Effekten av Mepolizumab ved alvorlige astmatikere (MESILICO) (MESILICO)

Vitenskapelig begrunnelse Interleukin (IL)-5 er hovedcytokinet som er ansvarlig for aktiveringen av eosinofiler, og terapeutiske strategier har derfor blitt undersøkt og utviklet for klinisk bruk. Biologiske midler rettet mot IL-5 og dets reseptor (først mepolizumab og deretter reslizumab og benralizumab), har nylig blitt godkjent og brukt som tilleggsbehandling for alvorlig eosinofil astma som resulterer i en reduksjon i det sirkulerende eosinofiltallet, forbedring i lungefunksjon og forverring reduksjon i pasienter med alvorlig astma.

Respons på biologiske terapier ved alvorlig astma er variabel, med pasienter som enten ikke-respondere, respondere eller superresponderere. Det er foreløpig ingen forklaring på denne store variasjonen i responsen. Det er viktig å undersøke om disse pasientene har distinkte egenskaper som kan hjelpe behandlende lege med å stille riktig diagnose i klinisk praksis.

Målet med denne kliniske studien er å evaluere effekten av mepolizumab, et humanisert IL-5-antagonist monoklonalt antistoff hos pasienter med sent oppstått alvorlig eosinofil astma med fast obstruksjon og å identifisere egenskapene til ikke-respondere og super-respondere under mepolizumab-behandling. Denne studien anses som ikke-intervensjonell og hver prosedyre som er inkludert skjer i en klinisk rutine for diagnostisering og fenotyping av astmatiske pasienter.

Flere metoder brukes for å undersøke luftveisbetennelse: direkte målinger (som bronkialbiopsier eller bronkoalveolære skyllinger) og indirekte metoder (som symptomvurdering, blodprøveanalyse og lungefunksjonstester). De direkte teknikkene har fordelen av å pålitelig vurdere luftveisbetennelsen, men de er invasive og ikke gjennomførbare i stor skala på grunn av pasientens ubehag og risikoen som påløper. Når det gjelder de indirekte metodene, korrelerer de dårlig med den direkte vurderingen av luftveisbetennelse.

I denne studien, blant pasienters kliniske karakteristika spirometri, vil biomarkører for betennelse (blod eosinofiler, FeNO, IgE nivåer), impulsoscillometri (IOS) og fortykkelse av basalmembran via bronkoskopi bli evaluert. Det foreslås at sent oppståtte alvorlige eosinofile astmatiske pasienter med fast obstruksjon som ikke responderer på vanlig behandling (ICS/LABA/LAMA) vises med økt glatt muskelmasse. Imidlertid er de nøyaktige effektene av økt glatt muskelmasse i luftveiene på luftveisinnsnevring ikke kjent og kan variere med sykdommens alvorlighetsgrad. I tillegg vil biomarkører for inflammasjon også bli evaluert før og etter 52 ukers mepolizumabbehandling i biologiske væsker (serum, sputum, sputumsupernatant og bronkialprøver). Biomarkører for betennelse er svært viktige for å identifisere respondere på ikke-respondere.

Mer spesifikt har IOS blitt introdusert som en alternativ teknikk for å vurdere lungefunksjon med spesiell anvendelse på astma. Denne teknikken er ikke-invasiv, utføres enkelt under tidevannspusting og krever kun minimalt med pasientsamarbeid.

Sputuminnsamling er en annen måte å prøve celler fra luftveiene og tillater direkte vurdering av luftveisbetennelse. Videre inkluderer eksempler med sputumsupernatant analyse av mediatorer og vurdering av den kjemotaktiske aktiviteten til prøven for eosinofiler. Sputumcellene kan også analyseres ved flowcytometri som tillater blant annet immunfenotyping og sortering av celler. Videre kan sputumceller dyrkes, og deres mediatorproduksjon kan måles in vitro. Det er verdt å merke seg at i dette tilfellet er mediatorinnholdet forskjellig fra det som finnes i sputumsupernatanten. Faktisk kan mediatorer i sputumsupernatanten påvirkes av sekresjoner fra luftveisresidente celler og av plasmaekssudasjon, i motsetning til sputumcellekulturmodellen. Til slutt kan immunocytokjemi og in situ hybridisering også utføres ved bruk av sputumceller.

Selv om fenotyper, blodeosinofiler og serum-IgE-nivåer har blitt foreslått for bruk som referanse, er det en dissosiasjon mellom blodets immuncellenivå og luftveisepitelimmunreaksjonen, som bekreftet i tidligere studier. Luftveisepitelimmunhistokjemifarging for målrettede immunceller har blitt brukt for å bestemme ulike typer luftveisbetennelse; denne teknikken brukes imidlertid sjelden i kliniske omgivelser. Tidligere studier har avslørt den relative sikkerheten ved å utføre bronkoskopibiopsier for pasienter med alvorlig astma. Blant prøvetakingsteknikkene som brukes for vevsdiagnostikk, inkludert nesebiopsier, nese- eller bronkialbørsting og bronkoalveolær lavage, gir bronkoskopi-veiledet bronkial epitelprøvetaking mer nøyaktig informasjon om epitel- og inflammatoriske celler i vevssammenheng. Det er dermed et kraftig verktøy for å velge de mest egnede biologiske stoffene under vanskelige kliniske forhold.

Dessuten er astmatisk sykdom preget av en kronisk slimhinnebetennelsesprosess, som resulterer i irreversible endringer i bronkialveggen, i dag kjent som "bronkial remodellering". Kjertel- og glattmuskelfiberhyperplasi og/eller hypertrofi, begercellehyperplasi og variabel fortykkelse av basalmembranen (BM) tilstede under respiratorisk epitel er en del av disse morfologiske endringene. endringene generert ved epitel-forbindelsesgrensesnittet står for en "adaptiv respons" på inflammatorisk stress og sporadisk bronkokonstriksjon. Nåværende data om BM-reaktivitet hos astmatiske pasienter er imidlertid fortsatt ufullstendige for en nøyaktig vurdering av dens involvering i patogenese og spesifikt i remodellering av bronkialveggen, hovedsakelig fordi kollagenavleiringer i lamina reticularis ikke er korrelert til alvorlighetsgraden av sykdommen.

Dessuten er det stadig tydeligere at alvorlig astma ikke er en enkelt sykdom, noe som fremgår av mangfoldet av kliniske presentasjoner, fysiologiske egenskaper og utfall sett hos pasienter med astma. For bedre å forstå denne heterogeniteten har konseptet astma-fenotyping og endotyping dukket opp. Fenotyping integrerer både biologiske og kliniske egenskaper, fra molekylære, cellulære, morfologiske og funksjonelle til pasientorienterte egenskaper med mål om å forbedre terapien. Til syvende og sist utvikler disse fenotypene seg til astma-"endotyper", som kombinerer kliniske egenskaper med identifiserbare mekanistiske veier. Biomarkører, definert som egenskaper som kan måles objektivt og tjene som en indikator på underliggende biologiske prosesser eller patogenese, er avgjørende for å definere fenotyper og endotyper. Ved astma har genetiske polymorfismer, mål på luftveisfysiologi og nivåer av inflammatoriske mediatorer i urin, blod, sputum, vev, utåndet gass og pustekondensat blitt studert som potensielle markører for å forbedre og objektivisere astmadiagnose og behandling. Å utvikle slike verktøy vil tillate oss å fenotype og endotype de ulike kliniske mønstrene beskrevet i astma, med det endelige målet å skreddersy terapi basert på en spesifikk biomarkørprofil. Biomarkører kan deretter brukes for å bedre forstå den farmakologiske responsen på en intervensjon og justere behandlingen deretter.

Biomarkører har vært kritiske for studier av sykdomspatogenese og utvikling av nye terapier ved alvorlig astma. Spesielt har biomarkører av type 2-betennelse vist seg verdifulle for endotyping og målretting av nye biologiske midler. På grunn av disse suksessene med å forstå og markere type 2 betennelse, vil mangel på kunnskap om ikke-type 2 betennelsesmekanismer ved astma snart være den største hindringen for utvikling av nye behandlinger og håndteringsstrategier ved alvorlig astma. Andre potensielle biomarkører inkluderer medfødte lymfoide celler, IL-33 eller tymisk stromal lymfopoietin.

Nylige publikasjoner bekreftet den avgjørende regulatoriske rollen til miRNA-er i astmas patomekanisme. Noen enkelt miRNA-er eller settene deres holder løftet om deres bruk som astmabiomarkører som letter diagnose eller prediksjon av behandlingsresultater. De er også mulige mål for fremtidige terapier. Studiene på dette feltet mangler imidlertid. Nylig har det blitt vist at de fleste av de involverte miRNA-ene øker sekresjonen av Th2-cytokiner, reduserer sekresjonen av Th1-cytokiner, fremmer differensiering av T-celler mot Th2 eller spiller en rolle i hyperplasi og hypertrofi av glatte muskelceller i bronkiene. Profilene til miRNA korrelerer med kliniske egenskaper, inkludert lungefunksjon, fenotype og alvorlighetsgrad av astma.

De fleste industrisponsede biologiske kliniske studier har effektivt brukt tilnærmingen ovenfor ved å velge studieemner som ligner de alvorlige astma-kliniske fenotypene til SARP (medikamentregimer med høy intensitet, hyppige eksaserbasjoner og lav lungefunksjon), men som krever en forhøyet biomarkør (i blod, utåndet gass eller oppspytt) som skal identifisere pasienter som mest sannsynlig responderer på en spesifikk immunmodulator innenfor disse kliniske fenotypene. Biologien i nylig publiserte kliniske studier retter seg mot type 2 inflammatoriske veier og begrenser deltakelse til personer med forhøyede type 2 biomarkører (blod eller sputum eosinofiler eller FeNO). Post hoc responder-analyser for å "gruppere" biomarkører for bedre å forstå hvilke pasienter som har størst nytte av en biologisk immunmodulator, vil føre til en forståelse av at samtidige økninger i mer enn 1 type 2 inflammatorisk biomarkør ytterligere kan identifisere "high responder" pasienter.

Hypotesen inkluderer effekten av mepolizumabbehandling hos sent debuterende alvorlige eosinofile astmatiske pasienter med fast obstruksjon og relasjon til kliniske og inflammatoriske biomarkører.

Forskningsspørsmål Er det noen forbedring i eksacerbasjonsrate hos sent-debuterende alvorlige eosinofile astmatiske pasienter under mepolizumab-behandling i løpet av deres 1. behandlingsår, og hva kjennetegner ikke-respondere og superrespondere? Er det noen forbedring i remodellering av glatte muskelceller? Finnes det noen biomarkører for å forutsi respons på mepolizumab-behandling hos sent debuterende alvorlige eosinofile astmatiske pasienter? Er det noen forbedring i respirasjonsparametere? Er det noen forbedring i astmakontroll og pasienters livskvalitet? Mål

Hovedmålene med denne studien er:

1. For å demonstrere effekten av mepolizumab-behandling i eksacerbasjonsfrekvens hos sent-debuterte alvorlig eosinofile astmatiske pasienter med fast obstruksjon.
2. Å identifisere kjennetegn ved ikke-respondere og superrespondere.

De viktigste sekundære målene for denne studien er:

1. Enhver forbedring i ombygging (fortykkelse av glatte muskelceller i bronkiene).
2. Eventuelle biomarkører for respons.
3. Enhver forbedring i respiratoriske parametere i astmakontroll og i pasienters livskvalitet under mepolizumab-behandling hos sent debuterende alvorlig eosinofile astmatiske pasienter med fast obstruksjon.

Studiedesign og metoder Pasienter vil bli samlet inn fra poliklinikker for bronkial astma fra hvert sted (8 i antall) som dekker befolkningen i Hellas. Alle disse klinikkene er inkludert for å forsterke rekrutteringen, samt for å inkludere bronkoskopeksperter med internasjonal innvirkning. På grunn av den nåværende situasjonen angående Covid-19-pandemien, antar etterforskerne at denne kliniske studien ikke forstyrrer arbeidsbelastningen i våre klinikker.

Totalt sett er dette en prospektiv multisenterstudie som inkluderer åtte lungeklinikker. Fem lungeuniversitetsklinikker, to fra National Health System og ett Army General Hospital.

Studien vil inkludere en screeningperiode på opptil 2 uker for å vurdere kvalifisering og innhente skriftlig informert samtykke, en mepolizumab-behandlingsperiode på 52 uker, en gang hver 4. uke, inkludert oppfølgingsbesøk hver 3. måned under behandlingen.

Studiepopulasjonen vil bestå av 45 pasienter med sent oppstått alvorlig eosinofil astma og fast obstruksjon som får mepolizumab i alderen 20 år og oppover.

Studiedeltakelse, vurdering og oppfølging:

Screening: Etterforskerne vil screene utvalgte forsøkspersoner til de deltatte klinikkene (poliklinikker for alvorlig astma). Forsøkspersoner vil komme inn for å signere samtykke. Klinisk vurdering og prosedyrer og strukturelle intervjuer vil bli utført under screening. Emner som er kvalifiserte/i stand til å fullføre screeningbesøket kan gjøre det samme dag, og om nødvendig vil de fullføre grunnvurderingen innen 2 uker. Pasienter med en pågående astmaforverring bør få sitt screening- og behandlingsoppstartsbesøk forsinket til etterforskeren vurderer at forsøkspersonen har returnert til sin baseline astmastatus. Hvis screeningsperioden på 2 uker har gått, bør forsøkspersonen betraktes som en screeningssvikt. Forsøkspersonene vil forbli på sin nåværende vedlikeholdsbehandling gjennom screeningsperioder. Pasientenes valgbarhet vil være basert på kriteriene som er oppført i de neste avsnittene.

Anamnese med astmaforverring de siste 12 månedene vil bli rapportert ved screeningbesøk. Eksacerbasjoner vil også bli evaluert ved hvert besøk som rapportert.

Vitale tegn vil bli utført ved screeningbesøk, ved baseline og hver 3. måned. Målinger vil inkludere systolisk og diastolisk blodtrykk, puls og kroppstemperatur.

Høyde i centimeter (cm) og kroppsvekt i kilogram (kg) vil bli målt ved screeningbesøk. Kroppsmasseindeksen (BMI) vil bli beregnet som vekten i kg delt på høyden i meter i annen

Laboratorieevaluering (hematologi, blodkjemi, urinanalyse):

Venøst ​​blod og urin vil bli samlet ved baseline. Hematologi: Hemoglobin, hematokrit, antall røde blodlegemer, antall hvite blodlegemer med differensial, og blodplater vil bli målt i laboratoriet på hvert steds sykehus. Grunnleggende klinisk kjemi og urinanalyse vil bli evaluert. Innsamling av urin for kvinnelige forsøkspersoner vil også evaluere graviditet.

IgE-nivåer vil bli evaluert ved screeningbesøk ved hjelp av immunoCAP-tester og vil bli rapportert som IE/ml.

Følgende spørreskjemaer vil bli administrert: 1) Astmakontrollspørreskjemaet (ACQ-5) og astmakontrolltesten (ACT) for å vurdere gjeldende astmakontroll; 2) Astma Quality of Life Questionnaire (AQLQ+12) for å vurdere livskvalitet og psykologisk sykelighet. For ytterligere å vurdere søvnkvaliteten 1) Athens Insomnia Scale (AIS), 2) Epworth Sleepiness Scale (ESS), 3) St. George's Respiratory Questionnaire (SGRQ) og 4) WHO (Fem) Well-Being Index (WHO-5), 5) Fatigue Severity Scale (FSS).

Utåndet nitrogenoksid (NO) vil bli målt ved baseline og hver 3. måned i henhold til American Thoracic Society Guidelines og spesifisert av produsenten. FeNO-nivåer vil bli rapportert som deler per milliard. Målinger vil bli gjort før spirometri utføres.

Venøse blodprøver vil bli tatt mellom kl. 08.00 og 10.00, ved baseline og hver 3. måned i løpet av 52-ukers perioden med mepolizumabbehandling. Absolutt eosinofiltall i blod vil bli rapportert som celler/μl.

Spirometri: Spirometri A vil bli utført ved bruk av stedets eget utstyr ved besøkene (baseline og hver 3. måned). Alle klinikkbesøk skal skje om morgenen. I løpet av behandlingsperioden vil spirometrien oppfylle gjeldende ATS/ERS-retningslinjer og spirometeret må produsere en utskrift av alle genererte data, som skal lagres i pasientens notater. Spirometeret vil bli kalibrert i henhold til produsentens instruksjoner. Spirometri må utføres samtidig (±1 time) med Visit 0-spirometrien. Pasienter bør prøve å holde tilbake korttidsvirkende beta-2-agonister (SABA) i ≥4 timer og LABA i ≥15 timer før klinikkbesøk, hvis mulig (GINA 2019). Vurderinger som skal registreres vil inkludere FEV1, FVC, FEV1/FVC%, PEF og FEF25-75. Post-bronkodilatatormålinger vil bli tatt ved hvert besøk, med 200-400mcg albuterol eller tilsvarende.

Spirometri B vil bli utført ved bruk av stedets eget utstyr ved besøkene (baseline, etter 6 måneder og etter behandling ved 52 ukers tidspunkt). Spirometri B inkluderer diffusjon, pulmonale volumer og kapasiteter.

Impulsoscillometri (valgfritt):

Impulsosillometri (IOS) vil bli utført ved baseline og etter 52 ukers behandling. IOS inkluderer motstand ved 5 Hz-motstand ved 20 Hz (R5-R20), et mål som reflekterer respirasjonsmotstand i små til mellomstore ledende og perifere luftveier, AX, et mål som reflekterer utvidbarheten til de perifere lungene (nemlig parenkymet og små perifere luftveier) , og respirasjonssystemets reaktans (X5), et mål som reflekterer treghet og elastisitet eller kapasitans (inkludert små perifere luftveier).

Behandling med biologiske midler:

Etter fullført screeningbesøk kan deltakeren starte behandling med biologisk terapi (mepolizumab) innen en måned. Under terapien vil forsøkspersonene være under behandling av lungelegen som har henvist dem til forskningsgruppen for å delta i studien. Disse lungelegene vil bli betegnet som 'associate pulmonologists'. Behandling vil bli gitt i henhold til produktprodusentens instruksjoner.

Tilknyttede lungeleger som gir biologisk behandling under studien vil kreve å signere en avtale om å gjennomføre studien i samsvar med protokollen, for å erkjenne at han/hun er ansvarlig for medisinsk oppførsel og for studieoppførsel, og for å sikre at medarbeideren (og deres kolleger) og ansatte) som bistår i gjennomføringen av studien, informeres om sine forpliktelser. Mekanismer vil være på plass for å sikre at tilknyttede ansatte får riktig informasjon og støtte fra forskningsgruppen gjennom hele studien.

Oppfølging under biologisk terapi: Ved oppstart og ved hvert besøk for administrasjon av biologisk terapi vil innhenting av informasjon bli utført av assisterende lungelege, og med støtte fra forskningsgruppen hvis forespurt av assisterende lungelege, f.eks. forskere via telefon eller ansikt til- ansiktskontakt vil intervjue pasienten. Videre vil overholdelse bli registrert fra legen basert på pasientens muntlige bekreftelse. Datoform for legemiddeladministrasjon vil bli registrert ved hvert besøk, samt umiddelbare og forsinkede bivirkninger.

Sikkerhetsovervåking:

Registrerte uønskede hendelser (AE) vil bli overvåket og sammenstilt etter behov i studierapporter. En uønsket hendelse er utseendet eller forverringen av ethvert uønsket tegn, symptom eller medisinsk tilstand som oppstår etter at studien startet. Medisinske tilstander/sykdommer som er tilstede før oppstart av studielegemiddel anses bare som uønskede hendelser hvis de forverres etter oppstart av studielegemiddel. Unormale laboratorieverdier eller testresultater utgjør uønskede hendelser bare hvis de induserer kliniske tegn eller symptomer, anses som klinisk signifikante eller krever behandling. Også uønskede hendelser relatert til Covid-19 er inkludert. Hvis en partner lungelege eller forskningspersonell blir oppmerksom på en AE assosiert med et produkt, kan det rapporteres til produsenten i henhold til deres lokale standardpraksis for spontan AE-rapportering. Kopi av rapporten skal også sendes til studiekoordinator. Alvorlige uønskede hendelser (SAE) vil bli rapportert på eCRF-sidene og innen 24 timer vil alle etterforskerne ha ansvar for å informere sentralkomiteen i Thessaloniki. Deretter vil sentralkomiteen informere det vitenskapelige styret og det greske legekontoret. Medisinsk og vitenskapelig vurdering vil også bli utøvd av hovedetterforskeren ved hvert senter med sentralkomiteen, for å avgjøre om forsøkspersonen skal stoppe behandlingen eller ikke.

Graviditetsrapport:

I første omgang må kvinnelige pasienter ved screening ta en graviditetstest. Under behandling, hvis en kvinnelig forsøksperson rapporterer en graviditet til oss, vil hun bli bedt om å trekke seg fra studien (for å forhindre skjevhet). Deretter vil hun bli spurt om hun vil fortsette å få behandlingen utenfor denne protokollen og bli overvåket kl. hvert senters poliklinikk.

Pre-screening og screening feil:

Forsøkspersonene vil bli tildelt et studienummer ved signering av samtykket. Forsøkspersoner som har signert, men ikke går videre til vurderingen av screeningbesøk, vil bli ansett som en feil på forhånd. Ingen data vil bli fanget opp i databasen for disse fagene.

Personer som gjennomfører minst ett av de to screeningbesøkene, men som ikke starter biologisk behandling, vil bli utpekt som screeningsfeil. Informasjon som skal samles inn for forhåndskontroll og screeningsfeil vil bli detaljert i databasefullføringen.

Uttaksbesøk:

Hvis en deltaker bestemmer seg for å trekke seg fra studien under oppfølgingen (av andre grunner enn tap for å følge opp), kan de bli bedt om å delta på et tilbaketrekningsbesøk (hvis det anses nødvendig av utrederen og med forbehold om samtykke). Under besøket kan deltakeren bli stilt spørsmål om deres nåværende tilstander som en del av klinisk informasjonsinnsamling som: astma og nasale symptomer, eksaserbasjoner og progresjon av behandlingen som mottas.

Innsamling og behandling av blodprøver:

Blodprøver vil bli tatt ved baseline besøk, 6 måneder og etter fullført behandling. Etter å ha tatt blodprøvene vil de stå uforstyrret i omtrent en halv time for fullstendig koageldannelse. Prøven vil deretter bli sentrifugert for å skille serumet fra koagelen. Etter sentrifugering vil serumet lagres ved -20°C i eppendorf-rør til analysen er utført. Blodfenotyping vil også bli evaluert ved flowcytometri.

Indusert sputum (valgfritt):

Indusert sputum vil bli utført ved baseline før behandlingsstart og etter fullført behandling i henhold til ERS Task Force-rapporten hvor en detaljert ekspertkonsensusbasert anbefaling for indusert sputumbehandling er foreslått.

Ved besøkene vil sputuminduksjon bli utført etter at de rutinemessige spirometriske vurderingene er gjennomført.

Det induserte sputumet vil bli behandlet innen to timer etter slutten av induksjonsprosedyren på forskningsstedet. Sputumceller og cellesuspensjonssupernatant vil bli lagret ved -80ºC for analyse. Etter innsamling av det induserte sputumet, vil supernatanten av prøven bli lagret ved -20°C i eppendorf-rør til analysen er utført. Etter disse prosedyrene er laboratorieevaluering av sputum neste i henhold til retningslinjer.

Bronkoskopi, bronkialbiopsier og vaskeprøvers innsamling og behandling (valgfritt): Ved besøkene vil det bli utført endoskopi med bronkialbiopsier, bronkial vaskeprøve (Besøk 0b) etter pasientens skriftlige samtykke. Nærmere bestemt vil et eget informert samtykke inkluderes som skal signeres fra hver pasient. Bronkoskopi vil bli utført på to tidspunkter (grunnlinje før behandlingsstart og etter fullført behandling). Fleksibel bronkoskopi og diagnostiske teknikker ble utført under overvåket anestesibehandling som anbefalt av American Thoracic Society og British Thoracic Society.

Vevsprøver vil bli fiksert i oppblåsing eller nedsenking ved bruk av formaldehyd eller glutaraldehyd og innebygd i parafin. Luftveier vil systematisk tas eller innhentes under diagnostisk disseksjon etter patologens skjønn. Påfølgende seksjoner med 0,5, 5 og 30 μm tykkelse ble kuttet fra hver blokk og farget ved bruk av Massons trikromteknikk, henholdsvis hematoksylin og eosin og hematoksylin. Immunhistokjemisk farging vil bli gjort med følgende mAbs: anti-mastcelletryptaseklon AA1 (Dako UK), anti-alfa glattmuskelaktinklon 1A4 (Dako UK), anti-eosinofil hovedproteinklon BMK-13 (Monosan, Nederland) ), anti-nøytrofil elastase klon NP57 (Dako UK), og anti-endotel klon EN4 (Monosan, Nederland) eller passende isotype kontroller ble brukt.

De endobronkiale biopsiene vil bli vurdert av en enkelt observatør som er blindet for de kliniske egenskapene (ZEN 2012 bildeanalyseprogramvare for lysmikroskopi, Carl Zeiss AG, Tyskland) og vil uttrykkes som gjennomsnittet av målinger utført fra minimum to seksjoner enten fra uavhengige biopsier eller som ikke-sammenhengende vevssnitt minst 20μm fra den samme biopsien. Epitelets integritet vil bli vurdert ved å måle lengdene av intakt og blottet epitel. Disse vil bli uttrykt i prosent av hele lengden på den retikulære basalmembranen (RBM). Vaskularitet vil bli målt ved å bruke Chalkley-tellingen, et surrogat av både kartetthet og vaskulært område. En Chalkley okulargraticule (NG52 Chalkley Point Array, Pyser-SGI Ltd, UK) vil bli brukt ved x200 for å måle Chalkley-tellinger i fire ikke-overlappende vaskulære hotspots (6). Innholdet av glatt muskulatur i luftveiene vil bli bestemt som andelen av det totale arealet. Inflammatoriske celler ble uttrykt som antall kjerneholdige celler/areal av lamina propria.

Bronkialvaskeprøver vil umiddelbart bli fraktet til laboratoriet, for oppbevaring ved -80 grader. Undersøkelse av bronkiale vaskevæsker vil bli utført på et senere tidspunkt for å bestemme flere biomarkører.

Analyse av biomarkører for betennelse med Flow Cytometry Analysis (FACS) eller ELIZA:

Biomarkører inkludert før og etter behandling med mepolizumab på to eller tre tidspunkter (ved baseline, ved 6 måneders behandling og etter behandlingsavslutningsbesøk): lymfocyttundergrupper, Th2/Th17 cytokiner, kjemokiner, mikroRNA-ekspresjon som skal kvantifiseres ved flowcytometri eller ELISA) i biologiske væsker (blod, serum, bronkial vask, sputum og sputum supernatant).

Panelsett og passende antistoffer vil bli testet av Flow Cytometer Analysis ved bruk av et BD FACS Calibur-system (BD Biosciences, San Jose, CA), i henhold til produsentens anbefalinger og instruksjoner.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) er en platebasert analyseteknikk utviklet for å oppdage og kvantifisere stoffer som peptider, proteiner, antistoffer og hormoner. ELISA-sett vil bli analysert med VICTOR X3 spektrofotometer i henhold til produsentens anbefalinger og instruksjoner.

Allergitesting (hvis aktuelt) Pasientenes atopiske status vil bli evaluert (hvis ikke tilgjengelig) ved screeningbesøk av hudpriktesten (SPT) til et standardpanel av aeroallergener for påvisning av totale IgE-antistoffer mot forskjellige vanlige inhalerende allergener.

Database En elektronisk datainnsamlingsplattform vil være metoden som brukes ved baseline hver 3. måned inntil 1 års oppfølging av denne databasen. Under behandlingsbesøk vil papirskjemaer/spørreskjema fylles ut av den assisterende lungelegen. Hvert nettsted vil legge inn spesifikke data i en elektronisk database. Hver pasient er unikt identifisert av et emnenummer som består av stedsnummeret tildelt av det ansvarlige overvåkingsstedet og et sekvensnummer tildelt av etterforskeren. Ved å signere skjemaet for informert samtykke, blir pasienten tildelt neste sekvensnummer av utrederen. Nettstedet skal kontakte det sentrale forskningspersonellet og oppgi etterspurt identifikasjonsinformasjon for pasienten slik den er registrert i den elektroniske databasen. Behandlingsbesøksskjemaene vil også bli sendt til det sentrale forskningspersonellet. Det autoriserte studiepersonellet vil være ansvarlig for datainnsamling, redigering og beskyttelse av dataene som samles inn på deres egen side, og databasen sikkerhetskopieres på daglig basis. Kvalitetsgjennomgang/kontroll vil være et felles ansvar for alle involverte personer og det sentrale forskningspersonellet [datadepoter].

Prøvestørrelsesberegning G-effektanalyse Prøvestørrelsen beregnes ved hjelp av G*Power-programvaren (Die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Tyskland). Forskjellen i årlig eksacerbasjonsrate for pasienter med sent debuterende alvorlig eosinofile astmatikere før og etter behandling med Mepolizumab er det primære endepunktet i studien. I DREAM-studien (en av de eneste to studiene som har rapportert resultater som ligner på vårt primære endepunkt så langt) ble det rapportert at den årlige eksaserbasjonsraten for pasienter med alvorlig astma gikk ned fra 3,6 til 1,33 etter oppstart av behandling med Mepolizumab. Ved å bruke disse dataene og en tosidig test, med en styrke på 0,95 og et nivå av statistisk signifikans på 0,05, beregnet etterforskerne en effektstørrelse på 0,556, som indikerte en total prøvestørrelse på 45 deltakere.

Statistisk plananalyse Statistisk analyse vil bli utført ved hjelp av SPSS (versjon 21.0 IBM SPSS statistisk programvare, Armonk, NY, USA). Kategoriske variabler vil oppgis som tall (n) og prosenter (%), kontinuerlige variabler som gjennomsnitt ± SD hvis normalfordelt, eller median og interkvartilområder hvis annet. Der det er nødvendig vil variabler uten normalfordeling transformeres. P < 0,05 ble akseptert som statistisk signifikant. Shapiro-Wilk test vil bli utført for å skille parametriske fra ikke-parametriske variabler. Paired-Samples T-test for parametrisk eller Wilcoxon Signed Ranks-test for ikke-parametriske variabler vil bli brukt for å oppdage forskjeller i variablene målt før og etter Mepolizumab-behandling.

Det er ingen komparatorarm da hver pasient har kontroll over seg selv. Det er baseline-karakteristikker (kliniske og laboratoriebiomarkører) som skal måles ved baseline, hver tredje måned og etter 52 ukers behandling. Studiens endepunkter inkluderer analysen av alle disse biomarkørene som identifisering av egenskapene til ikke-respondere og super-respondere. Sekundære endepunkter inkluderer også evaluering av biomarkørene nevnt i metodene som vurderinger. Statistisk analyse vil initialt bli utført med antall pasienter som har fullført den 52 uker lange behandlingsperioden. For det andre vil pasienter som ikke har fullført 52 ukers behandling analyseres separat, og til slutt skal disse to gruppene sammenlignes med hverandre.

Mer spesifikt, med univariat analyse (tosidig uavhengige prøvetester) vil etterforskerne teste for assosiasjoner/korrelasjoner mellom alle baseline-utfall sammenlignet med de etter mepolizumab-behandlinger (hver 3. måned frem til 1 års behandling): biomarkører i sputum og i blod , kliniske utfall. På samme måte vil univariate assosiasjoner mellom utfall og personlige/demografiske egenskaper bli testet for å identifisere potensielle konfoundere. Signifikante assosiasjoner vil deretter bli testet med justerte regresjonsmodeller. Assosiasjoner/korrelasjoner vil bli evaluert separat ved baseline kliniske karakteristika og hver 3. måned oppfølging under behandling samt ved baseline og etter 1 års mepolizumabbehandling. Dessuten vil undergruppeanalyse bli utført for hver biomarkør for identifisering av biomarkørnivå til behandlingsrespons.

Paired-Samples T-test for parametrisk eller Wilcoxon Signed Ranks-test for ikke-parametriske variabler vil bli brukt for å oppdage forskjeller i variablene målt før og etter Mepolizumab-behandling. Spesielt vil nivåer av biomarkører ved baseline sammenlignes med nivåer etter 1 års mepolizumabbehandling.

Samlet respons på behandling i ett år (fra baseline til 1 år etter behandlingsstart) for hvert utfall vil bli målt med paret test av avhengige prøver (parametriske og ikke-parametriske parede tester) hos hver pasient. Da vil respons på behandling defineres som endringen (absolutt og % endring) av utfallet på ett år. Etterforskerne vil vurdere prediktorer som påvirker respons på behandling (endring), som biomarkører ved å bruke flere regresjonsmodeller for hvert klinisk patologisk resultat. For utfall med mer enn 2 observasjoner per forsøksperson i løpet av studieperioden vil etterforskerne bruke blandede modeller som bruker de gjentatte målingene av utfallet. Alle tester vil være 2-sidige med et statistisk signifikansnivå på 5 %.