Skuteczność mepolizumabu w ciężkiej astmatyce (MESILICO) (MESILICO)

Uzasadnienie naukowe Interleukina (IL)-5 jest główną cytokiną odpowiedzialną za aktywację eozynofili, dlatego strategie terapeutyczne zostały zbadane i opracowane do użytku klinicznego. Leki biologiczne ukierunkowane na IL-5 i jej receptor (najpierw mepolizumab, a następnie reslizumab i benralizumab) zostały niedawno zatwierdzone i stosowane jako terapia dodatkowa w ciężkiej astmie eozynofilowej, co skutkuje zmniejszeniem liczby krążących eozynofilów, poprawą czynności płuc i zaostrzeniem zmniejszenie liczby pacjentów z ciężką astmą.

Odpowiedź na terapie biologiczne w ciężkiej astmie jest zróżnicowana, przy czym pacjenci są albo niereagujący, reagujący lub superreagujący. Obecnie nie ma wyjaśnienia dla tak dużej zmienności odpowiedzi. Ważne jest zbadanie, czy ci pacjenci mają odmienne cechy, które mogłyby pomóc lekarzowi prowadzącemu w postawieniu prawidłowego rozpoznania w praktyce klinicznej.

Celem tego badania klinicznego jest ocena skuteczności mepolizumabu, humanizowanego przeciwciała monoklonalnego będącego antagonistą IL-5, u pacjentów z późną, ciężką astmą eozynofilową z utrwaloną obturacją oraz określenie charakterystyki osób niereagujących i superreagujących na leczenie mepolizumabem. To badanie jest uważane za nieinterwencyjne, a każda procedura jest wykonywana w rutynowej praktyce klinicznej w celu diagnozy i fenotypowania pacjentów z astmą.

Do badania stanu zapalnego dróg oddechowych stosuje się kilka metod: pomiary bezpośrednie (np. Zaletą technik bezpośrednich jest wiarygodna ocena stanu zapalnego dróg oddechowych, ale są one inwazyjne i niewykonalne na dużą skalę ze względu na dyskomfort pacjenta i ponoszone ryzyko. Metody pośrednie słabo korelują z bezpośrednią oceną stanu zapalnego dróg oddechowych.

W niniejszej pracy wśród cech klinicznych pacjentów oceniana będzie spirometria, biomarkery stanu zapalnego (eozynofile we krwi, poziom FeNO, IgE), oscylometria impulsowa (IOS) oraz pogrubienie błony podstawnej za pomocą bronchoskopii. Sugeruje się, że pacjenci z ciężką astmą eozynofilową o późnym początku i utrwaloną niedrożnością, którzy nie reagują na zwykłe leczenie (ICS/LABA/LAMA), mają zwiększoną masę mięśni gładkich. Jednak dokładny wpływ zwiększonej masy mięśni gładkich dróg oddechowych na zwężenie dróg oddechowych nie jest znany i może się różnić w zależności od ciężkości choroby. Ponadto biomarkery stanu zapalnego zostaną również ocenione przed i po 52-tygodniowym leczeniu mepolizumabem w płynach biologicznych (surowicy, plwocinie, supernatancie plwociny i próbkach oskrzeli). Biomarkery stanu zapalnego są bardzo ważne w identyfikowaniu osób reagujących na niereagujących.

Mówiąc dokładniej, IOS został wprowadzony jako alternatywna technika oceny czynności płuc, ze szczególnym zastosowaniem w astmie. Technika ta jest nieinwazyjna, łatwa do wykonania podczas oddychania pływowego i wymaga jedynie minimalnej współpracy pacjenta.

Pobieranie plwociny jest kolejnym sposobem pobierania próbek komórek z dróg oddechowych i umożliwia bezpośrednią ocenę stanu zapalnego dróg oddechowych. Ponadto przykłady z supernatantem plwociny obejmują analizę mediatorów i ocenę aktywności chemotaktycznej próbki pod kątem eozynofili. Komórki plwociny można również analizować metodą cytometrii przepływowej, która umożliwia m.in. immunofenotypowanie i sortowanie komórek. Ponadto można hodować komórki plwociny i mierzyć wytwarzanie przez nie mediatorów in vitro. Warto zauważyć, że w tym przypadku zawartość mediatora jest inna niż w supernatancie plwociny. Rzeczywiście, na mediatory w supernatancie plwociny mogą wpływać wydzieliny z komórek rezydujących w drogach oddechowych i wysięk osocza, w przeciwieństwie do modelu hodowli komórkowej plwociny. Wreszcie, immunocytochemię i hybrydyzację in situ można również przeprowadzić przy użyciu komórek plwociny.

Chociaż jako odniesienie zaproponowano fenotypy, eozynofile we krwi i poziomy IgE w surowicy, istnieje dysocjacja między poziomem komórek odpornościowych krwi a reakcją immunologiczną nabłonka dróg oddechowych, co potwierdzono we wcześniejszych badaniach. Barwienie immunohistochemiczne nabłonka dróg oddechowych w kierunku docelowych komórek odpornościowych zastosowano do określenia różnych typów zapalenia dróg oddechowych; jednak ta technika jest rzadko stosowana w warunkach klinicznych. Wcześniejsze badania wykazały względne bezpieczeństwo wykonywania biopsji bronchoskopowych u pacjentów z ciężką astmą. Wśród technik pobierania próbek stosowanych do diagnozowania tkanek, w tym biopsji nosa, szczotkowania nosa lub oskrzeli oraz płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, pobieranie próbek nabłonka oskrzeli pod kontrolą bronchoskopii zapewnia dokładniejsze informacje o komórkach nabłonkowych i zapalnych w kontekście tkanki. Jest to zatem potężne narzędzie do wyboru najbardziej odpowiednich leków biologicznych w trudnych warunkach klinicznych.

Poza tym choroba astmatyczna charakteryzuje się przewlekłym procesem zapalnym błony śluzowej, w wyniku którego dochodzi do nieodwracalnych zmian w ścianie oskrzeli, zwanych dziś „przebudową oskrzeli”. Częścią tych zmian morfologicznych jest hiperplazja i/lub hipertrofia włókien gruczołowych i mięśni gładkich, hiperplazja komórek kubkowych i zmienne pogrubienie błony podstawnej (BM) obecne pod nabłonkiem oddechowym. zmiany generowane na styku nabłonek-łączność odpowiadają za „reakcję adaptacyjną” na stres zapalny i sporadyczne zwężenie oskrzeli. Jednak obecne dane dotyczące reaktywności BM u chorych na astmę są wciąż niepełne, aby dokładnie ocenić ich udział w patogenezie, a konkretnie w przebudowie ściany oskrzeli, głównie ze względu na brak korelacji złogów kolagenu w blaszce siatkowatej ze stopniem ciężkości choroby.

Co więcej, staje się coraz bardziej oczywiste, że ciężka astma nie jest pojedynczą chorobą, o czym świadczy różnorodność objawów klinicznych, cech fizjologicznych i wyników obserwowanych u pacjentów z astmą. Aby lepiej zrozumieć tę heterogeniczność, pojawiła się koncepcja fenotypowania i endotypowania astmy. Fenotypowanie integruje zarówno cechy biologiczne, jak i kliniczne, od cech molekularnych, komórkowych, morfologicznych i funkcjonalnych po zorientowane na pacjenta, w celu poprawy terapii. Ostatecznie te fenotypy ewoluują w „endotypy” astmy, które łączą cechy kliniczne z możliwymi do zidentyfikowania szlakami mechanistycznymi. Biomarkery, definiowane jako cechy, które można obiektywnie zmierzyć i służą jako wskaźnik leżących u podstaw procesów biologicznych lub patogenezy, mają kluczowe znaczenie w definiowaniu fenotypów i endotypów. W astmie polimorfizmy genetyczne, pomiary fizjologii dróg oddechowych i poziomy mediatorów stanu zapalnego w moczu, krwi, plwocinie, tkankach, wydychanym gazie i kondensacie oddechu zostały zbadane jako potencjalne markery poprawiające i obiektywizujące diagnostykę i leczenie astmy. Opracowanie takich narzędzi pozwoli nam fenotypować i endotypować różne wzorce kliniczne opisane w astmie, a ostatecznym celem będzie dostosowanie terapii w oparciu o określony profil biomarkerów. Następnie można wykorzystać biomarkery, aby lepiej zrozumieć odpowiedź farmakologiczną na interwencję i odpowiednio dostosować terapię.

Biomarkery mają kluczowe znaczenie dla badań nad patogenezą choroby i opracowywania nowych terapii w ciężkiej astmie. W szczególności biomarkery stanu zapalnego typu 2 okazały się cenne w endotypowaniu i celowaniu w nowe czynniki biologiczne. Ze względu na te sukcesy w zrozumieniu i oznaczaniu stanu zapalnego typu 2, brak wiedzy na temat mechanizmów zapalnych innych niż typ 2 w astmie wkrótce stanie się główną przeszkodą w opracowywaniu nowych metod leczenia i strategii postępowania w ciężkiej astmie. Inne potencjalne biomarkery obejmują wrodzone komórki limfoidalne, IL-33 lub limfopoetynę zrębu grasicy.

Ostatnie publikacje potwierdziły kluczową rolę regulacyjną miRNA w patomechanizmie astmy. Niektóre pojedyncze miRNA lub ich zestawy dają nadzieję na wykorzystanie ich jako biomarkerów astmy ułatwiających diagnozowanie lub przewidywanie wyników leczenia. Są również możliwym celem przyszłych terapii. Brakuje jednak badań w tym zakresie. Ostatnio wykazano, że większość zaangażowanych miRNA zwiększa wydzielanie cytokin Th2, zmniejsza wydzielanie cytokin Th1, promuje różnicowanie limfocytów T w kierunku Th2 lub odgrywa rolę w hiperplazji i hipertrofii komórek mięśni gładkich oskrzeli. Profile miRNA korelują z charakterystyką kliniczną, w tym czynnością płuc, fenotypem i ciężkością astmy.

Większość biologicznych badań klinicznych sponsorowanych przez branżę skutecznie wykorzystywała powyższe podejście, wybierając osoby do badania, które przypominają fenotypy kliniczne ciężkiej astmy SARP (schematy kontrolne o wysokiej intensywności, częste zaostrzenia i słaba czynność płuc), ale następnie wymagają podwyższonego biomarkera (w krew, wydychany gaz lub plwocina), które powinny identyfikować pacjentów, którzy najprawdopodobniej zareagują na określony immunomodulator w ramach tych fenotypów klinicznych. Leki biologiczne w niedawno opublikowanych badaniach klinicznych są ukierunkowane na szlaki zapalne typu 2 i ograniczają udział do osób z podwyższonymi biomarkerami typu 2 (eozynofile we krwi lub plwocinie lub FeNO). Analizy odpowiedzi post hoc na biomarkery „grupowe” w celu lepszego zrozumienia, którzy pacjenci odnoszą największe korzyści z biologicznego immunomodulatora, doprowadzą do zrozumienia, że ​​jednoczesne podwyższenie więcej niż 1 biomarkera zapalnego typu 2 może dalej identyfikować pacjentów „wysoko reagujących”.

Hipoteza obejmuje skuteczność leczenia mepolizumabem u pacjentów z późną postacią ciężkiej eozynofilowej astmy z utrwaloną niedrożnością oraz związek z biomarkerami klinicznymi i zapalnymi.

Pytania badawcze Czy istnieje poprawa częstości zaostrzeń u pacjentów z późną postacią ciężkiej astmy eozynofilowej leczonych mepolizumabem w ciągu pierwszego roku leczenia i jaka jest charakterystyka osób niereagujących i superreagujących? Czy jest jakaś poprawa w przebudowie komórek mięśni gładkich? Czy są jakieś biomarkery do przewidywania odpowiedzi na leczenie mepolizumabem u pacjentów z późną postacią ciężkiej astmy eozynofilowej? Czy nastąpiła poprawa parametrów oddechowych? Czy nastąpiła poprawa kontroli astmy i jakości życia pacjentów? Cele

Głównymi celami tego badania są:

1. Wykazanie wpływu leczenia mepolizumabem na częstość zaostrzeń u pacjentów z późną postacią ciężkiej astmy eozynofilowej z utrwaloną obturacją.
2. Identyfikacja cech osób niereagujących i superreagujących.

Kluczowymi celami drugorzędnymi tego badania są:

1. Każda poprawa przebudowy (pogrubienie komórek mięśni gładkich oskrzeli).
2. Wszelkie możliwe biomarkery odpowiedzi.
3. Jakakolwiek poprawa parametrów oddechowych w kontroli astmy i jakości życia pacjentów podczas leczenia mepolizumabem u pacjentów z późną postacią ciężkiej astmy eozynofilowej z utrwaloną obturacją.

Projekt badania i metody Pacjenci będą zbierani z przychodni astmy oskrzelowej z każdego ośrodka (w liczbie 8), które obejmują populację Grecji. Wszystkie te Kliniki zostały uwzględnione w celu wzmocnienia rekrutacji, a także włączenia ekspertów bronchoskopistów o zasięgu międzynarodowym. Ze względu na obecną sytuację związaną z pandemią Covid-19 badacze zakładają, że to badanie kliniczne nie koliduje z pracą w naszych Klinikach.

Ogólnie rzecz biorąc, jest to prospektywne, wieloośrodkowe badanie obejmujące osiem klinik pulmonologicznych. Pięć uniwersyteckich klinik pulmonologicznych, dwie z Narodowego Systemu Zdrowia i jeden Wojskowy Szpital Ogólny.

Badanie będzie obejmować okres przesiewowy trwający do 2 tygodni w celu oceny kwalifikowalności i uzyskania pisemnej świadomej zgody, okres leczenia mepolizumabem wynoszący 52 tygodnie, raz na 4 tygodnie, w tym wizyty kontrolne co 3 miesiące w trakcie leczenia.

Badana populacja będzie składać się z 45 pacjentów z późną postacią ciężkiej astmy eozynofilowej i utrwaloną niedrożnością, otrzymujących mepolizumab w wieku 20 lat i starszych.

Udział w badaniu, ocena i kontynuacja:

Badania przesiewowe: Badacze będą przeprowadzać badania przesiewowe wybranych pacjentów w uczestniczących klinikach (przychodniach ciężkiej astmy). Podmioty będą przychodzić, aby podpisać zgodę. Ocena kliniczna i procedury oraz wywiady strukturalne zostaną przeprowadzone podczas badań przesiewowych. Osoby, które kwalifikują się/mogą ukończyć wizytę przesiewową, mogą to zrobić tego samego dnia, a jeśli to konieczne, zakończą ocenę wyjściową w ciągu 2 tygodni. Osoby z trwającym zaostrzeniem astmy powinny mieć odroczoną wizytę przesiewową i rozpoczynającą leczenie do czasu, gdy badacz uzna, że ​​pacjent powrócił do wyjściowego stanu astmy. Jeśli upłynął 2-tygodniowy okres przesiewowy, wówczas należy uznać, że pacjent nie przeszedł badania przesiewowego. Pacjenci pozostaną na dotychczasowym leczeniu podtrzymującym przez cały okres badań przesiewowych. Kwalifikacja pacjentów będzie oparta na kryteriach wymienionych w następnych rozdziałach.

Historia zaostrzeń astmy w ciągu ostatnich 12 miesięcy zostanie zgłoszona podczas wizyty przesiewowej. Również zaostrzenia będą oceniane podczas każdej wizyty zgodnie ze zgłoszeniem.

Oznaki funkcji życiowych będą wykonywane podczas wizyty przesiewowej, na początku badania i co 3 miesiące. Pomiary obejmują skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi, tętno i temperaturę ciała.

Wzrost w centymetrach (cm) i masa ciała w kilogramach (kg) będą mierzone podczas wizyt przesiewowych. Wskaźnik masy ciała (BMI) zostanie obliczony jako waga w kg podzielona przez wzrost w metrach do kwadratu

Ocena laboratoryjna (hematologia, chemia krwi, analiza moczu):

Krew żylna i mocz będą pobierane na początku badania. Hematologia: Hemoglobina, hematokryt, liczba krwinek czerwonych, liczba krwinek białych z różnicowaniem i płytki krwi będą mierzone w laboratorium każdego szpitala. Oceniana będzie podstawowa chemia kliniczna i analiza moczu. Pobieranie moczu kobiet pozwoli również na ocenę ciąży.

Poziomy IgE będą oceniane podczas wizyty przesiewowej przy użyciu testów immunoCAP i podawane jako IU/ml.

Zostaną podane następujące Kwestionariusze: 1) Kwestionariusz Kontroli Astmy (ACQ-5) i Test Kontroli Astmy (ACT) w celu oceny aktualnej kontroli astmy; 2) Kwestionariusz Jakości Życia Astmy (AQLQ+12) do oceny jakości życia i chorobowości psychicznej. W celu dalszej oceny jakości snu 1) Ateńska Skala Bezsenności (AIS), 2) Skala Senności Epworth (ESS), 3) Kwestionariusz St. 5) Skala ciężkości zmęczenia (FSS).

Wydychany tlenek azotu (NO) będzie mierzony na początku badania i co 3 miesiące zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej i zgodnie z zaleceniami producenta. Poziomy FeNO będą podawane jako części na miliard. Pomiary zostaną wykonane przed wykonaniem spirometrii.

Próbki krwi żylnej będą pobierane między 8 a 10 rano, na początku badania i co 3 miesiące podczas 52-tygodniowego okresu leczenia mepolizumabem. Bezwzględna liczba eozynofili we krwi zostanie podana jako komórki/μl.

Spirometria: Spirometria A będzie wykonywana sprzętem własnym ośrodka podczas wizyt (wyjściowych i co 3 miesiące). Wszystkie wizyty w przychodni muszą odbywać się rano. W okresie leczenia spirometria będzie spełniać aktualne wytyczne ATS/ERS, a spirometr musi generować wydruk wszystkich wygenerowanych danych, które należy przechowywać w notatkach badanego. Spirometr zostanie skalibrowany zgodnie z zaleceniami producenta. Spirometria musi być wykonana w tym samym czasie (±1 godzina) co spirometria Wizyty 0. Osoby badane powinny w miarę możliwości odstawić krótko działające beta-2-mimetyki (SABA) na ≥4 godziny i LABA na ≥15 godzin przed wizytą w klinice (GINA 2019). Oceny, które należy zapisać, będą obejmować FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF i FEF25-75. Pomiary po podaniu leku rozszerzającego oskrzela będą wykonywane podczas każdej wizyty, przy użyciu 200-400 mcg albuterolu lub jego odpowiednika.

Spirometria B zostanie przeprowadzona przy użyciu sprzętu własnego ośrodka podczas wizyt (wyjściowych, po 6 miesiącach i po leczeniu w punkcie czasowym 52 tygodni). Spirometria B obejmuje dyfuzję, objętość i pojemność płuc.

Oscylometria impulsowa (opcjonalnie):

Osylometria impulsowa (IOS) zostanie przeprowadzona na początku leczenia i po 52 tygodniach leczenia. IOS obejmuje opór przy 5 Hz opór przy 20 Hz (R5-R20), miarę odzwierciedlającą opór oddechowy małych i średnich przewodzących i obwodowych dróg oddechowych, AX, miarę odzwierciedlającą rozciągliwość płuc obwodowych (tj. miąższu i małych obwodowych dróg oddechowych) oraz reaktancję układu oddechowego (X5), miarę odzwierciedlającą bezwładność i elastyczność lub pojemność (w tym małe obwodowe drogi oddechowe).

Terapia lekami biologicznymi:

Po zakończeniu wizyt przesiewowych uczestnik może rozpocząć leczenie terapią biologiczną (mepolizumabem) w ciągu miesiąca. W trakcie terapii pacjenci pozostaną pod opieką pulmonologa, który skierował ich do grupy badawczej w celu wzięcia udziału w badaniu. Ci pulmonolodzy będą określani jako „pulmonolodzy stowarzyszeni”. Leczenie zostanie przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta produktu.

Pulmonolodzy współpracujący prowadzący leczenie biologiczne w trakcie badania będą zobowiązani do podpisania umowy na przeprowadzenie badania zgodnie z protokołem, uznania odpowiedzialności za postępowanie medyczne i przeprowadzenie badania oraz zapewnienia, że ​​współpracownik (i jego współpracownicy i pracownicy) pomagający w przeprowadzeniu badania są informowani o swoich obowiązkach. Zostaną wprowadzone mechanizmy zapewniające, że personel pomocniczy otrzyma odpowiednie informacje i wsparcie ze strony grupy badawczej podczas całego badania.

Kontynuacja podczas terapii biologicznej: Na początku i podczas każdej wizyty w celu podania terapii biologicznej zbieranie informacji będzie przeprowadzane przez współpracującego pulmonologa oraz przy wsparciu grupy badawczej, jeśli zostanie to poproszone przez współpracującego pulmonologa, np. badaczy przez telefon lub osobiście kontakt twarzowy przeprowadzi wywiad z pacjentem. Ponadto zgodność zostanie odnotowana przez lekarza na podstawie ustnego potwierdzenia pacjenta. Na każdej wizycie zapisywana będzie data podania leku oraz natychmiastowe i opóźnione działania niepożądane.

Monitorowanie bezpieczeństwa:

Zarejestrowane zdarzenia niepożądane (AE) będą monitorowane i zestawiane zgodnie z wymaganiami w raportach z badań. Zdarzenie niepożądane to pojawienie się lub pogorszenie jakiegokolwiek niepożądanego objawu, objawu lub stanu medycznego, które wystąpiło po rozpoczęciu udziału w badaniu. Warunki medyczne/choroby występujące przed rozpoczęciem stosowania badanego leku są uważane za zdarzenia niepożądane tylko wtedy, gdy pogorszą się po rozpoczęciu stosowania badanego leku. Nieprawidłowe wartości laboratoryjne lub wyniki badań są zdarzeniami niepożądanymi tylko wtedy, gdy wywołują oznaki lub objawy kliniczne, są uważane za istotne klinicznie lub wymagają leczenia. Uwzględniono również zdarzenia niepożądane związane z Covid-19. Jeśli partnerski pulmonolog lub personel badawczy dowie się o AE związanym z produktem, może to zgłosić producentowi zgodnie z lokalną standardową praktyką dotyczącą spontanicznego zgłaszania AE. Kopię raportu należy również przesłać do koordynatora badania. Poważne zdarzenia niepożądane (SAE) będą zgłaszane na stronach eCRF, aw ciągu 24 godzin wszyscy badacze będą mieli obowiązek poinformowania o tym Komitetu Centralnego w Salonikach. Następnie Komitet Centralny poinformuje radę naukową i Grecką Agencję Medyczną. Ponadto główny badacz każdego ośrodka wraz z Komitetem Centralnym dokona oceny medycznej i naukowej, podejmując decyzję, czy pacjent powinien przerwać leczenie, czy nie.

Raport ciąży:

Początkowo pacjentki podczas badań przesiewowych będą musiały wykonać test ciążowy. Podczas leczenia, jeśli pacjentka zgłosi nam ciążę, zostanie poproszona o wycofanie się z badania (aby zapobiec stronniczości). Następnie zostanie zapytana, czy chciałaby kontynuować leczenie poza tym protokołem i być monitorowana w ambulatorium każdego ośrodka.

Awarie wstępnej kontroli i kontroli:

Osobom badanym zostanie nadany numer badania w momencie podpisania zgody. Osoby, które podpisały, ale nie przeszły do ​​oceny wizyt przesiewowych, zostaną uznane za osoby, które nie przeszły testu wstępnego. Żadne dane nie zostaną przechwycone w bazie danych dla tych podmiotów.

Pacjenci, którzy ukończą co najmniej jedną z dwóch wizyt przesiewowych, ale nie rozpoczną terapii biologicznej, zostaną uznani za niepowodzeń w badaniu przesiewowym. Informacje, które należy zebrać w celu wstępnej kontroli i niepowodzeń kontroli, zostaną wyszczególnione w uzupełnianiu bazy danych.

Wizyta wycofująca:

Jeśli uczestnik zdecyduje się wycofać z badania podczas okresu kontrolnego (z jakiegokolwiek innego powodu niż utrata możliwości udziału w badaniu), może zostać poproszony o udział w wizycie wycofania (jeśli badacz uzna to za konieczne i pod warunkiem wyrażenia zgody). W trakcie wizyty uczestnik może zostać zapytany o aktualny stan zdrowia w ramach zbierania informacji klinicznych takich jak: astma i objawy ze strony nosa, zaostrzenia oraz przebieg leczenia.

Pobieranie i przetwarzanie próbek krwi:

Próbki krwi będą pobierane podczas wizyty początkowej, po 6 miesiącach i po zakończeniu leczenia. Po pobraniu próbek krwi pozostawia się je w spokoju na około pół godziny w celu całkowitego utworzenia skrzepu. Próbka zostanie następnie odwirowana w celu oddzielenia surowicy od skrzepu. Po odwirowaniu surowica będzie przechowywana w temperaturze -20°C w probówkach Eppendorfa do czasu zakończenia analizy. Fenotypowanie krwi zostanie również ocenione za pomocą cytometrii przepływowej.

Wywołana plwocina (opcjonalnie):

Indukowana plwocina zostanie wykonana na początku badania przed rozpoczęciem leczenia i po zakończeniu leczenia, zgodnie z raportem grupy zadaniowej ERS, w którym sugerowane są szczegółowe, oparte na konsensusie zalecenia eksperckie dotyczące przetwarzania indukowanej plwociny.

Na wizytach indukcja plwociny będzie wykonywana po zakończeniu rutynowych badań spirometrycznych.

Wywołana plwocina zostanie przetworzona w ciągu dwóch godzin od zakończenia procedury indukcji w ośrodku badawczym. Komórki plwociny i supernatant zawiesiny komórek będą przechowywane w temperaturze -80ºC do analizy. Po pobraniu indukowanej plwociny supernatant próbki będzie przechowywany w temperaturze -20°C w probówkach Eppendorfa do czasu zakończenia analizy. Po tych procedurach następna jest laboratoryjna ocena plwociny zgodnie z wytycznymi.

Bronchoskopia, biopsje oskrzeli oraz pobieranie i obróbka wymazów z oskrzeli (opcjonalnie): Na wizytach za pisemną zgodą pacjenta wykonywane będzie endoskopia z biopsjami oskrzeli, wycinkami przemywania oskrzeli (Wizyta 0b). W szczególności zostanie dołączona oddzielna świadoma zgoda do podpisania przez każdego pacjenta. Bronchoskopia zostanie przeprowadzona w dwóch punktach czasowych (wyjściowy przed rozpoczęciem leczenia i po zakończeniu leczenia). Elastyczną bronchoskopię i techniki diagnostyczne wykonano pod monitorowaną opieką anestezjologiczną, zgodnie z zaleceniami American Thoracic Society i British Thoracic Society.

Próbki tkanek zostaną utrwalone przez nadmuchanie lub zanurzenie za pomocą formaldehydu lub aldehydu glutarowego i zatopione w parafinie. Próbki dróg oddechowych będą systematycznie pobierane lub uzyskiwane podczas sekcji diagnostycznej według uznania patologa. Z każdego bloku wycięto kolejne skrawki o grubości 0,5, 5 i 30 μm i wybarwiono stosując technikę trichromową Massona, odpowiednio hematoksylinę i eozynę oraz hematoksylinę. Barwienie immunohistochemiczne zostanie wykonane przy użyciu następujących mAb: klon tryptazy komórek tucznych AA1 (Dako Wielka Brytania), klon aktyny mięśni gładkich alfa 1A4 (Dako Wielka Brytania), klon głównych zasadowych białek przeciw eozynofilom BMK-13 (Monosan, Holandia) ), klon przeciwko elastazie neutrofilowej NP57 (Dako UK) i klon przeciw śródbłonkowi EN4 (Monosan, Holandia) lub odpowiednie kontrole izotypowe.

Biopsje wewnątrzoskrzelowe będą oceniane przez pojedynczego obserwatora, który nie zna charakterystyki klinicznej (oprogramowanie do analizy obrazu ZEN 2012 do mikroskopii świetlnej, Carl Zeiss AG, Niemcy) i zostaną wyrażone jako średnia pomiarów przeprowadzonych z co najmniej dwóch skrawków pochodzących od niezależnych biopsji lub jako nieciągłe skrawki tkanki w odległości co najmniej 20 μm od tej samej biopsji. Integralność nabłonka zostanie oceniona przez pomiar długości nienaruszonego i pozbawionego nabłonka. Zostaną one wyrażone jako procent całej długości siateczkowatej błony podstawnej (RBM). Unaczynienie będzie mierzone przy użyciu liczby Chalkleya, zastępczej zarówno gęstości naczyń, jak i powierzchni naczyń. Siatka okularu Chalkleya (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, Wielka Brytania) zostanie użyta przy x200 do pomiaru zliczeń Chalkleya w czterech nienakładających się na siebie gorących punktach naczyniowych (6). Zawartość mięśni gładkich dróg oddechowych zostanie określona jako odsetek całkowitej powierzchni. Komórki zapalne wyrażono jako liczbę komórek jądrzastych/powierzchnię blaszki właściwej.

Próbki popłuczyn z oskrzeli zostaną niezwłocznie przetransportowane do laboratorium, gdzie będą przechowywane w temperaturze -80 stopni. Badanie płynów przemywających oskrzela zostanie przeprowadzone na późniejszym etapie w celu określenia kilku biomarkerów.

Analiza biomarkerów zapalenia za pomocą analizy cytometrii przepływowej (FACS) lub ELIZA:

Biomarkery obejmowały przed i po leczeniu mepolizumabem w dwóch lub trzech punktach czasowych (wyjściowo, po 6 miesiącach leczenia i po zakończeniu leczenia): podzbiory limfocytów, cytokiny Th2/Th17, chemokiny, ekspresja mikroRNA do oznaczenia ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej lub testu ELISA) w płynach biologicznych (krew, surowica, popłuczyny z oskrzeli, plwocina i supernatant plwociny).

Zestawy paneli i odpowiednie przeciwciała zostaną przetestowane za pomocą analizy cytometru przepływowego przy użyciu systemu BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA), zgodnie z zaleceniami i instrukcjami producenta.

ELISA (enzymatyczny test immunosorpcyjny) to technika testu oparta na płytkach przeznaczona do wykrywania i oznaczania ilościowego substancji, takich jak peptydy, białka, przeciwciała i hormony. Zestawy ELISA będą analizowane przy użyciu spektrofotometru VICTOR X3 zgodnie z zaleceniami i instrukcjami producenta.

Testy alergiczne (jeśli dotyczy) Status atopowy pacjentów zostanie oceniony (jeśli nie są dostępne) podczas wizyty przesiewowej za pomocą punktowego testu skórnego (SPT) ze standardowym panelem alergenów wziewnych w celu wykrycia całkowitych przeciwciał IgE przeciwko różnym powszechnym alergenom wziewnym.

Baza danych Elektroniczna platforma gromadzenia danych będzie metodą wyjściową stosowaną co 3 miesiące do 1 roku obserwacji tej bazy danych. Podczas wizyt leczniczych papierowe formularze/kwestionariusze będą wypełniane przez współpracownika pulmonologa. Każdy ośrodek będzie wprowadzał określone dane do elektronicznej bazy danych. Każdy pacjent jest jednoznacznie identyfikowany za pomocą numeru podmiotu, który składa się z numeru miejsca przypisanego przez odpowiedzialny ośrodek monitorowania oraz numeru porządkowego przypisanego przez badacza. Po podpisaniu formularza świadomej zgody pacjent otrzymuje od badacza kolejny numer porządkowy. Placówka musi skontaktować się z centralnym personelem badawczym i podać wymagane informacje identyfikujące pacjenta zarejestrowanego w elektronicznej bazie danych. Formularze wizyt leczniczych zostaną również przesłane do centralnego personelu badawczego. Upoważniony personel badawczy będzie odpowiedzialny za gromadzenie danych, edycję, a także ochronę danych gromadzonych we własnym ośrodku, a baza danych jest codziennie tworzona kopia zapasowa. Przegląd/kontrola jakości będzie wspólną odpowiedzialnością wszystkich zaangażowanych osób i centralnego personelu badawczego [powiernika danych].

Obliczanie wielkości próby Analiza mocy G Wielkość próby oblicza się przy użyciu oprogramowania G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Niemcy). Pierwszorzędowym punktem końcowym badania była różnica w rocznym odsetku zaostrzeń pacjentów z późną postacią ciężkiej astmy eozynofilowej przed i po leczeniu mepolizumabem. W badaniu DREAM (jednym z dwóch dotychczas uzyskanych wyników podobnych do głównego punktu końcowego) wykazano, że po rozpoczęciu leczenia mepolizumabem roczny wskaźnik zaostrzeń u pacjentów z ciężką astmą zmniejszył się z 3,6 do 1,33. Korzystając z tych danych i dwustronnego testu z mocą 0,95 i poziomem istotności statystycznej 0,05, badacze obliczyli wielkość efektu 0,556, co wskazywało na całkowitą wielkość próby 45 uczestników.

Analiza planu statystycznego Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu SPSS (oprogramowanie statystyczne IBM SPSS w wersji 21.0, Armonk, NY, USA). Zmienne kategoryczne zostaną podane jako liczby (n) i procenty (%), zmienne ciągłe jako średnia ± SD, jeśli mają rozkład normalny, lub jako mediana i rozstępy międzykwartylowe, jeśli nie. Tam, gdzie to konieczne, zmienne bez rozkładu normalnego zostaną przekształcone. P < 0,05 przyjęto jako statystycznie istotne. W celu oddzielenia zmiennych parametrycznych od nieparametrycznych zostanie przeprowadzony test Shapiro-Wilka. Do wykrycia różnic w zmiennych mierzonych przed i po leczeniu mepolizumabem zostanie wykorzystany test t sparowanych prób dla parametrów parametrycznych lub test Wilcoxon Signed Ranks dla zmiennych nieparametrycznych.

Nie ma ramienia porównawczego, ponieważ każdy pacjent jest sam dla siebie kontrolą. Istnieją podstawowe cechy charakterystyczne (kliniczne i laboratoryjne biomarkery), które będą mierzone na początku badania, co 3 miesiące i po 52-tygodniowym zakończeniu leczenia. Punkty końcowe badania obejmują analizę wszystkich tych biomarkerów jako identyfikację cech osób niereagujących i superreagujących. Również drugorzędowe punkty końcowe obejmują ocenę biomarkerów wymienionych w metodach jako oceny. Wstępnie zostanie przeprowadzona analiza statystyczna liczby pacjentów, którzy ukończyli 52-tygodniowy okres leczenia. Po drugie, pacjenci, którzy nie ukończyli 52-tygodniowego leczenia, będą analizowani oddzielnie i ostatecznie te dwie grupy zostaną ze sobą porównane.

Dokładniej, za pomocą analizy jednoczynnikowej (dwustronne niezależne testy próbek) badacze sprawdzą powiązania/korelacje między wszystkimi wyjściowymi wynikami w porównaniu z wynikami po leczeniu mepolizumabem (co 3 miesiące do 1 roku leczenia): biomarkery w plwocinie i we krwi , wyniki kliniczne. Podobnie, jednowymiarowe powiązania między wynikami a cechami osobowymi/demograficznymi zostaną przetestowane w celu zidentyfikowania potencjalnych czynników zakłócających. Istotne powiązania zostaną następnie przetestowane za pomocą dostosowanych modeli regresji. Zależności/korelacje będą oceniane oddzielnie na podstawie wyjściowej charakterystyki klinicznej i obserwacji co 3 miesiące w trakcie leczenia, a także na początku leczenia i po 1 roku leczenia mepolizumabem. Poza tym dla każdego biomarkera zostanie przeprowadzona analiza podgrup w celu określenia poziomu biomarkera w stosunku do odpowiedzi na leczenie.

Do wykrycia różnic w zmiennych mierzonych przed i po leczeniu mepolizumabem zostanie wykorzystany test t sparowanych prób dla parametrów parametrycznych lub test Wilcoxon Signed Ranks dla zmiennych nieparametrycznych. Konkretnie, wyjściowe poziomy biomarkerów zostaną porównane z poziomami po 1 roku leczenia mepolizumabem.

Ogólna odpowiedź na leczenie w ciągu jednego roku (od wartości wyjściowej do 1 roku po rozpoczęciu leczenia) dla każdego wyniku zostanie zmierzona za pomocą testu sparowanych próbek zależnych (parametryczne i nieparametryczne testy sparowane) u każdego pacjenta. Wtedy odpowiedź na leczenie zostanie zdefiniowana jako zmiana (zmiana bezwzględna i procentowa) wyniku w ciągu jednego roku. Badacze ocenią predyktory wpływające na odpowiedź na leczenie (zmianę), takie jak biomarkery, stosując modele regresji wielokrotnej dla każdego wyniku kliniczno-patologicznego. W przypadku wyników z więcej niż 2 obserwacjami na osobnika w okresie badania badacze użyją modeli mieszanych wykorzystujących powtarzane pomiary wyniku. Wszystkie testy będą dwustronne z poziomem istotności statystycznej na poziomie 5%.