive bedt om at deltage i et tilbagetrækningsbesøg (hvis det skønnes nødvendigt af investigator og med forbehold for samtykke). Under besøget kan deltageren blive stillet spørgsmål om deres aktuelle tilstande som en del af klinisk informationsindsamling, såsom: astma og nasale symptomer, eksacerbationer og forløbet af behandlingen, der modtages.

Indsamling og behandling af blodprøver:

Blodprøver vil blive indsamlet ved baseline besøg, ved 6 måneder og efter afslutning af behandlingen. Efter opsamling af blodprøverne vil de stå uforstyrret i cirka en halv time for fuldstændig koageldannelse. Prøven vil derefter blive centrifugeret for at adskille serumet fra koaglet. Efter centrifugering vil serummet blive opbevaret ved -20°C i eppendorf-rør, indtil analysen er udført. Blodfænotypebestemmelse vil også blive evalueret ved flowcytometri.

Induceret opspyt (valgfrit):

Induceret sputum vil blive udført ved baseline før behandlingsstart og efter afslutning af behandling i henhold til ERS Task Force-rapporten, hvor en detaljeret ekspertkonsensusbaseret anbefaling for induceret sputumbehandling foreslås.

Ved besøgene vil der blive udført sputuminduktion, efter at de rutinemæssige spirometriske vurderinger er gennemført.

Det inducerede sputum vil blive behandlet inden for to timer efter afslutningen af ​​induktionsproceduren på forskningsstedet. Sputumceller og cellesuspensionssupernatant vil blive opbevaret ved -80ºC til analyse. Efter opsamling af det inducerede sputum vil supernatanten af ​​prøven blive opbevaret ved -20°C i eppendorf-rør, indtil analysen er udført. Efter disse procedurer er laboratorieevaluering af sputum næste gang i henhold til retningslinjer.

Bronkoskopi, bronkialbiopsier og vaskeprøvers indsamling og behandling (valgfrit): Ved besøgene udføres endoskopi med bronkialbiopsier, bronkial vaskeprøve (besøg 0b) efter patientens skriftlige samtykke. Specifikt vil der blive inkluderet et separat informere samtykke, som skal underskrives fra hver patient. Bronkoskopi vil blive udført på to tidspunkter (baseline før behandlingsstart og efter afslutning af behandlingen). Fleksibel bronkoskopi og diagnostiske teknikker blev udført under overvåget anæstesibehandling som anbefalet af American Thoracic Society og British Thoracic Society.

Vævsprøver fikseres i oppustning eller nedsænkning ved hjælp af formaldehyd eller glutaraldehyd og indlejret i paraffin. Luftvejene vil blive systematisk udtaget eller opnået under diagnostisk dissektion efter patologens skøn. Konsekutive sektioner på 0,5, 5 og 30 μm tykkelse blev skåret fra hver blok og farvet ved hjælp af Masson's trichrome teknik, henholdsvis hæmatoxylin og eosin og hæmatoxylin. Immunhistokemisk farvning vil blive udført med følgende mAbs: anti-mastcelle tryptase klon AA1 (Dako UK), anti-alfa glatmuskel actin klon 1A4 (Dako UK), anti-eosinofil major basis protein klon BMK-13 (Monosan, Holland) ), anti-neutrofil elastase klon NP57 (Dako UK) og anti-endotel klon EN4 (Monosan, Holland) eller passende isotype kontroller blev anvendt.

De endobronkiale biopsier vil blive vurderet af en enkelt observatør, der er blindet for de kliniske karakteristika (ZEN 2012 billedanalysesoftware til lysmikroskopi, Carl Zeiss AG, Tyskland) og vil blive udtrykt som gennemsnittet af målinger foretaget fra mindst to sektioner enten fra uafhængige biopsier eller som ikke-sammenhængende vævssnit mindst 20μm fra den samme biopsi. Epitelintegritet vil blive vurderet ved at måle længderne af intakt og blottet epitel. Disse vil blive udtrykt som procent af hele den retikulære basalmembran (RBM) længde. Vaskularitet vil blive målt ved hjælp af Chalkley-tællingen, et surrogat af både kardensitet og vaskulært område. Et Chalkley okulargitter (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, UK) vil blive brugt ved x200 til at måle Chalkley-tal i fire ikke-overlappende vaskulære hotspots (6). Indholdet af glat muskulatur i luftvejene vil blive bestemt som andelen af ​​det samlede areal. Inflammatoriske celler blev udtrykt som antallet af nukleerede celler/areal af lamina propria.

Bronkialvaskeprøver vil straks blive transporteret til laboratoriet, for at blive opbevaret ved -80 grader. Undersøgelse af bronchiale vaskevæsker vil blive udført på et senere tidspunkt for at bestemme flere biomarkører.

Analyse af biomarkører for inflammation med Flow Cytometri Analysis (FACS) eller ELIZA:

Biomarkører inkluderet før og efter behandling med mepolizumab på to eller tre tidspunkter (ved baseline, ved 6 måneders behandling og efter behandlingsafslutningsbesøg): lymfocytundergrupper, Th2/Th17-cytokiner, kemokiner, mikroRNA-ekspression, der skal kvantificeres ved flowcytometri eller ELISA) i biologiske væsker (blod, serum, bronkial vask, sputum og sputumsupernatant).

Panelsæt og passende antistoffer vil blive testet ved Flow Cytometer Analysis ved hjælp af et BD FACS Calibur-system (BD Biosciences, San Jose, CA) i henhold til producentens anbefalinger og instruktioner.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) er en pladebaseret assayteknik designet til at påvise og kvantificere stoffer som peptider, proteiner, antistoffer og hormoner. ELISA-sæt vil blive analyseret ved hjælp af VICTOR X3 spektrofotometer i henhold til producentens anbefalinger og instruktioner.

Allergitest (hvis relevant) Patienternes atopiske status vil blive evalueret (hvis den ikke er tilgængelig) ved screeningsbesøg af hudpriktesten (SPT) til et standardpanel af aeroallergener til påvisning af totale IgE-antistoffer mod forskellige almindelige inhalerende allergener.

Database En elektronisk dataindsamlingsplatform vil være den metode, der anvendes ved baseline hver 3. måned indtil 1 års opfølgning på denne database. Under behandlingsbesøg udfyldes papirskemaer/spørgeskemaer af den associerede lungelæge. Hvert websted vil indtaste specifikke data i en elektronisk database. Hver patient identificeres entydigt af et emnenummer, som er sammensat af det stednummer, der er tildelt af det ansvarlige overvågningssted, og et sekventielt nummer tildelt af investigator. Ved underskrivelse af formularen til informeret samtykke tildeles patienten det næste løbenummer af investigator. Stedet skal kontakte det centrale forskningspersonale og give de ønskede identifikationsoplysninger for patienten som registreret i den elektroniske database. Behandlingsbesøgsskemaerne vil også blive sendt til det centrale forskningspersonale. Det autoriserede undersøgelsespersonale vil være ansvarlig for dataindsamling, redigering og også at beskytte de data, der indsamles på deres eget websted, og databasen sikkerhedskopieres på daglig basis. Kvalitetsgennemgang/kontrol vil være det fælles ansvar for alle involverede personer og det centrale forskningspersonale [datadepoter].

Prøvestørrelsesberegning G-effektanalyse Prøvestørrelsen beregnes ved hjælp af G*Power-softwaren (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Tyskland). Forskellen i årlig eksacerbationsrate for patienter med sent indsættende svær eosinofil astmatiker før og efter behandling med Mepolizumab er undersøgelsens primære endepunkt. I DREAM-studiet (et af de eneste to studier, der har rapporteret resultater svarende til vores primære endepunkt hidtil) blev det rapporteret, at den årlige eksacerbationsrate for patienter med svær astma faldt fra 3,6 til 1,33 efter påbegyndelse af behandling med Mepolizumab. Ved at bruge disse data og en tosidet test, med en styrke på 0,95 og et niveau af statistisk signifikans på 0,05, beregnede efterforskerne en effektstørrelse på 0,556, hvilket indikerede en samlet stikprøvestørrelse på 45 deltagere.

Statistisk plananalyse Statistisk analyse vil blive udført ved hjælp af SPSS (version 21.0 IBM SPSS statistisk software, Armonk, NY, USA). Kategoriske variable vil blive angivet som tal (n) og procenter (%), kontinuerte variabler som middelværdi ± SD hvis normalfordelt, eller median og interkvartilintervaller hvis andet. Hvor det er nødvendigt, vil variable uden normalfordeling blive transformeret. P < 0,05 blev accepteret som statistisk signifikant. Shapiro-Wilk test vil blive udført for at adskille parametriske fra ikke-parametriske variabler. Paired-Samples T-test for parametrisk eller Wilcoxon Signed Ranks-test for ikke-parametriske variabler vil blive brugt til at påvise forskelle i variablerne målt før og efter Mepolizumab-behandling.

Der er ingen komparatorarm, da hver patient har kontrol over sig selv. Der er baseline-karakteristika (kliniske og laboratorie-biomarkører), som vil blive målt ved baseline, hver 3. måned og efter 52-ugers behandlingsafslutning. Undersøgelsens endepunkter inkluderer analysen af ​​alle disse biomarkører som identifikation af karakteristika for ikke-respondere og super-respondere. Sekundære endepunkter inkluderer også evalueringen af ​​de biomarkører, der er nævnt i metoderne som vurderinger. Statistisk analyse vil indledningsvis blive udført med antallet af patienter, der har gennemført den 52-ugers behandlingsperiode. For det andet vil patienter, der ikke har gennemført den 52-ugers behandling, blive analyseret separat, og til sidst vil disse to grupper blive sammenlignet med hinanden.

Mere specifikt, med univariat analyse (tosidet uafhængig prøvetest) vil efterforskerne teste for sammenhænge/sammenhænge mellem alle baseline-resultater sammenlignet med dem efter mepolizumab-behandlinger (hver 3. måned indtil 1 års behandling): biomarkører i sputum og i blod , kliniske resultater. Tilsvarende vil univariate sammenhænge mellem resultater og personlige/demografiske karakteristika blive testet for at identificere potentielle konfoundere. Væsentlige sammenhænge vil derefter blive testet med justerede regressionsmodeller. Associationer/korrelationer vil blive evalueret separat ved baseline kliniske karakteristika og hver 3. måned opfølgning under behandlingen samt ved baseline og efter 1 års mepolizumab behandling. Desuden vil der blive udført undergruppeanalyse for hver biomarkør til identifikation af biomarkørniveau til behandlingsrespons.

Paired-Samples T-test for parametrisk eller Wilcoxon Signed Ranks-test for ikke-parametriske variabler vil blive brugt til at påvise forskelle i variablerne målt før og efter Mepolizumab-behandling. Specifikt vil niveauer af biomarkører ved baseline blive sammenlignet med niveauer efter 1 års mepolizumab-behandling.

Samlet respons på behandling i et år (fra baseline til 1 år efter behandlingsstart) for hvert resultat vil blive målt med parret test af afhængige prøver (parametriske og ikke-parametriske parrede test) i hver patient. Derefter vil respons på behandlingen blive defineret som ændringen (absolut og % ændring) af resultatet på et år. Efterforskerne vil vurdere prædiktorer, der påvirker respons på behandling (ændring), såsom biomarkører ved at bruge flere regressionsmodeller for hvert klinisk-patologisk resultat. For resultater med mere end 2 observationer pr. forsøgsperson i løbet af undersøgelsesperioden vil efterforskerne bruge blandede modeller ved hjælp af de gentagne målinger af resultatet. Alle tests vil være 2-sidede med et statistisk signifikansniveau på 5%.