Análisis de citometría de flujo de eosinófilos en pacientes con asma grave.

A los sujetos que cumplan con los criterios de elegibilidad se les pedirá que participen en el estudio; todos recibirán una explicación detallada de la naturaleza del estudio, de los fines y objetivos. Tras haber firmado el consentimiento informado, los pacientes se dividirán en dos grupos, en función de su estado clínico: grupo de asma controlada (grupo A) y grupo de asma grave (grupo B). Las visitas se planificarán en el momento del reclutamiento, después de un período de adaptación (3 meses), con el objetivo de optimizar el tratamiento médico de primera y segunda línea y confirmar el diagnóstico de asma grave. Después del período de preinclusión, los pacientes serán reevaluados y se adaptará la terapia médica adecuada (T0). Al grupo B se le dará terapia con Mepolizumab u Omalizumab, según las guías estándar. En T0 se recogerá una muestra de sangre (3 ml) para evaluar el fenotipo de eosinófilos mediante citometría de flujo (ver más abajo). Después de 6 meses (T1/2) y 12 meses (T1), los pacientes serán visitados nuevamente y se tomará una muestra de sangre para el análisis de citometría de flujo. Todas las muestras se almacenarán y enviarán adecuadamente para su análisis, de acuerdo con las mejores prácticas y el estado de la técnica. criterios, dentro de las 6 horas desde la recolección de la muestra. Los datos se recopilarán y almacenarán de acuerdo con el RGPD (Reglamento General de Protección de Datos, UE 2016/679). El material biológico recogido se utilizará únicamente para el ensayo indicado y el material sobrante se desechará.

• Evaluación basal (T'0) En caso de aceptación, y previa firma del consentimiento informado, se solicitará a los participantes la realización de una historia clínica completa, incluyendo alergias y comorbilidades relacionadas con el Asma; un examen físico completo y pruebas de función respiratoria consistentes en: espirometría flujo-volumen más volumen residual y determinación de DLCO. En caso de un primer diagnóstico de asma, se obtendrá una respuesta broncodilatadora o una prueba de provocación con metacolina. En caso de diagnóstico preexistente de asma, se recogerá un examen previo que confirme y acredite el diagnóstico.
• Herramienta de Evaluación En T'0, T'1/2 (seis meses) y T'1 (doce meses) se recogerán los siguientes datos: Valoración clínica: ACT, terapia a demanda o de rescate, exacerbaciones agudas, visitas médicas, ausencias laborales , Admisiones de hospital. Valoración funcional: Curva flujo volumen, Volumen residual, Ig E y recuento de eosinófilos, FeNO, prueba de marcha de 6 minutos.
• Citometría de flujo Los investigadores evaluarán, mediante citometría de flujo multicolor, la expresión de moléculas en la membrana de los eosinófilos, utilizando un protocolo de tinción de sangre total, de modo que las muestras de sangre se manipulen al mínimo, reduciendo así la posibilidad de artefactos. Brevemente, las muestras de sangre periférica se procesarán dentro de las 6 horas posteriores a la extracción. Las muestras se almacenarán a temperatura ambiente hasta su procesamiento. Las muestras de sangre se tiñen utilizando anticuerpos conjugados con fluorocromos dirigidos hacia las moléculas de la superficie de los eosinófilos. En particular, los investigadores utilizarán anticuerpos contra CD45, CD66, CD15, CD16 y Siglec-8, que se utilizarán para identificar eosinófilos entre otros leucocitos; CD63, CD294 (CRTH2, receptor de prostaglandina D2), CD125 (receptor de IL-5), CD193 (receptor de varias quimiocinas, como por ejemplo RANTES, Eotaxin, MCP-3, MIP1α) y HLA-DR: estas moléculas están reguladas al alza con activación de eosinófilos, por lo que pueden tener una expresión alterada en pacientes con asma grave. Después de 30 minutos de incubación a 4 °C, se utilizará la solución de lisis FACS (BD Bioscience) para eliminar los eritrocitos, según las instrucciones del fabricante. Las muestras se resuspenderán en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se adquirirán en un citómetro de flujo LSRFortessa X-20 (BD Bioscience), equipado con cuatro láseres.