Flowcytometrie-analyse van eosinofielen bij patiënten met ernstig astma.

Proefpersonen die aan de geschiktheidscriteria voldoen, zullen worden gevraagd om deel te nemen aan het onderzoek; iedereen krijgt een gedetailleerde uitleg van de aard van de studie, van de doelen en doelstellingen. Na het ondertekenen van de geïnformeerde toestemming worden de patiënten verdeeld in twee groepen, op basis van hun klinische status: gecontroleerde astmagroep (groep A) en ernstige astmagroep (groep B). Bezoeken zullen worden gepland bij rekrutering, na een inloopperiode (3 maanden), bedoeld om de eerste- en tweedelijns medische behandeling te optimaliseren en de diagnose van ernstig astma te bevestigen. Na de inloopperiode worden patiënten opnieuw geëvalueerd en wordt passende medische therapie op maat gemaakt (T0). Aan groep B wordt therapie gegeven met Mepolizumab of Omalizumab, volgens standaardrichtlijnen. Op T0 wordt een bloedmonster afgenomen (3 ml) om het fenotype van eosinofielen te evalueren door middel van flowcytometrie (zie hieronder). Na 6 maanden (T1/2) en 12 maanden (T1) worden de patiënten opnieuw bezocht en wordt er een bloedmonster genomen voor flowcytometrie-analyse. criteria, binnen 6 uur na verzameling van het monster. Gegevens worden verzameld en opgeslagen in overeenstemming met de AVG (Algemene Verordening Gegevensbescherming, EU 2016/679). Verzameld biologisch materiaal wordt alleen gebruikt voor de aangegeven assay en overtollig materiaal wordt afgevoerd.

• Baseline-evaluatie (T'0) In geval van acceptatie, en na ondertekening van een geïnformeerde toestemming, wordt de deelnemers gevraagd een volledige medische geschiedenis te verzamelen, inclusief allergieën en astma-gerelateerde comorbiditeiten; een uitgebreid lichamelijk onderzoek en respiratoire functietesten bestaande uit: flow-volume spirometrie plus restvolume- en DLCO-bepaling. In het geval van een eerste diagnose van astma zal een bronchusverwijdende respons of een methacholineprovocatietest worden verkregen. In het geval van een pre-existente diagnose van astma, zal voorafgaand onderzoek dat de diagnose bevestigt en bewijst verzameld worden.
• Evaluatietool De volgende gegevens worden verzameld op T'0, T'1/2 (zes maanden) en T'1 (twaalf maanden): Klinische beoordeling: ACT, on-demand- of reddingstherapie, acute exacerbaties, medische bezoeken, werkverzuim , ziekenhuisopnames. Functionele beoordeling: stroomvolumecurve, restvolume, Ig E en aantal eosinofielen, FeNO, looptest van 6 minuten.
• Flowcytometrie De onderzoekers zullen met behulp van meerkleurenflowcytometrie de expressie van moleculen op het membraan van eosinofielen evalueren, gebruikmakend van een volbloedkleuringsprotocol, zodat bloedmonsters minimaal worden gemanipuleerd, waardoor de kans op artefacten wordt verkleind. In het kort: monsters van perifeer bloed worden binnen 6 uur na afname verwerkt. Monsters worden tot verwerking bij kamertemperatuur bewaard. Bloedmonsters worden gekleurd met behulp van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen gericht tegen de oppervlaktemoleculen van eosinofielen. De onderzoekers zullen met name antilichamen gebruiken tegen CD45, CD66, CD15, CD16 en Siglec-8, die zullen worden gebruikt om eosinofielen tussen andere leukocyten te identificeren; CD63, CD294 (CRTH2, prostaglandine D2-receptor), CD125 (IL-5-receptor), CD193 (receptor voor verschillende chemokinen, zoals bijvoorbeeld RANTES, Eotaxin, MCP-3, MIP1α) en HLA-DR: deze moleculen worden opgereguleerd met eosinofielen activeren, zodat ze een veranderde expressie kunnen hebben bij ernstige astmapatiënten. Na 30 minuten incubatie bij 4°C wordt FACS lysing-oplossing (BD Bioscience) gebruikt om erytrocyten te verwijderen, volgens de instructies van de fabrikant. Monsters worden opnieuw gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en verkregen op een LSRFortessa X-20 (BD Bioscience) flowcytometer, uitgerust met vier lasers.