Efficacité du mépolizumab chez les asthmatiques sévères (MESILICO) (MESILICO)

Justification scientifique L'interleukine (IL)-5 est la principale cytokine responsable de l'activation des éosinophiles, c'est pourquoi des stratégies thérapeutiques ont été étudiées et développées pour une utilisation clinique. Les produits biologiques ciblant l'IL-5 et son récepteur (d'abord le mépolizumab, puis le reslizumab et le benralizumab), ont été récemment approuvés et utilisés comme traitement d'appoint pour l'asthme éosinophile sévère entraînant une réduction du nombre d'éosinophiles circulants, une amélioration de la fonction pulmonaire et une exacerbation réduction chez les patients asthmatiques sévères.

La réponse aux thérapies biologiques dans l'asthme sévère est variable, les patients étant soit des non-répondeurs, des répondeurs ou des super-répondeurs. Il n'y a actuellement aucune explication à cette grande variation de réponse. Il est important d'examiner si ces patients ont des caractéristiques distinctes qui pourraient aider le médecin traitant à poser le bon diagnostic dans la pratique clinique.

Le but de cette étude clinique est d'évaluer l'efficacité du mépolizumab, un anticorps monoclonal humanisé antagoniste de l'IL-5 chez les patients atteints d'asthme éosinophile sévère d'apparition tardive avec obstruction fixe et d'identifier les caractéristiques des non-répondeurs et des super-répondeurs sous traitement par le mépolizumab. Cette étude est considérée comme non interventionnelle et chaque procédure incluse se déroule dans une routine clinique pour le diagnostic et le phénotypage des patients asthmatiques.

Plusieurs méthodes sont utilisées pour étudier l'inflammation des voies respiratoires : des mesures directes (comme les biopsies bronchiques ou les lavages bronchoalvéolaires) et des méthodes indirectes (comme l'évaluation des symptômes, l'analyse des échantillons de sang et les tests de la fonction pulmonaire). Les techniques directes ont l'avantage d'évaluer de manière fiable l'inflammation des voies respiratoires, mais elles sont invasives et non réalisables à grande échelle en raison de l'inconfort du patient et du risque encouru. Quant aux méthodes indirectes, elles sont peu corrélées à l'évaluation directe de l'inflammation des voies respiratoires.

Dans cette étude, parmi les caractéristiques cliniques des patients, la spirométrie, les biomarqueurs de l'inflammation (éosinophiles sanguins, FeNO, taux d'IgE), l'oscillométrie impulsionnelle (IOS) et l'épaississement de la membrane basale par bronchoscopie seront évalués. Il est suggéré que les patients asthmatiques à éosinophiles sévères d'apparition tardive avec obstruction fixe qui ne répondent pas au traitement habituel (ICS/LABA/LAMA) présentent une masse musculaire lisse accrue. Cependant, les effets précis de l'augmentation de la masse musculaire lisse des voies respiratoires sur le rétrécissement des voies respiratoires ne sont pas connus et peuvent varier en fonction de la gravité de la maladie. De plus, les biomarqueurs de l'inflammation seront également évalués avant et après un traitement de 52 semaines par le mépolizumab dans les fluides biologiques (sérum, expectoration, surnageant d'expectoration et échantillons bronchiques). Les biomarqueurs de l'inflammation sont très importants pour identifier les répondeurs aux non-répondeurs.

Plus précisément, l'IOS a été introduit comme technique alternative pour évaluer la fonction pulmonaire avec une application particulière à l'asthme. Cette technique est non invasive, facilement réalisée pendant la respiration courante et ne nécessite qu'une coopération minimale du patient.

La collecte d'expectorations est une autre façon d'échantillonner les cellules des voies respiratoires et permet l'évaluation directe de l'inflammation des voies respiratoires. En outre, des exemples avec du surnageant d'expectoration comprennent l'analyse des médiateurs et l'évaluation de l'activité chimiotactique de l'échantillon pour les éosinophiles. Les cellules des crachats peuvent également être analysées par cytométrie en flux qui permet, entre autres, l'immunophénotypage et le tri des cellules. En outre, les cellules d'expectoration peuvent être cultivées et leur production de médiateurs peut être mesurée in vitro. Il est à noter que dans ce cas, le contenu en médiateurs est différent de ce que l'on peut trouver dans le surnageant des crachats. En effet, les médiateurs dans le surnageant des expectorations peuvent être influencés par les sécrétions des cellules résidentes des voies respiratoires et par l'exsudation plasmatique, contrairement au modèle de culture cellulaire des expectorations. Enfin, l'immunocytochimie et l'hybridation in situ peuvent également être réalisées à l'aide de cellules d'expectoration.

Bien que les phénotypes, les éosinophiles sanguins et les niveaux d'IgE sériques aient été proposés comme référence, il existe une dissociation entre le niveau de cellules immunitaires sanguines et la réaction immunitaire de l'épithélium des voies respiratoires, comme l'ont confirmé des études antérieures. La coloration immunohistochimique de l'épithélium des voies respiratoires pour les cellules immunitaires ciblées a été utilisée pour déterminer divers types d'inflammation des voies respiratoires ; cependant, cette technique est rarement utilisée en milieu clinique. Des études antérieures ont révélé l'innocuité relative de la réalisation de biopsies bronchoscopiques chez les patients souffrant d'asthme sévère. Parmi les techniques de prélèvement utilisées pour le diagnostic tissulaire, notamment les biopsies nasales, le brossage nasal ou bronchique et le lavage bronchoalvéolaire, le prélèvement d'épithélium bronchique guidé par bronchoscopie fournit des informations plus précises sur les cellules épithéliales et inflammatoires dans le contexte tissulaire. C'est donc un outil puissant pour sélectionner les produits biologiques les plus adaptés dans des conditions cliniques difficiles.

Par ailleurs, la maladie asthmatique se caractérise par un processus inflammatoire chronique des muqueuses, qui se traduit par des modifications irréversibles de la paroi bronchique, connues aujourd'hui sous le nom de "remodelage bronchique". L'hyperplasie et/ou l'hypertrophie des fibres musculaires glandulaires et lisses, l'hyperplasie des cellules caliciformes et l'épaississement variable de la membrane basale (BM) présents sous l'épithélium respiratoire font partie de ces changements morphologiques. les changements générés à l'interface épithélium-conjonctif expliquent une "réponse adaptative" au stress inflammatoire et à la bronchoconstriction sporadique. Cependant, les données actuelles sur la réactivité de la BM chez le patient asthmatique sont encore incomplètes pour une évaluation précise de son implication dans la pathogenèse et plus particulièrement dans le remodelage de la paroi bronchique, principalement car les dépôts de collagène dans la lamina reticularis ne sont pas corrélés au degré de gravité de la maladie.

De plus, il est de plus en plus évident que l'asthme sévère n'est pas une maladie unique, comme en témoigne la variété des présentations cliniques, des caractéristiques physiologiques et des résultats observés chez les patients asthmatiques. Pour mieux comprendre cette hétérogénéité, le concept de phénotypage et d'endotypage de l'asthme a émergé. Le phénotypage intègre à la fois les caractéristiques biologiques et cliniques, des caractéristiques moléculaires, cellulaires, morphologiques et fonctionnelles aux caractéristiques axées sur le patient dans le but d'améliorer la thérapie. En fin de compte, ces phénotypes évoluent en "endotypes" de l'asthme, qui combinent des caractéristiques cliniques avec des voies mécanistes identifiables. Les biomarqueurs, définis comme des caractéristiques pouvant être objectivement mesurées et servant d'indicateur des processus biologiques sous-jacents ou de la pathogenèse, sont cruciaux pour définir les phénotypes et les endotypes. Dans l'asthme, les polymorphismes génétiques, les mesures de la physiologie des voies respiratoires et les niveaux de médiateurs inflammatoires dans l'urine, le sang, les expectorations, les tissus, les gaz expirés et le condensat respiratoire ont tous été étudiés en tant que marqueurs potentiels pour améliorer et objectiver le diagnostic et la prise en charge de l'asthme. Le développement de tels outils nous permettra de phénotyper et d'endotyper les différents modèles cliniques décrits dans l'asthme, dans le but ultime d'adapter la thérapie en fonction d'un profil de biomarqueurs spécifique. Les biomarqueurs peuvent ensuite être utilisés pour mieux comprendre la réponse pharmacologique à une intervention et ajuster le traitement en conséquence.

Les biomarqueurs ont joué un rôle essentiel dans les études sur la pathogenèse de la maladie et le développement de nouvelles thérapies dans l'asthme sévère. En particulier, les biomarqueurs de l'inflammation de type 2 se sont avérés précieux pour l'endotypage et le ciblage de nouveaux agents biologiques. En raison de ces succès dans la compréhension et le marquage de l'inflammation de type 2, le manque de connaissances sur les mécanismes inflammatoires non de type 2 dans l'asthme sera bientôt l'obstacle majeur au développement de nouveaux traitements et stratégies de prise en charge de l'asthme sévère. D'autres biomarqueurs potentiels comprennent les cellules lymphoïdes innées, l'IL-33 ou la lymphopoïétine stromale thymique.

Des publications récentes ont confirmé le rôle régulateur crucial des miARN dans le mécanisme pathologique de l'asthme. Certains miARN uniques ou leurs ensembles sont prometteurs pour leur utilisation en tant que biomarqueurs de l'asthme facilitant le diagnostic ou la prédiction des résultats du traitement. Ils sont également la cible possible de thérapies futures. Les études dans ce domaine manquent cependant. Récemment, il a été montré que la plupart des miARN impliqués augmentent la sécrétion des cytokines Th2, diminuent la sécrétion des cytokines Th1, favorisent la différenciation des lymphocytes T vers les Th2 ou jouent un rôle dans l'hyperplasie et l'hypertrophie des cellules musculaires lisses bronchiques. Les profils des miARN sont en corrélation avec les caractéristiques cliniques, y compris la fonction pulmonaire, le phénotype et la sévérité de l'asthme.

La plupart des essais cliniques biologiques parrainés par l'industrie ont utilisé efficacement l'approche ci-dessus en sélectionnant des sujets d'étude qui ressemblent aux phénotypes cliniques d'asthme sévère de la SARP (schémas thérapeutiques de contrôle à haute intensité, exacerbations fréquentes et fonction pulmonaire faible), mais nécessitent ensuite un biomarqueur élevé (dans sang, gaz exhalés ou crachats) qui devraient identifier les patients les plus susceptibles de répondre à un immunomodulateur spécifique au sein de ces phénotypes cliniques. Les produits biologiques dans les essais cliniques récemment publiés ciblent les voies inflammatoires de type 2 et limitent la participation aux sujets présentant des biomarqueurs de type 2 élevés (éosinophiles sanguins ou des expectorations ou FeNO). Des analyses post-hoc des répondeurs pour « regrouper » les biomarqueurs afin de mieux comprendre quels patients bénéficient le plus d'un immunomodulateur biologique permettront de comprendre que des élévations simultanées de plus d'un biomarqueur inflammatoire de type 2 peuvent mieux identifier les patients « hautement répondeurs ».

L'hypothèse inclut l'efficacité du traitement par mépolizumab chez les patients asthmatiques éosinophiles sévères d'apparition tardive avec une obstruction fixe et la relation avec les biomarqueurs cliniques et inflammatoires.

Questions de recherche Y a-t-il une amélioration du taux d'exacerbation chez les patients asthmatiques éosinophiles sévères d'apparition tardive sous traitement par mépolizumab au cours de leur 1ère année de traitement et quelles sont les caractéristiques des non-répondeurs et des super-répondeurs ? Y a-t-il une amélioration du remodelage des cellules musculaires lisses ? Existe-t-il des biomarqueurs pour prédire la réponse au traitement par le mépolizumab chez les patients asthmatiques à éosinophiles sévères d'apparition tardive ? Y a-t-il une amélioration des paramètres respiratoires ? Y a-t-il une amélioration du contrôle de l'asthme et de la qualité de vie des patients ? Objectifs

Les principaux objectifs de cette étude sont :

1. Démontrer l'effet du traitement par mépolizumab sur le taux d'exacerbation chez les patients asthmatiques éosinophiles sévères d'apparition tardive avec obstruction fixe.
2. Identifier les caractéristiques des non-répondants et des super-répondants.

Les principaux objectifs secondaires de cette étude sont :

1. Toute amélioration du remodelage (épaississement des cellules musculaires lisses bronchiques).
2. Tous les biomarqueurs possibles de la réponse.
3. Toute amélioration des paramètres respiratoires dans le contrôle de l'asthme et de la qualité de vie des patients pendant le traitement par mépolizumab chez les patients asthmatiques éosinophiles sévères d'apparition tardive avec obstruction fixe.

Conception et méthodes de l'étude Les patients seront collectés dans les cliniques externes d'asthme bronchique de chaque site (au nombre de 8) qui couvrent la population de la Grèce. Toutes ces cliniques sont incluses pour renforcer le recrutement ainsi que pour inclure des experts bronchoscopistes à impact international. En raison de la situation actuelle concernant la pandémie de Covid-19, les investigateurs supposent que cette étude clinique n'interfère pas avec la charge de travail dans nos Cliniques.

Dans l'ensemble, il s'agit d'une étude prospective multicentrique incluant huit cliniques pulmonaires. Cinq cliniques universitaires pulmonaires, deux du système national de santé et un hôpital général de l'armée.

L'étude comprendra une période de sélection pouvant aller jusqu'à 2 semaines pour évaluer l'éligibilité et obtenir un consentement éclairé écrit, une période de traitement par mépolizumab de 52 semaines, une fois toutes les 4 semaines, y compris des visites de suivi tous les 3 mois pendant le traitement.

La population de l'étude sera composée de 45 patients atteints d'asthme éosinophile sévère d'apparition tardive et d'obstruction fixe recevant du mépolizumab âgés de 20 ans et plus.

Participation à l'étude, évaluation et suivi :

Dépistage : les enquêteurs sélectionneront des sujets sélectionnés dans les cliniques participantes (cliniques externes pour l'asthme sévère). Les sujets viendront signer leur consentement. L'évaluation et les procédures cliniques et les entretiens structurels seront effectués lors de la sélection. Les sujets éligibles/capables de terminer la visite de dépistage peuvent le faire le même jour et, si nécessaire, ils termineront leur évaluation de base dans les 2 semaines. Les sujets présentant une exacerbation de l'asthme en cours doivent voir leur visite de dépistage et d'initiation du traitement retardée jusqu'à ce que l'investigateur considère que le sujet est revenu à son état d'asthme initial. Si la période de dépistage de 2 semaines s'est écoulée, le sujet doit être considéré comme un échec au dépistage. Les sujets resteront sur leur traitement d'entretien actuel tout au long des périodes de dépistage. L'éligibilité des patients sera basée sur les critères énumérés dans les sections suivantes.

Les antécédents d'exacerbation de l'asthme au cours des 12 derniers mois seront signalés lors de la visite de dépistage. De plus, les exacerbations seront évaluées à chaque visite, comme indiqué.

Les signes vitaux seront effectués lors de la visite de dépistage, au départ et tous les 3 mois. Les mesures comprendront la pression artérielle systolique et diastolique, le pouls et la température corporelle.

La taille en centimètres (cm) et le poids corporel en kilogrammes (kg) seront mesurés lors des visites de dépistage. L'indice de masse corporelle (IMC) sera calculé comme le poids en kg divisé par la taille en mètres au carré

Évaluation de laboratoire (hématologie, chimie du sang, analyse d'urine) :

Le sang veineux et l'urine seront prélevés au départ. Hématologie : L'hémoglobine, l'hématocrite, le nombre de globules rouges, le nombre de globules blancs avec différentiel et les plaquettes seront mesurés dans le laboratoire de l'hôpital de chaque site. La chimie clinique de base et l'analyse d'urine seront évaluées. La collecte d'urine pour les sujets féminins permettra également d'évaluer la grossesse.

Les niveaux d'IgE seront évalués lors de la visite de dépistage à l'aide de tests immunoCAP et seront rapportés en UI/mL.

Les questionnaires suivants seront administrés : 1) le questionnaire de contrôle de l'asthme (ACQ-5) et le test de contrôle de l'asthme (ACT) pour évaluer le contrôle actuel de l'asthme ; 2) le Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) pour évaluer la qualité de vie et la morbidité psychologique. Pour évaluer davantage la qualité du sommeil 1) Échelle d'insomnie d'Athènes (AIS), 2) Échelle de somnolence d'Epworth (ESS), 3) Questionnaire respiratoire de St. George (SGRQ) et 4) Indice de bien-être de l'OMS (cinq) (OMS-5), 5) Échelle de gravité de la fatigue (FSS).

L'oxyde nitrique (NO) expiré sera mesuré au départ et tous les 3 mois conformément aux directives de l'American Thoracic Society et comme spécifié par le fabricant. Les niveaux de FeNO seront rapportés en parties par milliard. Les mesures seront effectuées avant la réalisation de la spirométrie.

Des échantillons de sang veineux seront prélevés entre 8 h et 10 h, au départ, puis tous les 3 mois pendant la période de 52 semaines de traitement par le mépolizumab. Le nombre absolu d'éosinophiles sanguins sera rapporté en cellules/μl.

Spirométrie : Une spirométrie A sera effectuée, en utilisant le propre équipement du site lors des visites (de base et tous les 3 mois). Toutes les visites à la clinique doivent avoir lieu le matin. Pendant la période de traitement, la spirométrie respectera les directives actuelles de l'ATS/ERS et le spiromètre doit produire une impression de toutes les données générées, qui doivent être stockées dans les notes du sujet. Le spiromètre sera étalonné conformément aux instructions du fabricant. La spirométrie doit être effectuée en même temps (±1 heure) que la spirométrie de la visite 0. Les sujets doivent essayer de suspendre les bêta-2-agonistes à courte durée d'action (SABA) pendant ≥ 4 heures et les LABA pendant ≥ 15 heures avant la visite à la clinique, si possible (GINA 2019). Les évaluations à enregistrer comprendront FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF et FEF25-75. Des mesures post-bronchodilatatrices seront prises à chaque visite, en utilisant 200-400mcg d'albutérol ou équivalent.

La spirométrie B sera effectuée, en utilisant le propre équipement du site lors des visites (au départ, après 6 mois et après le traitement à 52 semaines). La spirométrie B comprend la diffusion, les volumes et les capacités pulmonaires.

Oscillométrie impulsionnelle (facultatif) :

L'osillométrie impulsionnelle (IOS) sera effectuée au départ et après 52 semaines de traitement. IOS inclut la résistance à 5 Hz-résistance à 20 Hz (R5-R20), une mesure reflétant la résistance respiratoire des petites et moyennes voies respiratoires conductrices et périphériques, AX, une mesure reflétant la distensibilité des poumons périphériques (à savoir le parenchyme et les petites voies respiratoires périphériques) , et la réactance du système respiratoire (X5), une mesure reflétant l'inertance et l'élasticité ou la capacité (y compris les petites voies respiratoires périphériques).

Thérapie avec des produits biologiques :

À la fin des visites de dépistage, le participant peut commencer un traitement par thérapie biologique (mépolizumab) dans un délai d'un mois. Pendant la thérapie, les sujets seront sous la garde du pneumologue qui les a référés au groupe de recherche pour participer à l'étude. Ces pneumologues seront appelés « pneumologues associés ». Le traitement sera fourni conformément aux instructions du fabricant du produit.

Les pneumologues associés fournissant un traitement biologique au cours de l'étude devront signer un accord pour mener l'étude conformément au protocole, reconnaître qu'il est responsable de la conduite médicale et de la conduite de l'étude, et s'assurer que l'associé (et ses collègues et employés) participant à la réalisation de l'étude sont informés de leurs obligations. Des mécanismes seront en place pour s'assurer que le personnel associé reçoit les informations et le soutien appropriés de la part du groupe de recherche tout au long de l'étude.

Suivi pendant la thérapie biologique : Au début et à chaque visite pour l'administration de la thérapie biologique, la collecte d'informations sera effectuée par le pneumologue associé, et avec le soutien du groupe de recherche si demandé par le pneumologue associé, par exemple, les chercheurs par téléphone ou en personne. le contact facial interrogera le patient. De plus, la conformité sera enregistrée par le médecin sur la base de la confirmation orale du patient. La date d'administration du médicament sera enregistrée à chaque visite, ainsi que les effets indésirables immédiats et différés.

Surveillance de la sécurité :

Les événements indésirables (EI) enregistrés seront surveillés et rassemblés selon les besoins dans les rapports d'étude. Un événement indésirable est l'apparition ou l'aggravation de tout signe, symptôme ou état de santé indésirable survenant après le début de l'inscription à l'étude. Les conditions médicales / maladies présentes avant le début du médicament à l'étude ne sont considérées comme des événements indésirables que si elles s'aggravent après le début du médicament à l'étude. Des valeurs de laboratoire ou des résultats de test anormaux ne constituent des événements indésirables que s'ils induisent des signes ou des symptômes cliniques, sont considérés comme cliniquement significatifs ou nécessitent un traitement. De plus, les événements indésirables liés au Covid-19 sont inclus. Si un pneumologue partenaire ou un membre du personnel de recherche prend connaissance d'un EI associé à un produit, celui-ci peut être signalé au fabricant conformément à sa pratique standard locale en matière de signalement spontané d'EI. Une copie du rapport doit également être envoyée au coordinateur de l'étude. Les événements indésirables graves (SAE) seront signalés dans les pages eCRF et dans les 24 heures, tous les enquêteurs auront la responsabilité d'informer le Comité central à Thessalonique. Ensuite, le Comité central informera le conseil scientifique et l'Agence médicale grecque. De plus, un jugement médical et scientifique sera exercé par l'investigateur principal de chaque centre auprès du Comité central, pour décider si le sujet doit arrêter le traitement ou non.

Rapport de grossesse :

Au départ, les patientes lors du dépistage devront faire un test de grossesse. Pendant le traitement, si une femme nous signale une grossesse, il lui sera demandé de se retirer de l'étude (pour éviter les biais) Ensuite, il lui sera demandé si elle souhaite continuer à recevoir le traitement en dehors de ce protocole et être suivie à clinique externe de chaque centre.

Échecs de la présélection et de la sélection :

Les sujets se verront attribuer un numéro d'étude au moment de la signature du consentement. Les sujets qui ont signé mais ne progressent pas vers l'évaluation des visites de dépistage seront considérés comme un échec de présélection. Aucune donnée ne sera saisie dans la base de données pour ces sujets.

Les sujets qui terminent au moins une des deux visites de dépistage, mais qui n'initient pas de traitement biologique seront désignés comme des échecs de dépistage. Les informations à collecter pour le pré-dépistage et les échecs de dépistage seront détaillées dans la complétion de la base de données.

Visite de retrait :

Si un participant décide de se retirer de l'étude pendant le suivi (pour une raison autre que la perte de suivi), il peut être invité à assister à une visite de retrait (si cela est jugé nécessaire par l'investigateur et sous réserve du consentement). Au cours de la visite, le participant peut se voir poser des questions sur son état actuel dans le cadre de la collecte d'informations cliniques telles que : l'asthme et les symptômes nasaux, les exacerbations et la progression du traitement reçu.

Prélèvement et traitement des échantillons sanguins :

Des échantillons de sang seront prélevés lors de la visite de référence, à 6 mois et après la fin du traitement. Après avoir prélevé les échantillons de sang, ils seront laissés au repos pendant environ une demi-heure pour la formation complète de caillots. L'échantillon sera ensuite centrifugé pour séparer le sérum du caillot. Après centrifugation, le sérum sera stocké à -20°C dans des tubes Eppendorf jusqu'à ce que l'analyse soit effectuée. Le phénotypage sanguin sera également évalué par cytométrie en flux.

Crachat induit (facultatif) :

L'expectoration induite sera effectuée au départ avant le début du traitement et après la fin du traitement selon le rapport du groupe de travail de l'ERS où une recommandation détaillée basée sur un consensus d'experts pour le traitement de l'expectoration induite est suggérée.

Lors des visites, l'induction d'expectoration sera effectuée une fois les évaluations spirométriques de routine terminées.

Les expectorations induites seront traitées dans les deux heures suivant la fin de la procédure d'induction sur le site de recherche. Les cellules d'expectoration et le surnageant de la suspension cellulaire seront stockés à -80 °C pour analyse. Après avoir collecté les expectorations induites, le surnageant de l'échantillon sera stocké à -20 °C dans des tubes Eppendorf jusqu'à ce que l'analyse soit effectuée. Suite à ces procédures, l'évaluation en laboratoire des expectorations est la prochaine selon les directives.

Bronchoscopie, biopsies bronchiques et collecte et traitement des échantillons de lavage (facultatif) : lors des visites, une endoscopie avec biopsies bronchiques, échantillon de lavage bronchique (Visite 0b) sera effectuée avec le consentement écrit du patient. En particulier, un consentement éclairé séparé sera inclus pour être signé par chaque patient. La bronchoscopie sera réalisée à deux moments (initial avant le début du traitement et après la fin du traitement). La bronchoscopie flexible et les techniques de diagnostic ont été réalisées sous anesthésie surveillée, comme recommandé par l'American Thoracic Society et la British Thoracic Society.

Les échantillons de tissus seront fixés par gonflage ou immersion à l'aide de formaldéhyde ou de glutaraldéhyde et inclus dans de la paraffine. Les voies respiratoires seront systématiquement prélevées ou obtenues lors de la dissection diagnostique à la discrétion du pathologiste. Des sections consécutives de 0,5, 5 et 30 μm d'épaisseur ont été découpées dans chaque bloc et colorées en utilisant la technique du trichrome de Masson, l'hématoxyline et l'éosine, et l'hématoxyline, respectivement. La coloration immunohistochimique sera effectuée avec les mAb suivants : clone de tryptase anti-mastocyte AA1 (Dako UK), clone 1A4 d'actine musculaire lisse anti-alpha (Dako UK), clone de protéine basique majeure anti-éosinophile BMK-13 (Monosan, Pays-Bas) ), le clone anti-neutrophile élastase NP57 (Dako UK) et le clone anti-endothélium EN4 (Monosan, Pays-Bas) ou des contrôles d'isotype appropriés ont été utilisés.

Les biopsies endobronchiques seront évaluées par un seul observateur en aveugle aux caractéristiques cliniques (logiciel d'analyse d'images ZEN 2012 pour la microscopie optique, Carl Zeiss AG, Allemagne) et seront exprimées comme la moyenne des mesures effectuées à partir d'un minimum de deux coupes soit à partir de biopsies ou sous forme de coupes de tissus non contiguës distantes d'au moins 20 μm de la même biopsie. L'intégrité épithéliale sera évaluée en mesurant les longueurs d'épithélium intact et dénudé. Ceux-ci seront exprimés en pourcentage de toute la longueur de la membrane basale réticulaire (RBM). La vascularisation sera mesurée à l'aide du nombre de Chalkley, un substitut de la densité des vaisseaux et de la zone vasculaire. Un réticule d'oculaire de Chalkley (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, Royaume-Uni) sera utilisé à x200 pour mesurer le nombre de Chalkley dans quatre points chauds vasculaires non superposés (6). La teneur en muscle lisse des voies respiratoires sera déterminée comme la proportion de la surface totale. Les cellules inflammatoires ont été exprimées en nombre de cellules nucléées/surface de lamina propria.

Les échantillons de lavage bronchique seront immédiatement transportés au laboratoire, pour être stockés à -80 degrés. L'examen des fluides de lavage bronchique sera effectué ultérieurement pour déterminer plusieurs biomarqueurs.

Analyse des biomarqueurs de l'inflammation avec Flow Cytometry Analysis (FACS) ou ELIZA :

Biomarqueurs inclus avant et après le traitement par mépolizumab à deux ou trois moments (au départ, à 6 mois de traitement et après la visite de fin de traitement) : sous-ensembles de lymphocytes, cytokines Th2/Th17, chimiokines, expression des microARN à quantifier par cytométrie en flux ou ELISA) dans les fluides biologiques (sang, sérum, lavage bronchique, crachats et surnageant de crachats).

Les kits de panel et les anticorps appropriés seront testés par analyse par cytomètre en flux à l'aide d'un système BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA), conformément aux recommandations et aux instructions du fabricant.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) est une technique de dosage sur plaque conçue pour détecter et quantifier des substances telles que des peptides, des protéines, des anticorps et des hormones. Les kits ELISA seront analysés à l'aide du spectrophotomètre VICTOR X3 selon les recommandations et les instructions du fabricant.

Test d'allergie (le cas échéant) Le statut atopique des patients sera évalué (s'il n'est pas disponible) lors de la visite de dépistage par le test cutané (SPT) à un panel standard d'aéroallergènes pour détecter les anticorps IgE totaux contre divers allergènes inhalés courants.

Base de données Une plate-forme électronique de collecte de données sera la méthode utilisée au départ tous les 3 mois jusqu'à 1 an de suivi pour cette base de données. Lors des visites de traitement, des formulaires/questionnaires papier seront remplis par le pneumologue associé. Chaque site entrera des données spécifiques dans une base de données électronique. Chaque patient est identifié de manière unique par un numéro de sujet composé du numéro de site attribué par le site de surveillance responsable et d'un numéro séquentiel attribué par l'investigateur. Lors de la signature du formulaire de consentement éclairé, le patient se voit attribuer le numéro séquentiel suivant par l'investigateur. Le site doit contacter le personnel de recherche central et fournir les informations d'identification demandées pour le patient telles qu'elles sont enregistrées dans la base de données électronique. Les formulaires de visite de traitement seront également envoyés au personnel de recherche central. Le personnel autorisé de l'étude sera responsable de la collecte, de l'édition et de la protection des données collectées sur leur propre site et la base de données est sauvegardée quotidiennement. L'examen/le contrôle de la qualité relèvera de la responsabilité conjointe de toutes les personnes impliquées et du personnel de recherche central [dépositaire des données].

Calcul de la taille de l'échantillon Analyse de puissance G La taille de l'échantillon est calculée à l'aide du logiciel G*Power (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Allemagne). La différence de taux annuel d'exacerbation des patients atteints d'asthme éosinophile sévère d'apparition tardive avant et après le traitement par le mépolizumab est le critère d'évaluation principal de l'étude. Dans l'étude DREAM (l'une des deux seules études à avoir rapporté des résultats similaires à notre critère d'évaluation principal jusqu'à présent), il a été rapporté que le taux d'exacerbation annuel des patients souffrant d'asthme sévère a diminué de 3,6 à 1,33 après le début du traitement par Mepolizumab. En utilisant ces données et un test bilatéral, avec une puissance à 0,95 et un niveau de signification statistique à 0,05, les enquêteurs ont calculé une taille d'effet de 0,556, ce qui indiquait une taille d'échantillon totale de 45 participants.

Analyse du plan statistique L'analyse statistique sera effectuée à l'aide du SPSS (logiciel statistique IBM SPSS version 21.0, Armonk, NY, États-Unis). Les variables catégorielles seront exprimées en nombres (n) et en pourcentages (%), les variables continues en moyenne ± SD si elles sont normalement distribuées, ou médianes et intervalles interquartiles dans le cas contraire. Si nécessaire, les variables sans distribution normale seront transformées. P < 0,05 a été accepté comme statistiquement significatif. Le test de Shapiro-Wilk sera effectué afin de séparer les variables paramétriques des variables non paramétriques. Le test T pour échantillons appariés pour les variables paramétriques ou le test des rangs signés de Wilcoxon pour les variables non paramétriques sera utilisé pour détecter les différences dans les variables mesurées avant et après le traitement au mépolizumab.

Il n'y a pas de bras de comparaison car chaque patient est témoin de lui-même. Il existe des caractéristiques de base (biomarqueurs cliniques et de laboratoire) qui seront mesurées au départ, tous les 3 mois et après la fin du traitement de 52 semaines. Les critères d'évaluation de l'étude comprennent l'analyse de tous ces biomarqueurs ainsi que l'identification des caractéristiques des non-répondeurs et des super-répondeurs. De plus, les critères d'évaluation secondaires incluent l'évaluation des biomarqueurs mentionnés dans les méthodes en tant qu'évaluations. Une analyse statistique sera effectuée initialement avec le nombre de patients ayant terminé la période de traitement de 52 semaines. Dans un second temps, les patients n'ayant pas terminé le traitement de 52 semaines seront analysés séparément et enfin ces deux groupes vont être comparés l'un à l'autre.

Plus précisément, avec une analyse univariée (tests d'échantillons indépendants bilatéraux), les enquêteurs testeront les associations/corrélations entre tous les résultats de base par rapport à ceux après les traitements au mépolizumab (tous les 3 mois jusqu'à 1 an de traitement) : biomarqueurs dans les expectorations et dans le sang , résultats cliniques. De même, les associations univariées entre les résultats et les caractéristiques personnelles/démographiques seront testées pour identifier les facteurs de confusion potentiels. Les associations significatives seront ensuite testées avec des modèles de régression ajustés. Les associations/corrélations seront évaluées séparément selon les caractéristiques cliniques initiales et tous les 3 mois de suivi pendant le traitement ainsi qu'au départ et après 1 an de traitement par le mépolizumab. En outre, une analyse de sous-groupement sera effectuée pour chaque biomarqueur afin d'identifier le niveau de biomarqueur par rapport à la réponse au traitement.

Le test T pour échantillons appariés pour les variables paramétriques ou le test des rangs signés de Wilcoxon pour les variables non paramétriques sera utilisé pour détecter les différences dans les variables mesurées avant et après le traitement au mépolizumab. Plus précisément, les niveaux de biomarqueurs au départ seront comparés aux niveaux après 1 an de traitement par le mépolizumab.

La réponse globale au traitement en un an (de la ligne de base à 1 an après le début du traitement) pour chaque résultat sera mesurée avec un test apparié d'échantillons dépendants (tests appariés paramétriques et non paramétriques) chez chaque patient. Ensuite, la réponse au traitement sera définie comme le changement (changement absolu et pourcentage) du résultat en un an. Les chercheurs évalueront les prédicteurs influençant la réponse au traitement (changement) tels que les biomarqueurs en utilisant des modèles de régression multiples pour chaque résultat clinicopathologique. Pour les résultats avec plus de 2 observations par sujet pendant la période d'étude, les enquêteurs utiliseront des modèles mixtes utilisant les mesures répétées du résultat. Tous les tests seront bilatéraux avec un niveau de signification statistique à 5 %.