Analisi della citometria a flusso degli eosinofili nei pazienti con asma grave.

Ai soggetti che soddisfano i criteri di ammissibilità verrà chiesto di partecipare allo studio; tutti riceveranno una spiegazione dettagliata della natura dello studio, delle finalità e degli obiettivi. Dopo aver firmato il consenso informato, i pazienti saranno divisi in due gruppi, in base al loro stato clinico: gruppo asma controllato (gruppo A) e gruppo asma grave (gruppo B). Le visite saranno pianificate al momento del reclutamento, dopo un periodo di rodaggio (3 mesi), inteso a ottimizzare il trattamento medico di prima e seconda linea e confermare la diagnosi di asma grave. Dopo il periodo di rodaggio, i pazienti saranno rivalutati e verrà adattata una terapia medica appropriata (T0). Al gruppo B verrà somministrata la terapia con Mepolizumab o Omalizumab, secondo le linee guida standard. A T0 verrà prelevato un campione di sangue (3ml) per valutare il fenotipo degli eosinofili mediante citometria a flusso (vedi sotto). Dopo 6 mesi (T1/2) e 12 mesi (T1) i pazienti saranno nuovamente visitati e verrà prelevato un campione di sangue per l'analisi di citometria a flusso. Tutti i campioni saranno adeguatamente conservati e spediti per l'analisi, secondo le migliori pratiche e lo stato dell'arte criteri, entro 6 ore dalla raccolta del campione. I dati saranno raccolti e conservati secondo il GDPR (Regolamento generale sulla protezione dei dati, UE 2016/679). Il materiale biologico raccolto verrà utilizzato solo per il dosaggio indicato e il materiale in eccesso verrà scaricato.

• Valutazione di base (T'0) In caso di accettazione, e dopo aver firmato un consenso informato, ai partecipanti verrà chiesto di raccogliere una storia medica completa, comprese le allergie e le comorbidità correlate all'asma; un esame fisico completo e test di funzionalità respiratoria consistenti in: spirometria flusso-volume più volume residuo e determinazione del DLCO. In caso di prima diagnosi di asma sarà ottenuta una risposta al broncodilatatore o un test di provocazione con metacolina. In caso di diagnosi preesistente di asma, verranno raccolti esami precedenti che confermano e comprovano la diagnosi.
• Strumento di valutazione I seguenti dati saranno raccolti a T'0, T'1/2 (sei mesi) e T'1 (dodici mesi): Valutazione clinica: ACT, terapia on demand o rescue, riacutizzazioni, visite mediche, assenze lavorative , ricoveri ospedalieri. Valutazione funzionale: Curva del flusso volumetrico, Volume residuo, Ig E e conta degli eosinofili, FeNO, 6 minutes walk test.
• Citometria a flusso I ricercatori valuteranno, mediante citometria a flusso multicolore, l'espressione di molecole sulla membrana degli eosinofili, utilizzando un protocollo di colorazione del sangue intero, in modo che i campioni di sangue vengano manipolati minimamente, riducendo così la possibilità di artefatti. In breve, i campioni di sangue periferico verranno processati entro 6 ore dal prelievo. I campioni saranno conservati a temperatura ambiente fino al trattamento. I campioni di sangue saranno colorati utilizzando anticorpi coniugati al fluorocromo diretti contro le molecole di superficie degli eosinofili. In particolare, i ricercatori utilizzeranno anticorpi contro CD45, CD66, CD15, CD16 e Siglec-8, che verranno utilizzati per identificare gli eosinofili tra altri leucociti; CD63, CD294 (CRTH2, recettore della prostaglandina D2), CD125 (recettore IL-5), CD193 (recettore per diverse chemochine, come ad esempio RANTES, Eotaxin, MCP-3, MIP1α) e HLA-DR: queste molecole sono sovraregolate con attivazione degli eosinofili, quindi possono avere un'espressione alterata nei pazienti con asma grave. Dopo 30 minuti di incubazione a 4°C, verrà utilizzata la soluzione di lisi FACS (BD Bioscience) per rimuovere gli eritrociti, secondo le istruzioni del produttore. I campioni saranno risospesi in tampone fosfato salino (PBS) e acquisiti su un citometro a flusso LSRFortessa X-20 (BD Bioscience), dotato di quattro laser.