Эффективность меполизумаба при тяжелой астме (MESILICO) (MESILICO)

Научное обоснование Интерлейкин (ИЛ)-5 является основным цитокином, ответственным за активацию эозинофилов, поэтому были исследованы и разработаны терапевтические стратегии для клинического применения. Биопрепараты, воздействующие на ИЛ-5 и его рецептор (сначала меполизумаб, а затем реслизумаб и бенрализумаб), недавно были одобрены и используются в качестве дополнительной терапии тяжелой эозинофильной астмы, что приводит к снижению количества циркулирующих эозинофилов, улучшению функции легких и обострению. снижение числа пациентов с тяжелой астмой.

Реакция на биологическую терапию при тяжелой астме вариабельна: пациенты либо не отвечают, либо отвечают, либо суперреагируют. В настоящее время нет объяснения этому широкому разбросу ответов. Важно изучить, имеют ли эти пациенты отличительные характеристики, которые могли бы помочь лечащему врачу поставить правильный диагноз в клинической практике.

Целью данного клинического исследования является оценка эффективности меполизумаба, гуманизированного моноклонального антитела к антагонисту ИЛ-5, у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и фиксированной обструкцией, а также выявление характеристик нон-респондеров и суперреспондеров при лечении меполизумабом. Это исследование считается неинтервенционным, и каждая включенная в него процедура проводится в клинической рутине для диагностики и фенотипирования пациентов с астмой.

Для исследования воспаления дыхательных путей используется несколько методов: прямые измерения (такие как биопсия бронхов или бронхоальвеолярный лаваж) и косвенные методы (такие как оценка симптомов, анализ образцов крови и тесты функции легких). Преимущество прямых методов заключается в надежной оценке воспаления дыхательных путей, но они инвазивны и не применимы в больших масштабах из-за дискомфорта пациента и связанного с этим риска. Что касается непрямых методов, то они плохо коррелируют с прямой оценкой воспаления дыхательных путей.

В этом исследовании среди клинических характеристик пациентов будут оцениваться спирометрия, биомаркеры воспаления (эозинофилы крови, уровни FeNO, IgE), импульсная осциллометрия (IOS) и утолщение базальной мембраны с помощью бронхоскопии. Предполагается, что у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и фиксированной обструкцией, которые не реагируют на обычное лечение (ИГКС/ДДБА/ДДАХ), наблюдается увеличение гладкомышечной массы. Однако точное влияние увеличения массы гладких мышц дыхательных путей на сужение дыхательных путей неизвестно и может варьироваться в зависимости от тяжести заболевания. Кроме того, биомаркеры воспаления также будут оцениваться до и после 52-недельного лечения меполизумабом в биологических жидкостях (сыворотка, мокрота, супернатант мокроты и образцы бронхов). Биомаркеры воспаления очень важны для выявления респондеров и нереспондеров.

Более конкретно, IOS был введен в качестве альтернативного метода оценки функции легких с особым применением при астме. Этот метод является неинвазивным, легко выполняется во время спокойного дыхания и требует минимального участия пациента.

Сбор мокроты — еще один способ забора клеток из дыхательных путей, который позволяет напрямую оценить воспаление дыхательных путей. Кроме того, примеры с супернатантом мокроты включают анализ медиаторов и оценку хемотаксической активности образца на эозинофилы. Клетки мокроты также можно анализировать с помощью проточной цитометрии, которая позволяет, среди прочего, проводить иммунофенотипирование и сортировку клеток. Кроме того, клетки мокроты можно культивировать и измерять продукцию ими медиаторов in vitro. Стоит отметить, что в этом случае содержание медиатора отличается от того, что можно обнаружить в надосадочной жидкости мокроты. Действительно, на медиаторы в супернатанте мокроты могут влиять выделения из резидентных клеток дыхательных путей и экссудация плазмы, в отличие от модели культуры клеток мокроты. Наконец, иммуноцитохимия и гибридизация in situ также могут быть выполнены с использованием клеток мокроты.

Хотя фенотипы, эозинофилы крови и уровни IgE в сыворотке были предложены для использования в качестве эталона, существует диссоциация между уровнем иммунных клеток в крови и иммунной реакцией эпителия дыхательных путей, как было подтверждено в предыдущих исследованиях. Иммуногистохимическое окрашивание эпителия дыхательных путей на иммунные клетки-мишени использовалось для определения различных типов воспаления дыхательных путей; однако этот метод редко используется в клинических условиях. Предыдущие исследования выявили относительную безопасность выполнения биопсии при бронхоскопии у пациентов с тяжелой астмой. Среди методов взятия проб, используемых для диагностики тканей, включая биопсию носа, чистку носа или бронхов и бронхоальвеолярный лаваж, взятие проб бронхиального эпителия под контролем бронхоскопии дает более точную информацию об эпителиальных и воспалительных клетках в контексте ткани. Таким образом, это мощный инструмент для выбора наиболее подходящих биологических препаратов в сложных клинических условиях.

Кроме того, для астматического заболевания характерен хронический воспалительный процесс слизистой оболочки, приводящий к необратимым изменениям бронхиальной стенки, известным сегодня как «ремоделирование бронхов». Частью этих морфологических изменений являются гиперплазия и/или гипертрофия железистых и гладкомышечных волокон, гиперплазия бокаловидных клеток и вариабельное утолщение базальной мембраны (БМ) под респираторным эпителием. изменения, возникающие на границе эпителия и соединительной ткани, объясняют «адаптивный ответ» на воспалительный стресс и спорадическую бронхоконстрикцию. Однако современные данные о реактивности БМ у больных астмой все еще неполны для точной оценки его участия в патогенезе и, в частности, в ремоделировании бронхиальной стенки, в основном из-за того, что отложения коллагена в сетчатой ​​пластинке не коррелируют со степенью тяжести заболевания.

Более того, становится все более очевидным, что тяжелая астма не является единым заболеванием, о чем свидетельствует разнообразие клинических проявлений, физиологических характеристик и исходов у пациентов с астмой. Чтобы лучше понять эту гетерогенность, появилась концепция фенотипирования и эндотипирования астмы. Фенотипирование объединяет как биологические, так и клинические характеристики, от молекулярных, клеточных, морфологических и функциональных до характеристик, ориентированных на пациента, с целью улучшения терапии. В конечном счете, эти фенотипы развиваются в «эндотипы» астмы, которые сочетают клинические характеристики с идентифицируемыми механистическими путями. Биомаркеры, определяемые как характеристики, которые могут быть объективно измерены и служат индикатором основных биологических процессов или патогенеза, имеют решающее значение для определения фенотипов и эндотипов. При астме генетические полиморфизмы, показатели физиологии дыхательных путей и уровни медиаторов воспаления в моче, крови, мокроте, тканях, выдыхаемом газе и конденсате дыхания изучались как потенциальные маркеры для улучшения и объективизации диагностики и лечения астмы. Разработка таких инструментов позволит нам фенотипировать и эндотипировать различные клинические паттерны, описанные при астме, с конечной целью адаптации терапии на основе определенного профиля биомаркеров. Затем можно использовать биомаркеры, чтобы помочь лучше понять фармакологический ответ на вмешательство и соответствующим образом скорректировать терапию.

Биомаркеры имеют решающее значение для изучения патогенеза заболевания и разработки новых методов лечения тяжелой астмы. В частности, биомаркеры воспаления типа 2 оказались ценными для эндотипирования и нацеливания на новые биологические агенты. Из-за этих успехов в понимании и маркировке воспаления типа 2 недостаток знаний о воспалительных механизмах, отличных от типа 2, при астме вскоре станет основным препятствием для разработки новых методов лечения и стратегий лечения тяжелой астмы. Другие потенциальные биомаркеры включают врожденные лимфоидные клетки, IL-33 или стромальный лимфопоэтин тимуса.

Недавние публикации подтвердили решающую регуляторную роль микроРНК в патомеханизме астмы. Некоторые отдельные микроРНК или их наборы перспективны для использования в качестве биомаркеров астмы, облегчающих диагностику или прогнозирование результатов лечения. Они также являются возможной мишенью будущих методов лечения. Однако исследований в этой области недостаточно. Недавно было показано, что большинство вовлеченных микроРНК увеличивают секрецию цитокинов Th2, снижают секрецию цитокинов Th1, способствуют дифференцировке Т-клеток в сторону Th2 или играют роль в гиперплазии и гипертрофии гладкомышечных клеток бронхов. Профили микроРНК коррелируют с клиническими характеристиками, включая функцию легких, фенотип и тяжесть астмы.

В большинстве биологических клинических испытаний, спонсируемых промышленностью, описанный выше подход эффективно использовался путем выбора субъектов исследования, которые напоминают клинические фенотипы тяжелой астмы SARP (высокоинтенсивные схемы лечения, частые обострения и низкая функция легких), но затем требуют повышенного биомаркера (в кровь, выдыхаемый газ или мокрота), которые должны идентифицировать пациентов, которые с наибольшей вероятностью будут реагировать на специфический иммуномодулятор в пределах этих клинических фенотипов. Биопрепараты в недавно опубликованных клинических испытаниях нацелены на пути воспаления 2-го типа и ограничивают участие субъектов с повышенными биомаркерами 2-го типа (эозинофилы в крови или мокроте или FeNO). Post hoc анализ респондентов для «группировки» биомаркеров, чтобы лучше понять, какие пациенты получают наибольшую пользу от биологического иммуномодулятора, приведет к пониманию того, что одновременное повышение более чем 1 биомаркера воспаления типа 2 может дополнительно идентифицировать пациентов с «высоким респондером».

Гипотеза включает эффективность лечения меполизумабом у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и фиксированной обструкцией, а также связь с клиническими и воспалительными биомаркерами.

Вопросы исследования Есть ли какое-либо улучшение частоты обострений у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом при лечении меполизумабом в течение 1-го года лечения и каковы характеристики пациентов без ответа и суперответа? Есть ли улучшения в ремоделировании гладкомышечных клеток? Существуют ли какие-либо биомаркеры для прогнозирования ответа на лечение меполизумабом у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом? Есть ли улучшение параметров дыхания? Есть ли улучшение в контроле над астмой и в качестве жизни пациентов? Цели

Основными задачами этого исследования являются:

1. Продемонстрировать влияние лечения меполизумабом на частоту обострений у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и фиксированной обструкцией.
2. Определить характеристики нереспондеров и суперреспондеров.

Ключевыми вторичными целями этого исследования являются:

1. Любое улучшение ремоделирования (утолщение гладкомышечных клеток бронхов).
2. Любые возможные биомаркеры ответа.
3. Любое улучшение респираторных параметров при контроле астмы и качества жизни пациентов во время лечения меполизумабом у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и фиксированной обструкцией.

Дизайн и методы исследования Пациенты будут отобраны из амбулаторных клиник бронхиальной астмы из каждого места (8), которые охватывают население Греции. Все эти клиники включены для усиления набора, а также для включения экспертов по бронхоскопии с международным влиянием. В связи с текущей ситуацией, связанной с пандемией Covid-19, исследователи предполагают, что это клиническое исследование не влияет на рабочую нагрузку в наших клиниках.

В целом, это проспективное многоцентровое исследование, включающее восемь пульмонологических клиник. Пять легочных университетских клиник, две Национальной системы здравоохранения и один армейский госпиталь общего профиля.

Исследование будет включать период скрининга продолжительностью до 2 недель для оценки приемлемости и получения письменного информированного согласия, период лечения меполизумабом продолжительностью 52 недели, один раз каждые 4 недели, включая контрольные визиты каждые 3 месяца во время лечения.

Исследуемая популяция будет состоять из 45 пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и фиксированной обструкцией, получающих меполизумаб, в возрасте 20 лет и старше.

Участие в исследовании, оценка и последующее наблюдение:

Скрининг: Исследователи проведут скрининг выбранных субъектов в участвующих клиниках (амбулаторных клиниках для пациентов с тяжелой астмой). Субъекты придут, чтобы подписать согласие. Клиническая оценка и процедуры, а также структурные интервью будут проводиться во время скрининга. Субъекты, которые имеют право / могут пройти скрининговый визит, могут сделать это в тот же день, и, при необходимости, они завершат свою базовую оценку в течение 2 недель. Субъектам с продолжающимся обострением астмы следует отложить визит для скрининга и начала лечения до тех пор, пока исследователь не сочтет, что субъект вернулся к своему исходному статусу астмы. Если 2-недельный период скрининга истек, то субъект следует считать не прошедшим скрининг. Субъекты будут продолжать свою текущую поддерживающую терапию в течение всего периода скрининга. Приемлемость пациентов будет основываться на критериях, перечисленных в следующих разделах.

История обострений астмы за последние 12 месяцев будет сообщена во время скринингового визита. Кроме того, обострения будут оцениваться при каждом посещении, как сообщается.

Основные показатели жизнедеятельности будут оцениваться во время скринингового визита, на исходном уровне и каждые 3 месяца. Измерения будут включать систолическое и диастолическое артериальное давление, частоту пульса и температуру тела.

Рост в сантиметрах (см) и масса тела в килограммах (кг) будут измеряться во время скрининговых посещений. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывается делением веса в кг на рост в метрах в квадрате.

Лабораторная оценка (гематология, биохимический анализ крови, анализ мочи):

Венозная кровь и моча будут собраны на исходном уровне. Гематология: гемоглобин, гематокрит, количество эритроцитов, количество лейкоцитов с дифференциалом и тромбоциты будут измеряться в лаборатории каждой больницы. Будут оцениваться основные клинические биохимические показатели и анализ мочи. Сбор мочи у женщин также позволит оценить беременность.

Уровни IgE будут оцениваться при скрининговом посещении с использованием тестов ImmunoCAP и будут представлены в виде МЕ/мл.

Будут проводиться следующие анкеты: 1) Анкета по контролю над астмой (ACQ-5) и Тест по контролю над астмой (ACT) для оценки текущего контроля над астмой; 2) Опросник качества жизни при астме (AQLQ+12) для оценки качества жизни и психологической заболеваемости. Для дальнейшей оценки качества сна 1) Афинская шкала бессонницы (AIS), 2) Шкала сонливости Эпворта (ESS), 3) Респираторный опросник Святого Георгия (SGRQ) и 4) Индекс благополучия ВОЗ (пять) (WHO-5), 5) Шкала тяжести усталости (FSS).

Выдыхаемый оксид азота (NO) будет измеряться исходно и каждые 3 месяца в соответствии с рекомендациями Американского торакального общества и указаниями производителя. Уровни FeNO будут представлены в виде частей на миллиард. Измерения будут проводиться до проведения спирометрии.

Образцы венозной крови будут браться с 8 до 10 утра, в начале исследования и каждые 3 месяца в течение 52-недельного периода лечения меполизумабом. Абсолютное количество эозинофилов в крови будет указано в виде клеток/мкл.

Спирометрия: Спирометрия А будет проводиться с использованием собственного оборудования во время посещений (базовый уровень и каждые 3 месяца). Все визиты в клинику должны происходить утром. В течение периода лечения спирометрия будет соответствовать текущим рекомендациям ATS/ERS, а спирометр должен производить распечатку всех полученных данных, которые следует хранить в заметках пациента. Спирометр будет откалиброван в соответствии с инструкциями производителя. Спирометрию необходимо проводить одновременно (±1 час) со спирометрией визита 0. Субъекты должны попытаться воздержаться от приема бета-2-агонистов короткого действия (КДБА) в течение ≥4 часов и ДДБА за ≥15 часов до посещения клиники, если это возможно (GINA 2019). Записываемые оценки будут включать ОФВ1, ФЖЕЛ, ОФВ1/ФЖЕЛ%, ПСВ и ФЖЕЛ25-75. Постбронхорасширяющие измерения будут проводиться при каждом посещении с использованием 200-400 мкг альбутерола или его эквивалента.

Спирометрия B будет проводиться с использованием собственного оборудования во время посещений (исходный уровень, через 6 месяцев и после лечения через 52 недели). Спирометрия B включает диффузию, легочные объемы и емкости.

Импульсная осциллометрия (опционально):

Импульсная осциллометрия (ИОС) будет проводиться в начале исследования и через 52 недели лечения. IOS включает сопротивление при 5 Гц — сопротивление при 20 Гц (R5-R20), показатель, отражающий дыхательное сопротивление проводящих и периферических дыхательных путей малого и среднего размера, AX, показатель, отражающий растяжимость периферических легких (а именно паренхимы и мелких периферических дыхательных путей). , и реактивность дыхательной системы (X5), мера, отражающая инертность и эластичность или емкость (включая малые периферические дыхательные пути).

Терапия биопрепаратами:

По завершении скрининговых визитов участник может начать лечение биологической терапией (меполизумаб) в течение месяца. Во время терапии испытуемые будут находиться под наблюдением пульмонолога, направившего их в исследовательскую группу для участия в исследовании. Эти пульмонологи будут называться «младшими пульмонологами». Лечение будет проводиться в соответствии с инструкциями производителя продукта.

Ассоциированные пульмонологи, предоставляющие биологическую терапию во время исследования, должны будут подписать соглашение о проведении исследования в соответствии с протоколом, признать, что он/она несет ответственность за медицинское поведение и проведение исследования, а также гарантировать, что ассоциированный (и их коллеги) и сотрудники), оказывающие помощь в проведении исследования, информируются об их обязанностях. Будут созданы механизмы для обеспечения того, чтобы ассоциированный персонал получал соответствующую информацию и поддержку со стороны исследовательской группы на протяжении всего исследования.

Последующее наблюдение во время биологической терапии: в начале и при каждом посещении для введения биологической терапии сбор информации будет осуществляться младшим пульмонологом и при поддержке исследовательской группы, если этого потребует младший пульмонолог, например, исследователи по телефону или лично. контакт с лицом возьмет интервью у пациента. Кроме того, соблюдение будет зарегистрировано врачом на основании устного подтверждения пациента. При каждом посещении будет фиксироваться дата введения препарата, а также немедленные и отсроченные побочные эффекты.

Мониторинг безопасности:

Зарегистрированные нежелательные явления (НЯ) будут отслеживаться и сопоставляться в соответствии с требованиями в отчетах об исследованиях. Нежелательным явлением является появление или ухудшение любого нежелательного признака, симптома или состояния здоровья, возникающее после начала участия в исследовании. Медицинские состояния/заболевания, имевшиеся до начала приема исследуемого препарата, считаются нежелательными явлениями только в том случае, если они ухудшаются после начала приема исследуемого препарата. Аномальные лабораторные значения или результаты анализов представляют собой нежелательные явления только в том случае, если они вызывают клинические признаки или симптомы, считаются клинически значимыми или требуют лечения. Также включены нежелательные явления, связанные с Covid-19. Если партнер-пульмонолог или исследовательский персонал узнают о НЯ, связанном с продуктом, об этом можно сообщить производителю в соответствии с их местной стандартной практикой для спонтанных сообщений о НЯ. Копия отчета также должна быть отправлена ​​координатору исследования. О серьезных нежелательных явлениях (СНЯ) будет сообщено на страницах eCRF, и в течение 24 часов все следователи будут обязаны проинформировать Центральный комитет в Салониках. Затем ЦК проинформирует научный совет и Греческое медицинское агентство. Кроме того, главный исследователь каждого центра вместе с Центральным комитетом будет принимать медицинские и научные решения при принятии решения о том, следует ли субъекту прекратить лечение или нет.

Отчет о беременности:

Первоначально пациентки женского пола при скрининге должны будут сделать тест на беременность. Во время лечения, если субъект женского пола сообщает нам о беременности, ее попросят выйти из исследования (для предотвращения систематической ошибки). Затем ее спросят, хочет ли она продолжать лечение вне этого протокола и находиться под наблюдением в поликлинике каждого центра.

Неудачи предварительного скрининга и скрининга:

Субъектам будет присвоен номер исследования во время подписания согласия. Субъекты, которые подписались, но не прошли оценку посещений скрининга, будут считаться не прошедшими скрининг. Данные по этим субъектам не будут занесены в базу данных.

Субъекты, завершившие хотя бы одно из двух визитов для скрининга, но не начавшие биологическую терапию, будут считаться неудачниками скрининга. Информация, которую необходимо собрать для предварительного скрининга и сбоев скрининга, будет подробно описана при заполнении базы данных.

Выходной визит:

Если участник решит выйти из исследования во время последующего наблюдения (по любой причине, кроме потери для последующего наблюдения), его могут попросить посетить визит для отмены (если исследователь сочтет это необходимым и при условии согласия). Во время посещения участнику могут быть заданы вопросы об их текущем состоянии в рамках сбора клинической информации, такой как: астма и назальные симптомы, обострения и прогрессирование получаемого лечения.

Сбор и обработка образцов крови:

Образцы крови будут собираться при исходном посещении, через 6 месяцев и после завершения лечения. После сбора образцов крови их оставляют в покое примерно на полчаса для полного образования сгустка. Затем образец центрифугируют, чтобы отделить сыворотку от сгустка. После центрифугирования сыворотка будет храниться при -20°C в пробирках Эппендорф до проведения анализа. Фенотипирование крови также будет оцениваться с помощью проточной цитометрии.

Индуцированная мокрота (необязательно):

Индуцированная мокрота будет выполняться на исходном уровне до начала лечения и после завершения лечения в соответствии с отчетом Целевой группы ERS, в котором предлагается подробная, основанная на консенсусе экспертов рекомендация по обработке индуцированной мокроты.

При посещении индукция мокроты будет проводиться после завершения обычных спирометрических оценок.

Индуцированная мокрота будет обработана в течение двух часов после окончания процедуры индукции в исследовательском центре. Клетки мокроты и супернатант клеточной суспензии будут храниться при температуре -80ºC для анализа. После сбора индуцированной мокроты супернатант образца будет храниться при температуре -20°C в пробирках Эппендорф до проведения анализа. После этих процедур следует лабораторная оценка мокроты в соответствии с рекомендациями.

Бронхоскопия, сбор и обработка образцов биопсии бронхов и смывов (по желанию): во время посещений эндоскопия с биопсией бронхов, образец смыва бронхов (посещение 0b) будет проводиться с письменного согласия пациента. В частности, будет включено отдельное информированное согласие, которое будет подписано каждым пациентом. Бронхоскопия будет выполняться в двух временных точках (исходный уровень до начала лечения и после завершения лечения). Гибкая бронхоскопия и диагностические методы выполнялись под контролем анестезии в соответствии с рекомендациями Американского торакального общества и Британского торакального общества.

Образцы тканей фиксируют путем надувания или погружения с использованием формальдегида или глутарового альдегида и заливают в парафин. Образцы дыхательных путей будут систематически браться или получаться во время диагностического рассечения по усмотрению патологоанатома. Из каждого блока вырезали последовательные срезы толщиной 0,5, 5 и 30 мкм и окрашивали с использованием трихромной методики Массона, гематоксилином и эозином и гематоксилином соответственно. Иммуногистохимическое окрашивание будет выполнено с использованием следующих mAb: клон AA1 триптазы тучных клеток (Dako UK), клон 1A4 анти-альфа-актина гладких мышц (Dako UK), клон основного основного белка эозинофилов BMK-13 (Monosan, Нидерланды). ), антинейтрофильный эластазный клон NP57 (Dako UK) и антиэндотелиальный клон EN4 (Monosan, Нидерланды) или соответствующие изотипические контроли.

Эндобронхиальные биопсии будут оцениваться одним наблюдателем, не имеющим представления о клинических характеристиках (программное обеспечение для анализа изображений ZEN 2012 для световой микроскопии, Carl Zeiss AG, Германия), и будут выражены как среднее значение измерений, выполненных как минимум на двух срезах либо на независимых биопсии или в виде несмежных срезов ткани на расстоянии не менее 20 мкм от той же биопсии. Целостность эпителия оценивают путем измерения длины интактного и оголенного эпителия. Они будут выражены в процентах от всей длины ретикулярной базальной мембраны (RBM). Сосудистость будет измеряться с использованием счетчика Чалкли, суррогатного показателя как плотности сосудов, так и площади сосудов. Окулярная сетка Chalkley (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, Великобритания) будет использоваться с увеличением x200 для измерения количества Chalkley в четырех неперекрывающихся сосудистых горячих точках (6). Содержание гладкой мускулатуры дыхательных путей будет определяться как доля от общей площади. Воспалительные клетки выражали как количество ядерных клеток/площадь собственной пластинки.

Образцы смывов бронхов будут немедленно доставлены в лабораторию для хранения при температуре -80 градусов. На более позднем этапе будет проведено исследование жидкостей для промывания бронхов для определения нескольких биомаркеров.

Анализ биомаркеров воспаления с помощью анализа проточной цитометрии (FACS) или ELIZA:

Биомаркеры, включенные до и после лечения меполизумабом в двух или трех временных точках (исходный уровень, через 6 месяцев лечения и визит после завершения лечения): субпопуляции лимфоцитов, цитокины Th2/Th17, хемокины, экспрессия микроРНК для количественного определения с помощью проточной цитометрии или ELISA) в биологических жидкостях (кровь, сыворотка, бронхиальный смыв, мокрота и супернатант мокроты).

Наборы панелей и соответствующие антитела будут протестированы с помощью анализа на проточном цитометре с использованием системы BD FACS Calibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) в соответствии с рекомендациями и инструкциями производителя.

ELISA (иммуноферментный анализ) — это метод анализа на планшетах, предназначенный для обнаружения и количественного определения таких веществ, как пептиды, белки, антитела и гормоны. Наборы ELISA будут проанализированы с использованием спектрофотометра VICTOR X3 в соответствии с рекомендациями и инструкциями производителя.

Тестирование на аллергию (если применимо) Атопический статус пациентов будет оцениваться (если он недоступен) при скрининговом посещении с помощью кожного прик-теста (КПТ) на стандартной панели аэроаллергенов для выявления суммарных антител IgE к различным распространенным ингаляционным аллергенам.

База данных Платформа электронного сбора данных будет методом, используемым на исходном уровне каждые 3 месяца до последующего 1 года для этой базы данных. Во время лечебных посещений младший пульмонолог будет заполнять бумажные формы/анкеты. Каждый сайт будет вносить определенные данные в электронную базу данных. Каждый пациент однозначно идентифицируется по номеру субъекта, который состоит из номера центра, присвоенного ответственным центром мониторинга, и порядкового номера, присвоенного исследователем. После подписания формы информированного согласия пациенту исследователь присваивает следующий порядковый номер. Сайт должен связаться с центральным исследовательским персоналом и предоставить запрошенную идентификационную информацию для пациента, зарегистрированного в электронной базе данных. Бланки визитов для лечения также будут отправлены центральному исследовательскому персоналу. Уполномоченный исследовательский персонал будет нести ответственность за сбор данных, редактирование, а также защиту данных, собираемых на их собственном сайте, а база данных ежедневно резервируется. Обзор/контроль качества будет совместной обязанностью всех вовлеченных лиц и центрального исследовательского персонала [хранителя данных].

Расчет размера выборки Анализ G-мощности Размер выборки рассчитывается с использованием программного обеспечения G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Germany). Разница в годовой частоте обострений у пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом до и после лечения меполизумабом является основной конечной точкой исследования. В исследовании DREAM (одном из двух исследований, в которых до сих пор сообщались результаты, аналогичные нашей основной конечной точке) сообщалось, что ежегодная частота обострений у пациентов с тяжелой астмой снизилась с 3,6 до 1,33 после начала лечения меполизумабом. Используя эти данные и двусторонний тест с мощностью 0,95 и уровнем статистической значимости 0,05, исследователи рассчитали размер эффекта 0,556, что указывает на общий размер выборки 45 участников.

Анализ статистического плана Статистический анализ будет выполняться с использованием SPSS (статистическое программное обеспечение IBM SPSS версии 21.0, Армонк, штат Нью-Йорк, США). Категориальные переменные будут указаны как числа (n) и проценты (%), непрерывные переменные как среднее ± стандартное отклонение, если они нормально распределены, или медианы и межквартильные диапазоны, если иное. При необходимости переменные без нормального распределения будут преобразованы. Р < 0,05 считалось статистически значимым. Будет проведен тест Шапиро-Уилка, чтобы отделить параметрические переменные от непараметрических. Для выявления различий в переменных, измеренных до и после лечения меполизумабом, будет использоваться Т-критерий парных выборок для параметрических или критерий знаковых рангов Уилкоксона для непараметрических переменных.

Нет руки сравнения, так как каждый пациент контролирует сам себя. Существуют исходные характеристики (клинические и лабораторные биомаркеры), которые будут измеряться на исходном уровне, каждые 3 месяца и после завершения 52-недельного курса лечения. Конечные точки исследования включают анализ всех этих биомаркеров для выявления характеристик нереспондеров и суперреспондеров. Также вторичные конечные точки включают оценку биомаркеров, упомянутых в методах в качестве оценок. Сначала будет проведен статистический анализ числа пациентов, завершивших 52-недельный период лечения. Во-вторых, пациенты, не завершившие 52-недельный курс лечения, будут проанализированы отдельно, и, наконец, эти две группы будут сравниваться друг с другом.

В частности, с помощью одномерного анализа (двухсторонних независимых выборочных тестов) исследователи будут проверять наличие ассоциаций/корреляций между всеми исходными исходами по сравнению с таковыми после лечения меполизумабом (каждые 3 месяца до 1 года лечения): биомаркеры в мокроте и в крови , клинические исходы. Точно так же будут проверены одномерные ассоциации между результатами и личными/демографическими характеристиками для выявления потенциальных искажающих факторов. Значимые ассоциации затем будут проверены с помощью скорректированных регрессионных моделей. Ассоциации/корреляции будут оцениваться отдельно по исходным клиническим характеристикам и каждые 3 месяца последующего наблюдения во время лечения, а также на исходном уровне и через 1 год лечения меполизумабом. Кроме того, для каждого биомаркера будет проведен анализ подгрупп для определения уровня биомаркера в зависимости от ответа на лечение.

Для выявления различий в переменных, измеренных до и после лечения меполизумабом, будет использоваться Т-критерий парных выборок для параметрических или критерий знаковых рангов Уилкоксона для непараметрических переменных. В частности, исходные уровни биомаркеров будут сравниваться с уровнями после 1 года лечения меполизумабом.

Общий ответ на лечение в течение одного года (от исходного уровня до 1 года после начала лечения) для каждого исхода будет измеряться с помощью парного теста зависимых выборок (параметрические и непараметрические парные тесты) у каждого пациента. Тогда ответ на лечение будет определяться как изменение (абсолютное и % изменение) исхода через год. Исследователи будут оценивать предикторы, влияющие на ответ на лечение (изменение), такие как биомаркеры, с использованием множественных регрессионных моделей для каждого клинико-патологического исхода. Для результатов с более чем 2 наблюдениями на субъекта в течение периода исследования исследователи будут использовать смешанные модели, используя повторные измерения результата. Все тесты будут двусторонними с уровнем статистической значимости 5%.