Efficacia di Mepolizumab negli asmatici gravi (MESILICO) (MESILICO)

Razionale scientifico L'interleuchina (IL)-5 è la principale citochina responsabile dell'attivazione degli eosinofili, pertanto sono state studiate e sviluppate strategie terapeutiche per uso clinico. I farmaci biologici mirati all'IL-5 e al suo recettore (prima mepolizumab e successivamente reslizumab e benralizumab) sono stati recentemente approvati e utilizzati come terapia aggiuntiva per l'asma eosinofilo grave con conseguente riduzione della conta degli eosinofili circolanti, miglioramento della funzionalità polmonare ed esacerbazione riduzione nei pazienti con asma grave.

La risposta alle terapie biologiche nell'asma grave è variabile, con pazienti che possono essere non-responder, responder o super-responder. Al momento non c'è alcuna spiegazione per questa ampia variazione nella risposta. È importante esaminare se questi pazienti hanno caratteristiche distinte che potrebbero aiutare il medico curante a formulare la diagnosi corretta nella pratica clinica.

Lo scopo di questo studio clinico è valutare l'efficacia di mepolizumab, un anticorpo monoclonale antagonista dell'IL-5 umanizzato in pazienti con asma eosinofilico grave a esordio tardivo con ostruzione fissa e identificare le caratteristiche dei non-responder e dei super-responders sotto trattamento con mepolizumab. Questo studio è considerato non interventistico e ogni procedura inclusa sta accadendo in una routine clinica per la diagnosi e la fenotipizzazione dei pazienti asmatici.

Diversi metodi sono utilizzati per indagare l'infiammazione delle vie aeree: misurazioni dirette (come biopsie bronchiali o lavaggi broncoalveolari) e metodi indiretti (come valutazione dei sintomi, analisi del campione di sangue e test di funzionalità polmonare). Le tecniche dirette hanno il vantaggio di valutare in modo affidabile l'infiammazione delle vie aeree, ma sono invasive e non realizzabili su larga scala a causa del disagio del paziente e del rischio che si corre. Per quanto riguarda i metodi indiretti, si correlano male con la valutazione diretta dell'infiammazione delle vie aeree.

In questo studio, tra le caratteristiche cliniche dei pazienti saranno valutati la spirometria, i biomarcatori di infiammazione (eosinofili nel sangue, FeNO, livelli di IgE), l'oscillometria ad impulsi (IOS) e l'ispessimento della membrana basale tramite broncoscopia. Si suggerisce che i pazienti asmatici eosinofilici gravi ad esordio tardivo con ostruzione fissa che non rispondono al trattamento abituale (ICS/LABA/LAMA) appaiano con un aumento della massa muscolare liscia. Tuttavia, gli effetti precisi dell'aumento della massa muscolare liscia delle vie aeree sul restringimento delle vie aeree non sono noti e possono variare con la gravità della malattia. Inoltre, i biomarcatori dell'infiammazione saranno valutati anche prima e dopo il trattamento con mepolizumab di 52 settimane nei fluidi biologici (siero, espettorato, supernatante dell'espettorato e campioni bronchiali). I biomarcatori dell'infiammazione sono molto importanti per identificare i responder rispetto ai non-responder.

Più specificamente, IOS è stato introdotto come tecnica alternativa per valutare la funzione polmonare con particolare applicazione all'asma. Questa tecnica non è invasiva, si esegue facilmente durante la respirazione corrente e richiede solo una minima collaborazione da parte del paziente.

La raccolta dell'espettorato è un altro modo per campionare le cellule dalle vie aeree e consente la valutazione diretta dell'infiammazione delle vie aeree. Inoltre, esempi con supernatante dell'espettorato includono l'analisi dei mediatori e la valutazione dell'attività chemiotattica del campione per gli eosinofili. Le cellule dell'espettorato possono anche essere analizzate mediante citometria a flusso che consente, tra l'altro, l'immunofenotipizzazione e lo smistamento delle cellule. Inoltre, le cellule dell'espettorato possono essere coltivate e la loro produzione di mediatori può essere misurata in vitro. Vale la pena notare che in questo caso il contenuto del mediatore è diverso da quello che si può trovare nel supernatante dell'espettorato. Infatti, i mediatori nel surnatante dell'espettorato possono essere influenzati dalle secrezioni delle cellule residenti nelle vie aeree e dall'essudazione plasmatica, contrariamente al modello di coltura cellulare dell'espettorato. Infine, l'immunocitochimica e l'ibridazione in situ possono essere eseguite anche utilizzando cellule di espettorato.

Sebbene i fenotipi, gli eosinofili nel sangue e i livelli sierici di IgE siano stati proposti come riferimento, esiste una dissociazione tra il livello delle cellule immunitarie del sangue e la reazione immunitaria dell'epitelio delle vie aeree, come confermato in studi precedenti. La colorazione immunoistochimica dell'epitelio delle vie aeree per le cellule immunitarie mirate è stata utilizzata per determinare vari tipi di infiammazione delle vie aeree; tuttavia, questa tecnica è usata raramente in ambito clinico. Precedenti studi hanno rivelato la relativa sicurezza dell'esecuzione di biopsie broncoscopiche per pazienti con asma grave. Tra le tecniche di campionamento utilizzate per la diagnosi dei tessuti, comprese le biopsie nasali, lo spazzolamento nasale o bronchiale e il lavaggio broncoalveolare, il campionamento dell'epitelio bronchiale guidato dalla broncoscopia fornisce informazioni più accurate sulle cellule epiteliali e infiammatorie nel contesto tissutale. È quindi un potente strumento per selezionare i farmaci biologici più adatti in condizioni cliniche difficili.

Inoltre, la malattia asmatica è caratterizzata da un processo infiammatorio cronico della mucosa, che si traduce in alterazioni irreversibili della parete bronchiale, oggi note come "rimodellamento bronchiale". Fanno parte di questi cambiamenti morfologici l'iperplasia e/o l'ipertrofia delle fibre muscolari lisce e ghiandolari, l'iperplasia delle cellule caliciformi e l'ispessimento variabile della membrana basale (BM) presente sotto l'epitelio respiratorio. i cambiamenti generati all'interfaccia epitelio-connettivo rappresentano una "risposta adattativa" allo stress infiammatorio e alla broncocostrizione sporadica. Tuttavia, i dati attuali sulla reattività della BM nei pazienti asmatici sono ancora incompleti per una valutazione accurata del suo coinvolgimento nella patogenesi e in particolare nel rimodellamento della parete bronchiale, principalmente poiché i depositi di collagene nella lamina reticolare non sono correlati al grado di gravità della malattia.

Inoltre, è sempre più evidente che l'asma grave non è una singola malattia, come evidenziato dalla varietà di presentazioni cliniche, caratteristiche fisiologiche ed esiti osservati nei pazienti con asma. Per comprendere meglio questa eterogeneità, è emerso il concetto di fenotipizzazione ed endotipizzazione dell'asma. La fenotipizzazione integra sia le caratteristiche biologiche che cliniche, dalle caratteristiche molecolari, cellulari, morfologiche e funzionali alle caratteristiche orientate al paziente con l'obiettivo di migliorare la terapia. In definitiva, questi fenotipi si evolvono in "endotipi" di asma, che combinano caratteristiche cliniche con percorsi meccanicistici identificabili. I biomarcatori, definiti come caratteristiche che possono essere oggettivamente misurate e servono come indicatori dei processi biologici sottostanti o della patogenesi, sono cruciali nella definizione di fenotipi ed endotipi. Nell'asma, i polimorfismi genetici, le misure della fisiologia delle vie aeree e i livelli di mediatori dell'infiammazione nelle urine, nel sangue, nell'espettorato, nei tessuti, nel gas esalato e nel condensato del respiro sono stati tutti studiati come potenziali marcatori per migliorare e oggettivare la diagnosi e la gestione dell'asma. Lo sviluppo di tali strumenti ci consentirà di fenotipizzare ed endotipizzare i vari pattern clinici descritti nell'asma, con l'obiettivo finale di adattare la terapia sulla base di uno specifico profilo di biomarcatore. I biomarcatori possono quindi essere utilizzati per aiutare a comprendere meglio la risposta farmacologica a un intervento e regolare la terapia di conseguenza.

I biomarcatori sono stati fondamentali per gli studi sulla patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie nell'asma grave. In particolare, i biomarcatori dell'infiammazione di tipo 2 si sono dimostrati preziosi per l'endotipizzazione e il targeting di nuovi agenti biologici. A causa di questi successi nella comprensione e nella marcatura dell'infiammazione di tipo 2, la mancanza di conoscenza dei meccanismi infiammatori non di tipo 2 nell'asma sarà presto il principale ostacolo allo sviluppo di nuovi trattamenti e strategie di gestione dell'asma grave. Altri potenziali biomarcatori includono cellule linfoidi innate, IL-33 o linfopoietina stromale timica.

Recenti pubblicazioni hanno confermato il ruolo regolatore cruciale dei miRNA nel patomeccanismo dell'asma. Alcuni singoli miRNA o i loro set mantengono la promessa per il loro utilizzo come biomarcatori dell'asma che facilitano la diagnosi o la previsione dei risultati del trattamento. Sono anche possibili bersagli di future terapie. Gli studi in questo campo però mancano. Recentemente è stato dimostrato che la maggior parte dei miRNA coinvolti aumenta la secrezione di citochine Th2, diminuisce la secrezione di citochine Th1, promuove la differenziazione delle cellule T verso Th2 o gioca un ruolo nell'iperplasia e nell'ipertrofia delle cellule muscolari lisce bronchiali. I profili dei miRNA sono correlati alle caratteristiche cliniche, tra cui la funzione polmonare, il fenotipo e la gravità dell'asma.

La maggior parte degli studi clinici biologici sponsorizzati dall'industria ha effettivamente utilizzato l'approccio di cui sopra selezionando soggetti di studio che assomigliano ai fenotipi clinici dell'asma grave della SARP (regimi terapeutici di controllo ad alta intensità, riacutizzazioni frequenti e bassa funzionalità polmonare), ma poi richiedono un biomarcatore elevato (in sangue, gas esalato o espettorato) che dovrebbe identificare i pazienti che hanno maggiori probabilità di rispondere a uno specifico immunomodulatore all'interno di quei fenotipi clinici. I farmaci biologici negli studi clinici recentemente pubblicati prendono di mira le vie infiammatorie di tipo 2 e limitano la partecipazione a soggetti con biomarcatori di tipo 2 elevati (eosinofili nel sangue o nell'espettorato o FeNO). Le analisi post hoc dei risponditori per "raggruppare" i biomarcatori per capire meglio quali pazienti hanno il massimo beneficio da un immunomodulatore biologico porteranno a comprendere che gli aumenti concomitanti di più di 1 biomarcatore infiammatorio di tipo 2 possono identificare ulteriormente i pazienti "rispondenti elevati".

L'ipotesi include l'efficacia del trattamento con mepolizumab nei pazienti asmatici eosinofilici gravi a esordio tardivo con ostruzione fissa e relazione con biomarcatori clinici e infiammatori.

Domande della ricerca C'è qualche miglioramento nel tasso di riacutizzazioni nei pazienti asmatici eosinofilici gravi a esordio tardivo in trattamento con mepolizumab durante il loro primo anno di trattamento e quali sono le caratteristiche dei non-responder e dei super-responder? C'è qualche miglioramento nel rimodellamento delle cellule muscolari lisce? Esistono biomarcatori per predire la risposta al trattamento con mepolizumab nei pazienti asmatici eosinofilici gravi a esordio tardivo? C'è qualche miglioramento dei parametri respiratori? C'è qualche miglioramento nel controllo dell'asma e nella qualità della vita dei pazienti? Obiettivi

Gli obiettivi primari di questo studio sono:

1. Dimostrare l'effetto del trattamento con mepolizumab nel tasso di riacutizzazioni nei pazienti asmatici eosinofilici gravi ad esordio tardivo con ostruzione fissa.
2. Identificare le caratteristiche dei non-responder e dei super-responder.

Gli obiettivi secondari chiave di questo studio sono:

1. Qualsiasi miglioramento nel rimodellamento (ispessimento delle cellule muscolari lisce bronchiali).
2. Eventuali biomarcatori di risposta.
3. Qualsiasi miglioramento dei parametri respiratori nel controllo dell'asma e nella qualità della vita dei pazienti durante il trattamento con mepolizumab in pazienti asmatici eosinofilici gravi ad esordio tardivo con ostruzione fissa.

Disegno dello studio e metodi I pazienti saranno raccolti dalle cliniche ambulatoriali di asma bronchiale di ciascun sito (8 in numero) che coprono la popolazione della Grecia. Tutte queste cliniche sono incluse per rafforzare il reclutamento e per includere esperti di broncoscopisti con impatto internazionale. A causa dell'attuale situazione relativa alla pandemia di Covid-19, i ricercatori presumono che questo studio clinico non interferisca con il carico di lavoro nelle nostre cliniche.

Nel complesso, si tratta di uno studio multicentrico prospettico che comprende otto cliniche polmonari. Cinque Cliniche Universitarie Polmonari, due del Sistema Sanitario Nazionale e un Ospedale Generale dell'Esercito.

Lo studio includerà un periodo di screening fino a 2 settimane per valutare l'idoneità e ottenere il consenso informato scritto, un periodo di trattamento con mepolizumab di 52 settimane, una volta ogni 4 settimane, comprese le visite di follow-up ogni 3 mesi durante il trattamento.

La popolazione dello studio sarà composta da 45 pazienti con asma eosinofilico grave a esordio tardivo e ostruzione fissa trattati con mepolizumab di età pari o superiore a 20 anni.

Partecipazione allo studio, valutazione e follow-up:

Screening: gli investigatori selezioneranno soggetti selezionati presso le cliniche partecipanti (cliniche ambulatoriali per l'asma grave). I soggetti entreranno per firmare il consenso. La valutazione clinica e le procedure e le interviste strutturali saranno eseguite durante lo screening. I soggetti idonei/in grado di completare la visita di screening possono farlo lo stesso giorno e, se necessario, completeranno la loro valutazione di base entro 2 settimane. I soggetti con una riacutizzazione dell'asma in corso devono ritardare la visita di screening e di inizio del trattamento fino a quando lo sperimentatore non ritiene che il soggetto sia tornato al suo stato di asma basale. Se il periodo di screening di 2 settimane è trascorso, il soggetto deve essere considerato un fallimento dello screening. I soggetti rimarranno sulla loro attuale terapia di mantenimento durante i periodi di screening. L'idoneità dei pazienti si baserà sui criteri elencati nelle sezioni successive.

La storia delle riacutizzazioni dell'asma negli ultimi 12 mesi verrà riportata alla visita di screening. Inoltre, le riacutizzazioni saranno valutate ad ogni visita come riportato.

I segni vitali verranno eseguiti alla visita di screening, al basale e ogni 3 mesi. Le misurazioni includeranno la pressione arteriosa sistolica e diastolica, la frequenza cardiaca e la temperatura corporea.

L'altezza in centimetri (cm) e il peso corporeo in chilogrammi (kg) saranno misurati durante le visite di screening. L'indice di massa corporea (BMI) sarà calcolato come il peso in kg diviso per l'altezza in metri quadrati

Valutazione di laboratorio (ematologia, emochimica, analisi delle urine):

Il sangue venoso e l'urina saranno raccolti al basale. Ematologia: l'emoglobina, l'ematocrito, la conta dei globuli rossi, la conta dei globuli bianchi con differenziale e le piastrine saranno misurate nel laboratorio dell'ospedale di ciascuna sede. Saranno valutate chimica clinica di base e analisi delle urine. La raccolta delle urine per i soggetti di sesso femminile valuterà anche la gravidanza.

I livelli di IgE saranno valutati durante la visita di screening utilizzando i test immunoCAP e saranno riportati come IU/mL.

Verranno somministrati i seguenti questionari: 1) Asthma Control Questionnaire (ACQ-5) e Asthma Control Test (ACT) per valutare l'attuale controllo dell'asma; 2) l'Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) per valutare la qualità della vita e la morbilità psicologica. Per valutare ulteriormente la qualità del sonno 1) Athens Insomnia Scale (AIS), 2) Epworth Sleepiness Scale (ESS), 3) St. George's Respiratory Questionnaire (SGRQ) e 4) WHO (Five) Well-Being Index (WHO-5), 5) Scala di gravità della fatica (FSS).

L'ossido nitrico espirato (NO) sarà misurato al basale e ogni 3 mesi secondo le linee guida dell'American Thoracic Society e come specificato dal produttore. I livelli di FeNO saranno riportati come parti per miliardo. Le misurazioni verranno effettuate prima dell'esecuzione della spirometria.

I campioni di sangue venoso verranno prelevati tra le 8 e le 10 del mattino, al basale e ogni 3 mesi durante il periodo di 52 settimane con il trattamento con mepolizumab. La conta assoluta degli eosinofili nel sangue verrà riportata come cellule/μl.

Spirometria: la spirometria A sarà condotta, utilizzando l'attrezzatura del sito durante le visite (basale e ogni 3 mesi). Tutte le visite ambulatoriali devono avvenire al mattino. Durante il periodo di trattamento la spirometria soddisferà le attuali linee guida ATS/ERS e lo spirometro dovrà produrre una stampa di tutti i dati generati, che dovranno essere conservati nelle note del soggetto. Lo spirometro sarà calibrato secondo le istruzioni del produttore. La spirometria deve essere eseguita contemporaneamente (±1 ora) alla spirometria della Visita 0. I soggetti dovrebbero cercare di sospendere i beta-2-agonisti a breve durata d'azione (SABA) per ≥4 ore e i LABA per ≥15 ore prima della visita clinica, se possibile (GINA 2019). Le valutazioni da registrare includeranno FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF e FEF25-75. Le misurazioni post-broncodilatatore verranno effettuate ad ogni visita, utilizzando 200-400 mcg di salbutamolo o equivalente.

Verrà condotta la spirometria B, utilizzando l'attrezzatura del centro durante le visite (basale, dopo 6 mesi e dopo il trattamento a 52 settimane). La spirometria B include diffusione, volumi polmonari e capacità.

Oscillometria a impulsi (opzionale):

L'osillometria a impulsi (IOS) sarà condotta al basale e dopo 52 settimane di trattamento. IOS include resistenza a 5 Hz-resistenza a 20 Hz (R5-R20), una misura che riflette la resistenza respiratoria delle vie aeree periferiche e conduttive di piccole e medie dimensioni, AX, una misura che riflette la distensibilità dei polmoni periferici (vale a dire il parenchima e le piccole vie aeree periferiche) e la reattanza del sistema respiratorio (X5), una misura che riflette l'inerzia e l'elasticità o capacità (comprese le piccole vie aeree periferiche).

Terapia con farmaci biologici:

Al termine delle visite di screening il partecipante può iniziare il trattamento con terapia biologica (mepolizumab) entro un mese. Durante la terapia i soggetti saranno sotto la cura del pneumologo che li ha indirizzati al gruppo di ricerca per la partecipazione allo studio. Questi pneumologi saranno definiti "pneumologi associati". Il trattamento sarà fornito secondo le istruzioni del produttore del prodotto.

Gli pneumologi associati che forniscono cure biologiche durante lo studio dovranno firmare un accordo per condurre lo studio in conformità con il protocollo, riconoscere di essere responsabili della condotta medica e dello studio e garantire che l'associato (e i loro colleghi e dipendenti) che collaborano alla conduzione dello studio sono informati dei loro obblighi. Saranno in atto meccanismi per garantire che il personale associato riceva le informazioni e il supporto appropriati dal gruppo di ricerca durante lo studio.

Follow-up durante la terapia biologica: all'inizio e ad ogni visita per la somministrazione della terapia biologica, la raccolta di informazioni sarà effettuata dal pneumologo associato e con il supporto del gruppo di ricerca, se richiesto dal pneumologo associato, ad es. il contatto facciale intervisterà il paziente. Inoltre, la conformità verrà registrata dal medico in base alla conferma orale del paziente. Ad ogni visita verrà registrata la data e la forma di somministrazione del farmaco, così come gli effetti avversi immediati e ritardati.

Monitoraggio della sicurezza:

Gli eventi avversi registrati (AE) saranno monitorati e raccolti come richiesto nei rapporti di studio. Un evento avverso è la comparsa o il peggioramento di qualsiasi segno, sintomo o condizione medica indesiderata che si verifica dopo l'inizio dell'ingresso nello studio. Le condizioni mediche/malattie presenti prima dell'inizio del farmaco in studio sono considerate eventi avversi solo se peggiorano dopo l'inizio del farmaco in studio. Valori di laboratorio o risultati di test anormali costituiscono eventi avversi solo se inducono segni o sintomi clinici, sono considerati clinicamente significativi o richiedono una terapia. Inoltre, sono inclusi gli eventi avversi correlati a Covid-19. Se uno pneumologo partner o uno staff di ricerca viene a conoscenza di un evento avverso associato a un prodotto, può essere segnalato al produttore secondo la pratica standard locale per la segnalazione spontanea di eventi avversi. Una copia della relazione dovrà essere inviata anche al coordinatore dello studio. Gli eventi avversi gravi (SAE) saranno riportati nelle pagine eCRF ed entro 24 ore tutti gli investigatori avranno la responsabilità di informare il Comitato Centrale di Salonicco. Quindi il Comitato centrale informerà il comitato scientifico e l'Agenzia medica greca. Inoltre, il giudizio medico e scientifico sarà esercitato dal ricercatore principale di ogni centro con il Comitato Centrale, nel decidere se il soggetto debba o meno interrompere il trattamento.

Rapporto di gravidanza:

Inizialmente, le pazienti di sesso femminile allo screening dovranno fare un test di gravidanza. Durante il trattamento, se un soggetto di sesso femminile ci segnala una gravidanza, le verrà chiesto di ritirarsi dallo studio (per evitare pregiudizi) Quindi, le verrà chiesto se desidera continuare a ricevere il trattamento al di fuori di questo protocollo ed essere monitorata a l'ambulatorio di ciascun centro.

Errori di pre-screening e screening:

Ai soggetti verrà assegnato un numero di studio al momento della firma del consenso. I soggetti che hanno firmato ma non passano alla valutazione delle visite di screening saranno considerati un fallimento pre-screening. Nessun dato verrà acquisito nel database per questi soggetti.

I soggetti che completano almeno una delle due visite di screening, ma non iniziano la terapia biologica saranno designati come fallimenti dello screening. Le informazioni da raccogliere per i fallimenti di pre-screening e screening saranno dettagliate nel completamento del database.

Visita di prelievo:

Se un partecipante decide di ritirarsi dallo studio durante il follow-up (per qualsiasi motivo diverso dalla perdita al follow-up), potrebbe essere invitato a partecipare a una visita di ritiro (se ritenuto necessario dallo sperimentatore e previo consenso). Durante la visita, al partecipante possono essere poste domande sulle sue condizioni attuali come parte della raccolta di informazioni cliniche come: asma e sintomi nasali, esacerbazioni e progressione del trattamento ricevuto.

Prelievo e trattamento dei campioni di sangue:

I campioni di sangue verranno raccolti alla visita basale, a 6 mesi e dopo il completamento del trattamento. Dopo aver raccolto i campioni di sangue, questi verranno lasciati indisturbati per circa mezz'ora per la completa formazione del coagulo. Il campione verrà quindi centrifugato per separare il siero dal coagulo. Dopo la centrifugazione il siero verrà conservato a -20° C in provette eppendorf fino al termine dell'analisi. La fenotipizzazione del sangue sarà valutata anche mediante citometria a flusso.

Espettorato indotto (facoltativo):

L'espettorato indotto verrà eseguito al basale prima dell'inizio del trattamento e dopo il completamento del trattamento secondo il rapporto della task force ERS in cui viene suggerita una raccomandazione dettagliata basata sul consenso degli esperti per l'elaborazione dell'espettorato indotto.

Alle visite, l'induzione dell'espettorato verrà eseguita dopo che le valutazioni spirometriche di routine sono state completate.

L'espettorato indotto verrà elaborato entro due ore dalla fine della procedura di induzione presso il sito di ricerca. Le cellule dell'espettorato e il supernatante della sospensione cellulare saranno conservati a -80ºC per l'analisi. Dopo aver raccolto l'espettorato indotto, il supernatante del campione sarà conservato a -20°C in provette eppendorf fino al termine dell'analisi. Seguendo queste procedure, la valutazione di laboratorio dell'espettorato è successiva secondo le linee guida.

Broncoscopia, biopsie bronchiali e raccolta ed elaborazione dei campioni di lavaggio (facoltativo): Alle visite, previo consenso scritto del paziente, verrà eseguita l'endoscopia con biopsie bronchiali, campione di lavaggio bronchiale (Visita 0b). In particolare, sarà incluso un consenso informato separato da firmare da ciascun paziente. La broncoscopia verrà eseguita in due punti temporali (basale prima dell'inizio del trattamento e dopo il completamento del trattamento). La broncoscopia flessibile e le tecniche diagnostiche sono state eseguite sotto anestesia monitorata come raccomandato dall'American Thoracic Society e dalla British Thoracic Society.

I campioni di tessuto saranno fissati in gonfiaggio o immersione utilizzando formaldeide o glutaraldeide e inclusi in paraffina. Le vie aeree saranno sistematicamente campionate o ottenute durante la dissezione diagnostica a discrezione del patologo. Sezioni consecutive di spessore 0,5, 5 e 30 μm sono state tagliate da ciascun blocco e colorate utilizzando la tecnica tricromica di Masson, ematossilina ed eosina ed ematossilina, rispettivamente. La colorazione immunoistochimica sarà eseguita con i seguenti mAbs: anti-mast cell triptase clone AA1 (Dako UK), anti-alpha smooth muscle actina clone 1A4 (Dako UK), anti-eosinophil major basic protein clone BMK-13 (Monosan, Netherlands ), clone anti-neutrofilo elastasi NP57 (Dako UK) e clone anti-endotelio EN4 (Monosan, Paesi Bassi) o controlli isotipici appropriati sono stati utilizzati.

Le biopsie endobronchiali saranno valutate da un singolo osservatore cieco alle caratteristiche cliniche (software di analisi delle immagini ZEN 2012 per microscopia ottica, Carl Zeiss AG, Germania) e saranno espresse come media delle misurazioni effettuate da un minimo di due sezioni o da indipendenti biopsie o come sezioni di tessuto non contigue distanti almeno 20μm dalla stessa biopsia. L'integrità epiteliale sarà valutata misurando la lunghezza dell'epitelio intatto e denudato. Questi saranno espressi come percentuale di tutta la lunghezza della membrana basale reticolare (RBM). La vascolarizzazione sarà misurata utilizzando il conteggio di Chalkley, un surrogato sia della densità vascolare che dell'area vascolare. Un reticolo oculare di Chalkley (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, UK) verrà utilizzato a x200 per misurare i conteggi di Chalkley in quattro hotspot vascolari non sovrapposti (6). Il contenuto di muscolatura liscia delle vie aeree sarà determinato come proporzione dell'area totale. Le cellule infiammatorie sono state espresse come numero di cellule nucleate/area della lamina propria.

I campioni di lavaggio bronchiale verranno immediatamente trasportati in laboratorio, per essere conservati a -80 gradi. L'esame dei fluidi di lavaggio bronchiale verrà eseguito in una fase successiva per determinare diversi biomarcatori.

Analisi dei biomarcatori di infiammazione con Flow Cytometry Analysis (FACS) o ELIZA:

Biomarcatori inclusi prima e dopo il trattamento con mepolizumab in due o tre punti temporali (al basale, a 6 mesi di trattamento e dopo la visita di completamento del trattamento): sottoinsiemi di linfociti, citochine Th2/Th17, chemochine, espressione di microRNA da quantificare mediante citometria a flusso o ELISA) nei fluidi biologici (sangue, siero, lavaggio bronchiale, espettorato e supernatante dell'espettorato).

I kit del pannello e gli anticorpi appropriati saranno testati mediante analisi del citometro a flusso utilizzando un sistema BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA), secondo le raccomandazioni e le istruzioni del produttore.

ELISA (saggio immunosorbente legato all'enzima) è una tecnica di analisi basata su piastra progettata per rilevare e quantificare sostanze come peptidi, proteine, anticorpi e ormoni. I kit ELISA saranno analizzati utilizzando lo spettrofotometro VICTOR X3 secondo le raccomandazioni e le istruzioni del produttore.

Test allergologici (se applicabile) Lo stato atopico dei pazienti sarà valutato (se non disponibile) alla visita di screening mediante il prick test cutaneo (SPT) a un pannello standard di aeroallergeni per rilevare gli anticorpi IgE totali contro vari allergeni inalanti comuni.

Database Una piattaforma di raccolta dati elettronica sarà il metodo utilizzato al basale ogni 3 mesi fino a 1 anno di follow-up per questo database. Durante le visite di trattamento moduli cartacei/questionari saranno compilati dal pneumologo associato. Ogni sito inserirà dati specifici in un database elettronico. Ogni paziente è identificato in modo univoco da un numero di Soggetto che è composto dal numero del sito assegnato dal sito di monitoraggio responsabile e da un numero progressivo assegnato dallo sperimentatore. Dopo aver firmato il modulo di consenso informato, al paziente viene assegnato dallo sperimentatore il successivo numero sequenziale. Il sito deve contattare il personale di ricerca centrale e fornire le informazioni identificative richieste per il paziente come registrato nel database elettronico. I moduli per le visite terapeutiche saranno inviati anche al personale di ricerca centrale. Il personale dello studio autorizzato sarà responsabile della raccolta dei dati, della modifica e anche della protezione dei dati raccolti presso il proprio sito e il backup del database viene eseguito su base giornaliera. La revisione/controllo della qualità sarà responsabilità congiunta di tutte le persone coinvolte e del personale di ricerca centrale [custode dei dati].

Calcolo della dimensione del campione Analisi della potenza G La dimensione del campione viene calcolata utilizzando il software G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Germania). La differenza nel tasso annuale di esacerbazione dei pazienti con asma eosinofilo grave a insorgenza tardiva prima e dopo il trattamento con Mepolizumab è l'endpoint primario dello studio. Nello studio DREAM (uno degli unici due studi che finora ha riportato risultati simili al nostro endpoint primario) è stato riportato che il tasso annuale di esacerbazione dei pazienti con asma grave è diminuito da 3,6 a 1,33 dopo l'inizio del trattamento con Mepolizumab. Utilizzando questi dati e un test a due code, con una potenza di 0,95 e un livello di significatività statistica di 0,05, i ricercatori hanno calcolato una dimensione dell'effetto di 0,556, che indicava una dimensione totale del campione di 45 partecipanti.

Analisi del piano statistico L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando il software statistico SPSS (versione 21.0 IBM SPSS, Armonk, NY, USA). Le variabili categoriali saranno indicate come numeri (n) e percentuali (%), variabili continue come media ± SD se distribuite normalmente, o mediane e intervalli interquartili se diversamente. Ove necessario verranno trasformate variabili prive di distribuzione normale. P <0,05 è stato accettato come statisticamente significativo. Verrà eseguito il test di Shapiro-Wilk per separare le variabili parametriche da quelle non parametriche. Per rilevare le differenze nelle variabili misurate prima e dopo il trattamento con mepolizumab verrà utilizzato il test T per campioni accoppiati per il test parametrico o Wilcoxon Signed Ranks per le variabili non parametriche.

Non esiste un braccio di confronto poiché ogni paziente ha il controllo su se stesso. Esistono caratteristiche basali (biomarcatori clinici e di laboratorio) che verranno misurate al basale, ogni 3 mesi e dopo il completamento del trattamento di 52 settimane. Gli endpoint dello studio includono l'analisi di tutti quei biomarcatori come l'identificazione delle caratteristiche dei non-responder e dei super-responder. Inoltre, gli endpoint secondari includono la valutazione dei biomarcatori menzionati nei metodi come valutazioni. Inizialmente verrà eseguita un'analisi statistica con il numero di pazienti che hanno completato il periodo di trattamento di 52 settimane. In secondo luogo, i pazienti che non hanno completato il trattamento di 52 settimane verranno analizzati separatamente e infine questi due gruppi verranno confrontati tra loro.

Più specificamente, con l'analisi univariata (test di campioni indipendenti a due code) i ricercatori testeranno le associazioni/correlazioni tra tutti gli esiti al basale rispetto a quelli dopo i trattamenti con mepolizumab (ogni 3 mesi fino a 1 anno di trattamento): biomarcatori nell'espettorato e nel sangue , esiti clinici. Allo stesso modo, le associazioni univariate tra i risultati e le caratteristiche personali/demografiche saranno testate per identificare potenziali fattori confondenti. Le associazioni significative saranno quindi testate con modelli di regressione adattati. Le associazioni/correlazioni saranno valutate separatamente alle caratteristiche cliniche al basale e ogni 3 mesi di follow-up durante il trattamento, nonché al basale e dopo 1 anno di trattamento con mepolizumab. Inoltre, per ciascun biomarcatore verrà eseguita un'analisi di sottogruppo per l'identificazione del livello di biomarcatore alla risposta al trattamento.

Per rilevare le differenze nelle variabili misurate prima e dopo il trattamento con mepolizumab verrà utilizzato il test T per campioni accoppiati per il test parametrico o Wilcoxon Signed Ranks per le variabili non parametriche. In particolare, i livelli di biomarcatori al basale saranno confrontati con i livelli dopo 1 anno di trattamento con mepolizumab.

La risposta complessiva al trattamento in un anno (dal basale a 1 anno dopo l'inizio del trattamento) per ciascun risultato sarà misurata con test accoppiati di campioni dipendenti (test accoppiati parametrici e non parametrici) in ciascun paziente. Quindi la risposta al trattamento sarà definita come la variazione (assoluta e % di variazione) del risultato in un anno. Gli investigatori valuteranno i predittori che influenzano la risposta al trattamento (cambiamento) come i biomarcatori utilizzando più modelli di regressione per ciascun risultato clinicopatologico. Per i risultati con più di 2 osservazioni per soggetto durante il periodo di studio i ricercatori utilizzeranno modelli misti utilizzando le misurazioni ripetute del risultato. Tutti i test saranno a 2 code con un livello di significatività statistica al 5%.