Průtoková cytometrická analýza eozinofilů u pacientů s těžkým astmatem.

Subjekt splňující kritéria způsobilosti bude požádán o účast ve studii; všichni obdrží podrobné vysvětlení povahy studie, cílů a záměrů. Po podepsání informovaného souhlasu budou pacienti rozděleni do dvou skupin na základě jejich klinického stavu: skupina s kontrolovaným astmatem (skupina A) a skupina s těžkým astmatem (skupina B). Návštěvy budou naplánovány při náboru, po zaváděcím období (3 měsíce), jehož cílem je optimalizovat léčbu první a druhé linie a potvrdit diagnózu těžkého astmatu. Po zaváděcí době budou pacienti přehodnoceni a vhodná léčebná terapie bude přizpůsobena (T0). Skupině B bude podávána terapie mepolizumabem nebo omalizumabem podle standardních doporučení. V T0 bude odebrán vzorek krve (3 ml) k vyhodnocení fenotypu eozinofilů průtokovou cytometrií (viz níže). Po 6 měsících (T1/2) a 12 měsících (T1) budou pacienti znovu navštíveni a bude jim odebrán vzorek krve pro analýzu průtokovou cytometrií. Všechny vzorky budou řádně uloženy a odeslány k analýze v souladu s nejlepší praxí a současným stavem techniky. kritérií, do 6 hodin od odběru vzorku. Údaje budou shromažďovány a uchovávány v souladu s GDPR (obecné nařízení o ochraně osobních údajů, EU 2016/679). Odebraný biologický materiál bude použit pouze pro uvedený test a přebytečný materiál bude odstraněn.

• Základní hodnocení (T'0) V případě přijetí a po podepsání informovaného souhlasu budou účastníci požádáni, aby shromáždili kompletní anamnézu, včetně alergií a komorbidit souvisejících s astmatem; komplexní fyzikální vyšetření a testy respiračních funkcí sestávající z: průtokově-objemové spirometrie plus reziduální objem a stanovení DLCO. V případě první diagnózy astmatu bude provedena bronchodilatační odpověď nebo metacholinový provokační test. V případě již existující diagnózy astmatu bude shromážděno předchozí vyšetření potvrzující a prokazující diagnózu.
• Hodnotící nástroj Následující údaje budou shromažďovány v T'0, T'1/2 (šest měsíců) a T'1 (12 měsíců): Klinické hodnocení: ACT, na vyžádání nebo záchranná terapie, akutní exacerbace, lékařské návštěvy, pracovní absence , hospitalizace. Funkční hodnocení: Křivka průtokového objemu, Zbytkový objem, Ig E a počet eozinofilů, FeNO, test 6 minut chůze.
• Průtoková cytometrie Vyšetřovatelé vyhodnotí vícebarevnou průtokovou cytometrií expresi molekul na membráně eozinofilů za použití protokolu barvení celé krve, takže vzorky krve budou minimálně manipulovány, čímž se sníží možnost artefaktů. Stručně řečeno, vzorky periferní krve budou zpracovány do 6 hodin od odběru. Vzorky budou až do zpracování skladovány při pokojové teplotě. Vzorky krve budou obarveny pomocí protilátek konjugovaných s fluorochromem namířených proti povrchovým molekulám eozinofilů. Výzkumníci budou používat zejména protilátky proti CD45, CD66, CD15, CD16 a Siglec-8, které budou použity k identifikaci eozinofilů mezi jinými leukocyty; CD63, CD294 (CRTH2, receptor prostaglandinu D2), CD125 (receptor IL-5), CD193 (receptor pro několik chemokinů, jako je například RANTES, Eotaxin, MCP-3, MIP1α) a HLA-DR: tyto molekuly jsou upregulovány aktivaci eozinofilů, takže mohou mít u pacientů s těžkým astmatem změněnou expresi. Po 30 minutách inkubace při 4 °C se k odstranění erytrocytů použije lyzační roztok FACS (BD Bioscience) podle pokynů výrobce. Vzorky budou resuspendovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) a získány na průtokovém cytometru LSRFortessa X-20 (BD Bioscience) vybaveném čtyřmi lasery.