Eficacia de Mepolizumab en Asmáticos Severos (MESILICO) (MESILICO)

Justificación científica La interleucina (IL)-5 es la principal citocina responsable de la activación de los eosinófilos, por lo que se han investigado y desarrollado estrategias terapéuticas para uso clínico. Los productos biológicos dirigidos a la IL-5 y su receptor (primero mepolizumab y posteriormente, reslizumab y benralizumab) se aprobaron recientemente y se usaron como terapia adicional para el asma eosinofílica grave, lo que resultó en una reducción del recuento de eosinófilos circulantes, una mejoría en la función pulmonar y una exacerbación. Reducción en pacientes con asma severa.

La respuesta a las terapias biológicas en el asma grave es variable, y los pacientes son no respondedores, respondedores o súper respondedores. Actualmente no hay explicación para esta amplia variación en la respuesta. Es importante examinar si estos pacientes tienen características distintas que podrían ayudar al médico tratante a realizar el diagnóstico correcto en la práctica clínica.

El objetivo de este estudio clínico es evaluar la eficacia de mepolizumab, un anticuerpo monoclonal antagonista de la IL-5 humanizado en pacientes con asma eosinofílica grave de inicio tardío con obstrucción fija e identificar las características de los no respondedores y superrespondedores bajo tratamiento con mepolizumab. Este estudio se considera no intervencionista y todos los procedimientos incluidos se realizan en una rutina clínica para el diagnóstico y fenotipado de los pacientes asmáticos.

Se utilizan varios métodos para investigar la inflamación de las vías respiratorias: mediciones directas (como biopsias bronquiales o lavados broncoalveolares) y métodos indirectos (como evaluación de síntomas, análisis de muestras de sangre y pruebas de función pulmonar). Las técnicas directas tienen la ventaja de evaluar de forma fiable la inflamación de las vías respiratorias, pero son invasivas y no factibles a gran escala por la incomodidad del paciente y el riesgo que conllevan. En cuanto a los métodos indirectos, se correlacionan mal con la evaluación directa de la inflamación de las vías respiratorias.

En este estudio, entre las características clínicas de los pacientes se evaluarán la espirometría, los biomarcadores de inflamación (eosinófilos en sangre, FeNO, niveles de IgE), la oscilometría de impulso (IOS) y el engrosamiento de la membrana basal por broncoscopia. Se sugiere que los pacientes asmáticos eosinofílicos severos de inicio tardío con obstrucción fija que no responden al tratamiento habitual (ICS/LABA/LAMA) se presenten con aumento de la masa muscular lisa. Sin embargo, los efectos precisos del aumento de la masa del músculo liso de las vías respiratorias sobre el estrechamiento de las vías respiratorias no se conocen y pueden variar con la gravedad de la enfermedad. Además, también se evaluarán biomarcadores de inflamación antes y después de 52 semanas de tratamiento con mepolizumab en fluidos biológicos (suero, esputo, sobrenadante de esputo y muestras bronquiales). Los biomarcadores de inflamación son muy importantes para identificar a los respondedores de los no respondedores.

Más específicamente, la IOS se ha introducido como una técnica alternativa para evaluar la función pulmonar con una aplicación particular en el asma. Esta técnica no es invasiva, se realiza fácilmente durante la respiración normal y requiere solo una cooperación mínima del paciente.

La recolección de esputo es otra forma de tomar muestras de células de las vías respiratorias y permite la evaluación directa de la inflamación de las vías respiratorias. Además, los ejemplos con sobrenadante de esputo incluyen el análisis de mediadores y la evaluación de la actividad quimiotáctica de la muestra para eosinófilos. Las células de esputo también se pueden analizar mediante citometría de flujo que permite, entre otros, inmunofenotipificar y clasificar células. Además, las células de esputo se pueden cultivar y su producción de mediadores se puede medir in vitro. Vale la pena señalar que, en este caso, el contenido del mediador es diferente al que se puede encontrar en el sobrenadante del esputo. De hecho, los mediadores en el sobrenadante de esputo pueden verse influenciados por las secreciones de las células residentes en las vías respiratorias y por la exudación de plasma, al contrario del modelo de cultivo de células de esputo. Finalmente, la inmunocitoquímica y la hibridación in situ también se pueden realizar utilizando células de esputo.

Aunque se han propuesto como referencia los fenotipos, los eosinófilos en sangre y los niveles de IgE en suero, existe una disociación entre el nivel de células inmunitarias en sangre y la reacción inmunitaria del epitelio de las vías respiratorias, como se confirmó en estudios previos. La tinción inmunohistoquímica del epitelio de las vías respiratorias para células inmunitarias específicas se ha utilizado para determinar varios tipos de inflamación de las vías respiratorias; sin embargo, esta técnica rara vez se usa en un entorno clínico. Estudios previos han revelado la relativa seguridad de realizar biopsias broncoscópicas en pacientes con asma grave. Entre las técnicas de muestreo utilizadas para el diagnóstico de tejidos, incluidas las biopsias nasales, el cepillado nasal o bronquial y el lavado broncoalveolar, el muestreo del epitelio bronquial guiado por broncoscopia proporciona información más precisa sobre las células epiteliales e inflamatorias en el contexto del tejido. Por lo tanto, es una poderosa herramienta para seleccionar los productos biológicos más adecuados en condiciones clínicas difíciles.

Además, la enfermedad asmática se caracteriza por un proceso inflamatorio crónico de la mucosa, que resulta en cambios irreversibles de la pared bronquial, lo que hoy se conoce como "remodelación bronquial". La hiperplasia y/o hipertrofia de las fibras musculares glandulares y lisas, la hiperplasia de las células caliciformes y el engrosamiento variable de la membrana basal (MB) presente debajo del epitelio respiratorio son parte de estos cambios morfológicos. los cambios generados en la interfase epitelio-conectivo dan cuenta de una "respuesta adaptativa" al estrés inflamatorio y la broncoconstricción esporádica. Sin embargo, los datos actuales sobre la reactividad de la MO en pacientes asmáticos aún son incompletos para una evaluación precisa de su participación en la patogénesis y específicamente en la remodelación de la pared bronquial, principalmente porque los depósitos de colágeno en la lámina reticularis no se correlacionan con el grado de gravedad de la enfermedad.

Además, es cada vez más evidente que el asma grave no es una sola enfermedad, como lo demuestra la variedad de presentaciones clínicas, características fisiológicas y resultados observados en pacientes con asma. Para comprender mejor esta heterogeneidad, ha surgido el concepto de fenotipado y endotipado del asma. El fenotipado integra características biológicas y clínicas, desde características moleculares, celulares, morfológicas y funcionales hasta características orientadas al paciente con el objetivo de mejorar la terapia. En última instancia, estos fenotipos evolucionan hacia "endotipos" de asma, que combinan características clínicas con vías mecanicistas identificables. Los biomarcadores, definidos como características que pueden medirse objetivamente y sirven como indicador de procesos biológicos subyacentes o patogénesis, son cruciales para definir fenotipos y endotipos. En el asma, los polimorfismos genéticos, las medidas de la fisiología de las vías respiratorias y los niveles de mediadores inflamatorios en la orina, la sangre, el esputo, los tejidos, el gas exhalado y el condensado del aliento se han estudiado como marcadores potenciales para mejorar y objetivar el diagnóstico y el tratamiento del asma. El desarrollo de tales herramientas nos permitirá fenotipar y endotipar los diversos patrones clínicos descritos en el asma, con el objetivo final de adaptar la terapia en función de un perfil de biomarcador específico. Luego, los biomarcadores se pueden usar para ayudar a comprender mejor la respuesta farmacológica a una intervención y ajustar la terapia en consecuencia.

Los biomarcadores han sido fundamentales para los estudios de la patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias en el asma grave. En particular, los biomarcadores de inflamación de tipo 2 han demostrado ser valiosos para la endotipificación y la identificación de nuevos agentes biológicos. Debido a estos éxitos en la comprensión y el marcado de la inflamación tipo 2, la falta de conocimiento sobre los mecanismos inflamatorios no tipo 2 en el asma pronto será el principal obstáculo para el desarrollo de nuevos tratamientos y estrategias de manejo en el asma grave. Otros biomarcadores potenciales incluyen células linfoides innatas, IL-33 o linfopoyetina estromal tímica.

Publicaciones recientes confirmaron el papel regulador crucial de los miARN en el mecanismo patológico del asma. Algunos miARN individuales o sus conjuntos son prometedores para su uso como biomarcadores del asma que facilitan el diagnóstico o la predicción de los resultados del tratamiento. También son posibles objetivos de futuras terapias. Sin embargo, los estudios en este campo son escasos. Recientemente se ha demostrado que la mayoría de los miARN implicados aumentan la secreción de citocinas Th2, disminuyen la secreción de citocinas Th1, promueven la diferenciación de células T hacia Th2 o desempeñan un papel en la hiperplasia e hipertrofia de las células del músculo liso bronquial. Los perfiles de miARN se correlacionan con las características clínicas, incluida la función pulmonar, el fenotipo y la gravedad del asma.

La mayoría de los ensayos clínicos biológicos patrocinados por la industria han utilizado eficazmente el enfoque anterior al seleccionar sujetos de estudio que se asemejan a los fenotipos clínicos de asma grave de SARP (regímenes de medicación de control de alta intensidad, exacerbaciones frecuentes y función pulmonar baja), pero luego requieren un biomarcador elevado (en sangre, gas exhalado o esputo) que debe identificar a los pacientes con mayor probabilidad de responder a un inmunomodulador específico dentro de esos fenotipos clínicos. Los productos biológicos en los ensayos clínicos publicados recientemente se dirigen a las vías inflamatorias de tipo 2 y restringen la participación a sujetos con biomarcadores de tipo 2 elevados (eosinófilos en sangre o esputo o FeNO). Los análisis de respondedores post hoc para "agrupar" biomarcadores para comprender mejor qué pacientes tienen el mayor beneficio de un inmunomodulador biológico conducirán a comprender que las elevaciones simultáneas en más de 1 biomarcador inflamatorio tipo 2 pueden identificar aún más a los pacientes con "alta respuesta".

La hipótesis incluye la eficacia del tratamiento con mepolizumab en pacientes asmáticos eosinofílicos severos de inicio tardío con obstrucción fija y relación con biomarcadores clínicos e inflamatorios.

Preguntas de investigación ¿Hay alguna mejora en la tasa de exacerbaciones en pacientes asmáticos eosinofílicos graves de inicio tardío en tratamiento con mepolizumab durante su primer año de tratamiento y cuáles son las características de los no respondedores y superrespondedores? ¿Hay alguna mejora en la remodelación de las células del músculo liso? ¿Existen biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento con mepolizumab en pacientes asmáticos eosinofílicos graves de inicio tardío? ¿Hay alguna mejora en los parámetros respiratorios? ¿Hay alguna mejora en el control del asma y la calidad de vida de los pacientes? Objetivos

Los objetivos principales de este estudio son:

1. Demostrar el efecto del tratamiento con mepolizumab en la tasa de exacerbaciones en pacientes asmáticos eosinofílicos graves de inicio tardío con obstrucción fija.
2. Identificar las características de los no respondedores y superrespondedores.

Los objetivos secundarios clave de este estudio son:

1. Cualquier mejora en la remodelación (engrosamiento de las células del músculo liso bronquial).
2. Cualquier posible biomarcador de respuesta.
3. Cualquier mejora en los parámetros respiratorios en el control del asma y en la calidad de vida de los pacientes durante el tratamiento con mepolizumab en pacientes asmáticos eosinofílicos graves de inicio tardío con obstrucción fija.

Diseño del estudio y métodos Los pacientes se recogerán de las clínicas ambulatorias de asma bronquial de cada sitio (8 en número) que cubren la población de Grecia. Todas estas Clínicas se incluyen para reforzar la contratación así como para incluir expertos broncoscopistas con impacto internacional. Debido a la situación actual de la pandemia de Covid-19, los investigadores asumen que este estudio clínico no interfiere con la carga de trabajo en nuestras Clínicas.

En general, este es un estudio multicéntrico prospectivo que incluye ocho Clínicas Pulmonares. Cinco Clínicas Universitarias de Pulmonar, dos del Sistema Nacional de Salud y un Hospital General del Ejército.

El estudio incluirá un período de selección de hasta 2 semanas para evaluar la elegibilidad y obtener el consentimiento informado por escrito, un período de tratamiento con mepolizumab de 52 semanas, una vez cada 4 semanas, incluidas visitas de seguimiento cada 3 meses durante el tratamiento.

La población del estudio consistirá en 45 pacientes con asma eosinofílica grave de inicio tardío y obstrucción fija que reciben mepolizumab a partir de los 20 años.

Participación en el estudio, evaluación y seguimiento:

Detección: Los investigadores evaluarán a los sujetos seleccionados en las clínicas participantes (clínicas ambulatorias de asma grave). Los sujetos entrarán para firmar el consentimiento. La evaluación y los procedimientos clínicos y las entrevistas estructurales se realizarán durante la selección. Los sujetos que son elegibles/capaces de completar la visita de selección pueden hacerlo el mismo día y, si es necesario, completarán su evaluación inicial dentro de las 2 semanas. Los sujetos con una exacerbación de asma en curso deben retrasar su visita de detección e inicio del tratamiento hasta que el investigador considere que el sujeto ha vuelto a su estado de asma inicial. Si ha transcurrido el período de selección de 2 semanas, se debe considerar que el sujeto no pasó la prueba. Los sujetos permanecerán en su terapia de mantenimiento actual durante los períodos de selección. La elegibilidad de los pacientes se basará en los criterios enumerados en las siguientes secciones.

El historial de exacerbación del asma de los últimos 12 meses se informará en la visita de selección. Además, las exacerbaciones se evaluarán en cada visita según se informe.

Los signos vitales se realizarán en la visita de selección, al inicio del estudio y cada 3 meses. Las mediciones incluirán la presión arterial sistólica y diastólica, la frecuencia del pulso y la temperatura corporal.

La altura en centímetros (cm) y el peso corporal en kilogramos (kg) se medirán en las visitas de selección. El Índice de Masa Corporal (IMC) se calculará como el peso en kg dividido por la altura en metros al cuadrado

Evaluación de laboratorio (Hematología, Química sanguínea, Análisis de orina):

La sangre venosa y la orina se recolectarán al inicio del estudio. Hematología: En el laboratorio del hospital de cada sitio se medirá la hemoglobina, el hematocrito, el conteo de glóbulos rojos, el conteo de glóbulos blancos con diferencial y las plaquetas. Se evaluará química clínica básica y análisis de orina. La recolección de orina para sujetos femeninos también evaluará el embarazo.

Los niveles de IgE se evaluarán en la visita de selección mediante pruebas de inmunoCAP y se informarán como UI/mL.

Se administrarán los siguientes Cuestionarios: 1) el Cuestionario de Control del Asma (ACQ-5) y la Prueba de Control del Asma (ACT) para evaluar el control actual del asma; 2) el Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) para evaluar la calidad de vida y la morbilidad psicológica. Para evaluar aún más la calidad del sueño, 1) la Escala de Insomnio de Atenas (AIS), 2) la Escala de Somnolencia de Epworth (ESS), 3) el Cuestionario Respiratorio de St. George (SGRQ) y 4) el Índice de Bienestar de la OMS (Cinco) (OMS-5), 5) Escala de Severidad de la Fatiga (FSS).

El óxido nítrico (NO) exhalado se medirá al inicio y cada 3 meses de acuerdo con las Pautas de la Sociedad Torácica Estadounidense y según lo especificado por el fabricante. Los niveles de FeNO se informarán como partes por billón. Las mediciones se realizarán antes de realizar la espirometría.

Las muestras de sangre venosa se extraerán entre las 8 y las 10 a. m., al inicio y cada 3 meses durante el período de 52 semanas con el tratamiento con mepolizumab. El recuento absoluto de eosinófilos en sangre se informará como células/μl.

Espirometría: Se realizará la espirometría A, con equipo propio del centro en las visitas (basal y cada 3 meses). Todas las visitas a la clínica deben ocurrir en la mañana. Durante el período de tratamiento, la espirometría cumplirá con las pautas actuales de ATS/ERS y el espirómetro debe producir una copia impresa de todos los datos generados, que debe almacenarse en las notas del sujeto. El espirómetro se calibrará de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La espirometría debe realizarse al mismo tiempo (±1 hora) que la espirometría de la Visita 0. Los sujetos deben tratar de suspender los agonistas beta-2 de acción corta (SABA) durante ≥4 horas y los LABA durante ≥15 horas antes de la visita a la clínica, si es posible (GINA 2019). Las evaluaciones que se registrarán incluirán FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF y FEF25-75. Se tomarán medidas posteriores al broncodilatador en cada visita, usando 200-400 mcg de albuterol o equivalente.

Se realizará la espirometría B con equipo propio del centro en las visitas (basal, a los 6 meses y después del tratamiento a las 52 semanas). La espirometría B incluye difusión, volúmenes y capacidades pulmonares.

Oscilometría de impulsos (opcional):

Se realizará una osilometría de impulso (IOS) al inicio y después de 52 semanas de tratamiento. IOS incluye resistencia a 5 Hz-resistencia a 20 Hz (R5-R20), una medida que refleja la resistencia respiratoria de las vías respiratorias periféricas y conductoras de tamaño pequeño a mediano, AX, una medida que refleja la distensibilidad de los pulmones periféricos (es decir, el parénquima y las vías respiratorias periféricas pequeñas) , y la reactancia del sistema respiratorio (X5), una medida que refleja la inercia y la elasticidad o la capacitancia (incluidas las vías aéreas periféricas pequeñas).

Terapia con biológicos:

Una vez completadas las visitas de selección, el participante puede iniciar el tratamiento con terapia biológica (mepolizumab) dentro de un mes. Durante la terapia los sujetos estarán bajo el cuidado del neumólogo que los haya derivado al grupo de investigación para participar en el estudio. Estos neumólogos se denominarán 'neumólogos asociados'. El tratamiento se proporcionará según las instrucciones del fabricante del producto.

Los neumólogos asociados que proporcionen tratamiento biológico durante el estudio deberán firmar un acuerdo para realizar el estudio de conformidad con el protocolo, reconocer que él/ella es responsable de la conducta médica y del estudio, y garantizar que el asociado (y sus colegas y empleados) que colaboran en la realización del estudio son informados acerca de sus obligaciones. Se implementarán mecanismos para garantizar que el personal asociado reciba la información y el apoyo apropiados por parte del grupo de investigación durante todo el estudio.

Seguimiento durante la terapia biológica: Al inicio y en cada visita para la administración de la terapia biológica, la recopilación de información será realizada por el neumólogo asociado, y con el apoyo del grupo de investigación si el neumólogo asociado lo solicita, por ejemplo, los investigadores por teléfono o personalmente. el contacto facial entrevistará al paciente. Además, el médico registrará el cumplimiento en función de la confirmación oral del paciente. En cada visita se registrará la fecha de forma de administración del fármaco, así como los efectos adversos inmediatos y tardíos.

Monitoreo de seguridad:

Los eventos adversos (EA) registrados se monitorearán y cotejarán según se requiera en los informes del estudio. Un evento adverso es la aparición o el empeoramiento de cualquier signo, síntoma o condición médica indeseable que ocurre después de comenzar el ingreso al estudio. Las condiciones médicas/enfermedades presentes antes de comenzar con el fármaco del estudio solo se consideran eventos adversos si empeoran después de comenzar con el fármaco del estudio. Los valores de laboratorio o los resultados de las pruebas anormales constituyen eventos adversos solo si inducen signos o síntomas clínicos, se consideran clínicamente significativos o requieren terapia. Además, se incluyen los eventos adversos relacionados con el Covid-19. Si un neumólogo asociado o el personal de investigación se percata de un EA asociado con un producto, puede informarlo al fabricante de acuerdo con su práctica estándar local para el informe de EA espontáneo. También se debe enviar una copia del informe al coordinador del estudio. Los eventos adversos graves (SAE) se informarán en las páginas del eCRF y dentro de las 24 horas todos los investigadores tendrán la responsabilidad de informar al Comité Central en Tesalónica. Luego, el Comité Central informará al consejo científico y a la Agencia Médica Griega. Asimismo, el criterio médico y científico será ejercido por el investigador principal de cada centro con el Comité Central, para decidir si el sujeto debe suspender o no el tratamiento.

Informe de embarazo:

Inicialmente, las pacientes femeninas en la selección tendrán que hacerse una prueba de embarazo. Durante el tratamiento, si una mujer nos informa de un embarazo, se le pedirá que se retire del estudio (para evitar sesgos). Luego, se le preguntará si desea seguir recibiendo el tratamiento fuera de este protocolo y será monitoreada en consulta externa de cada centro.

Preselección y fallas en la detección:

A los sujetos se les asignará un número de estudio en el momento de firmar el consentimiento. Los sujetos que firmaron pero no avanzan a la evaluación de las visitas de selección se considerarán reprobados en la preselección. No se capturarán datos en la base de datos para estos sujetos.

Los sujetos que completen al menos una de las dos visitas de detección, pero que no inicien la terapia biológica, serán designados como fallas en la detección. La información que se recopilará para la preselección y las fallas en la selección se detallará al completar la base de datos.

Visita de retiro:

Si un participante decide retirarse del estudio durante el seguimiento (por cualquier motivo que no sea la pérdida durante el seguimiento), se le puede pedir que asista a una visita de retiro (si el investigador lo considera necesario y sujeto a consentimiento). Durante la visita, se le pueden hacer preguntas al participante sobre sus condiciones actuales como parte de la recopilación de información clínica, como: asma y síntomas nasales, exacerbaciones y la progresión del tratamiento que está recibiendo.

Recolección y procesamiento de muestras de sangre:

Se recogerán muestras de sangre en la visita inicial, a los 6 meses y después de finalizar el tratamiento. Después de recolectar las muestras de sangre, se dejarán en reposo durante aproximadamente media hora para que se forme completamente el coágulo. Luego, la muestra se centrifugará para separar el suero del coágulo. Después de la centrifugación, el suero se almacenará a -20 ° C en tubos eppendorf hasta que se realice el análisis. El fenotipado sanguíneo también se evaluará mediante citometría de flujo.

Esputo inducido (opcional):

El esputo inducido se realizará al inicio antes del inicio del tratamiento y después de completar el tratamiento de acuerdo con el informe del Grupo de trabajo de ERS, donde se sugiere una recomendación detallada basada en el consenso de expertos para el procesamiento del esputo inducido.

En las visitas, la inducción de esputo se realizará después de que se hayan completado las evaluaciones espirométricas de rutina.

El esputo inducido se procesará dentro de las dos horas posteriores al final del procedimiento de inducción en el sitio de investigación. Las células de esputo y el sobrenadante de la suspensión celular se almacenarán a -80 ºC para su análisis. Después de recolectar el esputo inducido, el sobrenadante de la muestra se almacenará a -20 ° C en tubos eppendorf hasta que se realice el análisis. Siguiendo estos procedimientos, lo siguiente es la evaluación de laboratorio del esputo de acuerdo con las pautas.

Toma y procesamiento de broncoscopia, biopsias bronquiales y muestras de lavado (opcional): En las visitas se realizará endoscopia con biopsias bronquiales, muestra de lavado bronquial (Visita 0b) previo consentimiento por escrito del paciente. En concreto, se incluirá un consentimiento informado por separado a firmar por cada paciente. La broncoscopia se realizará en dos momentos (línea de base antes del inicio del tratamiento y después de la finalización del tratamiento). La broncoscopia flexible y las técnicas de diagnóstico se realizaron bajo anestesia supervisada según lo recomendado por la American Thoracic Society y la British Thoracic Society.

Las muestras de tejido se fijarán en inflación o inmersión utilizando formaldehído o glutaraldehído y se incluirán en parafina. Las vías respiratorias se muestrearán u obtendrán sistemáticamente durante la disección diagnóstica a discreción del patólogo. De cada bloque se cortaron secciones consecutivas de 0,5, 5 y 30 μm de espesor y se tiñeron con la técnica del tricrómico de Masson, hematoxilina y eosina y hematoxilina, respectivamente. La tinción inmunohistoquímica se realizará con los siguientes mAbs: anti-triptasa de mastocitos, clon AA1 (Dako UK), anti-actina de músculo liso alfa, clon 1A4 (Dako UK), proteína básica principal anti-eosinófilos, clon BMK-13 (Monosan, Países Bajos). ), se usaron el clon NP57 de elastasa anti-neutrófilo (Dako UK) y el clon EN4 anti-endotelio (Monosan, Países Bajos) o controles de isotipo apropiados.

Las biopsias endobronquiales serán evaluadas por un único observador cegado a las características clínicas (software de análisis de imágenes ZEN 2012 para microscopía óptica, Carl Zeiss AG, Alemania) y se expresarán como la media de las mediciones realizadas en un mínimo de dos secciones, ya sea de muestras independientes biopsias o como secciones de tejido no contiguas separadas al menos 20 μm de la misma biopsia. La integridad epitelial se evaluará midiendo las longitudes del epitelio intacto y denudado. Estos se expresarán como porcentaje de toda la longitud de la membrana basal reticular (RBM). La vascularización se medirá mediante el recuento de Chalkley, un sustituto de la densidad de los vasos y el área vascular. Se utilizará una retícula de ocular Chalkley (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, Reino Unido) a x200 para medir los recuentos de Chalkley en cuatro puntos calientes vasculares que no se superponen (6). El contenido de músculo liso de las vías respiratorias se determinará como la proporción del área total. Las células inflamatorias se expresaron como el número de células nucleadas/área de lámina propia.

Las muestras de lavado bronquial serán transportadas inmediatamente al laboratorio, para ser almacenadas a -80 grados. El examen de los fluidos de lavado bronquial se realizará en una etapa posterior para determinar varios biomarcadores.

Análisis de biomarcadores de inflamación con Análisis de Citometría de Flujo (FACS) o ELIZA:

Biomarcadores incluidos antes y después del tratamiento con mepolizumab en dos o tres puntos temporales (al inicio, a los 6 meses de tratamiento y después de la visita de finalización del tratamiento): subconjuntos de linfocitos, citocinas Th2/Th17, quimiocinas, expresión de microARN a cuantificar mediante citometría de flujo o ELISA) en fluidos biológicos (sangre, suero, lavado bronquial, esputo y sobrenadante de esputo).

Los kits de panel y los anticuerpos apropiados se analizarán mediante análisis de citómetro de flujo utilizando un sistema BD FACS Calibur (BD Biosciences, San José, CA), de acuerdo con las recomendaciones e instrucciones del fabricante.

ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) es una técnica de ensayo basada en placas diseñada para detectar y cuantificar sustancias como péptidos, proteínas, anticuerpos y hormonas. Los kits ELISA se analizarán con el espectrofotómetro VICTOR X3 de acuerdo con las recomendaciones e instrucciones del fabricante.

Pruebas de alergia (si corresponde) El estado atópico de los pacientes se evaluará (si no está disponible) en la visita de selección mediante la prueba cutánea (SPT) a un panel estándar de aeroalérgenos para detectar anticuerpos IgE totales contra varios alérgenos inhalantes comunes.

Base de datos Una plataforma de recopilación de datos electrónicos será el método utilizado al inicio cada 3 meses hasta el seguimiento de 1 año para esta base de datos. Durante las visitas de tratamiento, el neumólogo asociado completará formularios/cuestionarios en papel. Cada sitio ingresará datos específicos en una base de datos electrónica. Cada paciente está identificado de forma única por un número de Sujeto que está compuesto por el número de sitio asignado por el sitio de monitoreo responsable y un número secuencial asignado por el investigador. Al firmar el formulario de consentimiento informado, el investigador le asigna al paciente el siguiente número secuencial. El sitio debe comunicarse con el personal de investigación central y proporcionar la información de identificación solicitada para el paciente registrado en la base de datos electrónica. Los formularios de visita de tratamiento también se enviarán al personal de investigación central. El personal autorizado del estudio será responsable de la recopilación y edición de datos y también de la protección de los datos que se recopilan en su propio sitio y la base de datos se respalda diariamente. La revisión/control de calidad será responsabilidad conjunta de todas las personas involucradas y del personal de investigación central [custodio de los datos].

Cálculo del tamaño de la muestra Análisis de potencia G El tamaño de la muestra se calcula utilizando el software G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Alemania). La diferencia en la tasa anual de exacerbaciones de los pacientes con asma eosinofílica grave de inicio tardío antes y después del tratamiento con mepolizumab es el criterio principal de valoración del estudio. En el estudio DREAM (uno de los dos únicos estudios que ha informado resultados similares a nuestro criterio de valoración principal hasta el momento) se informó que la tasa anual de exacerbaciones de pacientes con asma grave disminuyó de 3,6 a 1,33 después del inicio del tratamiento con mepolizumab. Utilizando estos datos y una prueba bilateral, con una potencia de 0,95 y un nivel de significación estadística de 0,05, los investigadores calcularon un tamaño del efecto de 0,556, lo que indica un tamaño de muestra total de 45 participantes.

Análisis estadístico del plan El análisis estadístico se realizará con el programa SPSS (versión 21.0 del software estadístico IBM SPSS, Armonk, NY, EE. UU.). Las variables categóricas se expresarán como números (n) y porcentajes (%), las variables continuas como media ± DE si se distribuyen normalmente, o mediana y rangos intercuartílicos en caso contrario. Cuando sea necesario se transformarán las variables que no tengan una distribución normal. P < 0,05 fue aceptado como estadísticamente significativo. Se realizará la prueba de Shapiro-Wilk para separar las variables paramétricas de las no paramétricas. Para detectar diferencias en las variables medidas antes y después del tratamiento con mepolizumab, se utilizará la prueba T para muestras pareadas para variables paramétricas o la prueba de rangos con signos de Wilcoxon para variables no paramétricas.

No existe un brazo de comparación ya que cada paciente se controla a sí mismo. Hay características basales (biomarcadores clínicos y de laboratorio) que se medirán al inicio, cada 3 meses y después de 52 semanas de completar el tratamiento. Los puntos finales del estudio incluyen el análisis de todos esos biomarcadores como la identificación de las características de los no respondedores y superrespondedores. Además, los criterios de valoración secundarios incluyen la evaluación de los biomarcadores mencionados en los métodos como evaluaciones. El análisis estadístico se realizará inicialmente con el número de pacientes que han completado el período de tratamiento de 52 semanas. En segundo lugar, se analizarán por separado los pacientes que no hayan completado el tratamiento de 52 semanas y finalmente se compararán estos dos grupos entre sí.

Más específicamente, con el análisis univariante (pruebas de muestras independientes bilaterales), los investigadores evaluarán las asociaciones/correlaciones entre todos los resultados iniciales en comparación con los que se obtuvieron después de los tratamientos con mepolizumab (cada 3 meses hasta 1 año de tratamiento): biomarcadores en esputo y en sangre , resultados clínicos. De manera similar, se evaluarán las asociaciones univariadas entre los resultados y las características personales/demográficas para identificar posibles factores de confusión. Las asociaciones significativas se probarán luego con modelos de regresión ajustados. Las asociaciones/correlaciones se evaluarán por separado en las características clínicas iniciales y cada 3 meses de seguimiento durante el tratamiento, así como al inicio y después de 1 año de tratamiento con mepolizumab. Además, se realizará un análisis de subgrupos para cada biomarcador para la identificación del nivel de biomarcador para la respuesta al tratamiento.

Para detectar diferencias en las variables medidas antes y después del tratamiento con mepolizumab, se utilizará la prueba T para muestras pareadas para variables paramétricas o la prueba de rangos con signos de Wilcoxon para variables no paramétricas. En concreto, los niveles de biomarcadores al inicio se compararán con los niveles después de 1 año de tratamiento con mepolizumab.

La respuesta general al tratamiento en un año (desde el inicio hasta 1 año después del inicio del tratamiento) para cada resultado se medirá con pruebas pareadas de muestras dependientes (pruebas pareadas paramétricas y no paramétricas) en cada paciente. Luego, la respuesta al tratamiento se definirá como el cambio (cambio absoluto y porcentual) del resultado en un año. Los investigadores evaluarán los predictores que influyen en la respuesta al tratamiento (cambio), como los biomarcadores, mediante el uso de modelos de regresión múltiple para cada resultado clinicopatológico. Para los resultados con más de 2 observaciones por sujeto durante el período de estudio, los investigadores utilizarán modelos mixtos utilizando las mediciones repetidas del resultado. Todas las pruebas serán bilaterales con un nivel de significancia estadística del 5%.