Analiza metodą cytometrii przepływowej eozynofili u pacjentów z ciężką astmą.

Uczestnik spełniający kryteria kwalifikacyjne zostanie poproszony o udział w badaniu; wszyscy otrzymają szczegółowe wyjaśnienie charakteru badania, celów i zadań. Po podpisaniu świadomej zgody pacjenci zostaną podzieleni na dwie grupy w zależności od ich stanu klinicznego: grupa z astmą kontrolowaną (grupa A) i grupa z astmą ciężką (grupa B). Wizyty planowane będą na etapie rekrutacji, po okresie przygotowawczym (3 miesiące), co ma na celu optymalizację leczenia pierwszego i drugiego rzutu oraz potwierdzenie rozpoznania ciężkiej astmy. Po okresie wstępnym pacjenci zostaną poddani ponownej ocenie i dostosowana zostanie odpowiednia terapia medyczna (T0). W grupie B zostanie zastosowana terapia mepolizumabem lub omalizumabem, zgodnie ze standardowymi wytycznymi. W T0 zostanie pobrana próbka krwi (3 ml) w celu oceny fenotypu eozynofili za pomocą cytometrii przepływowej (patrz poniżej). Po 6 miesiącach (T1/2) i 12 miesiącach (T1) pacjenci zostaną ponownie odwiedzeni i pobrana zostanie próbka krwi do analizy metodą cytometrii przepływowej. Wszystkie próbki będą odpowiednio przechowywane i wysłane do analizy, zgodnie z najlepszymi praktykami i stanem techniki kryteriów, w ciągu 6 godzin od pobrania próbki. Dane będą gromadzone i przechowywane zgodnie z RODO (ogólne rozporządzenie o ochronie danych, UE 2016/679). Pobrany materiał biologiczny zostanie wykorzystany wyłącznie do wskazanego testu, a nadmiar materiału zostanie usunięty.

• Ocena wyjściowa (T'0) W przypadku akceptacji i podpisania świadomej zgody, uczestnicy zostaną poproszeni o zebranie pełnej historii medycznej, w tym alergii i chorób współistniejących związanych z astmą; kompleksowe badanie przedmiotowe i testy czynnościowe układu oddechowego, na które składają się: spirometria przepływowo-objętościowa plus objętość zalegająca i oznaczenie DLCO. W przypadku pierwszego rozpoznania astmy uzyskana zostanie odpowiedź na lek rozszerzający oskrzela lub testy prowokacyjne z metacholiną. W przypadku wcześniejszego rozpoznania astmy zostaną zebrane wcześniejsze badania potwierdzające i potwierdzające rozpoznanie.
• Narzędzie oceny Następujące dane zostaną zebrane w T'0, T'1/2 (sześć miesięcy) i T'1 (dwanaście miesięcy): Ocena kliniczna: ACT, terapia na żądanie lub ratunkowa, ostre zaostrzenia, wizyty lekarskie, nieobecności w pracy , Przyjęcia szpitalne. Ocena czynnościowa: Krzywa objętości przepływu, Objętość zalegająca, Ig E i liczba eozynofili, FeNO, 6-minutowy test marszu.
• Cytometria przepływowa Badacze ocenią, za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej, ekspresję cząsteczek na błonie eozynofili, stosując protokół barwienia pełnej krwi, tak aby próbki krwi były minimalnie modyfikowane, zmniejszając w ten sposób możliwość wystąpienia artefaktów. W skrócie, próbki krwi obwodowej będą przetwarzane w ciągu 6 godzin od pobrania. Próbki będą przechowywane w temperaturze pokojowej do momentu przetworzenia. Próbki krwi zostaną wybarwione za pomocą przeciwciał skoniugowanych z fluorochromem skierowanych przeciwko cząsteczkom powierzchniowym eozynofili. W szczególności badacze wykorzystają przeciwciała przeciwko CD45, CD66, CD15, CD16 i Siglec-8, które posłużą do identyfikacji eozynofili między innymi leukocytami; CD63, CD294 (CRTH2, receptor prostaglandyny D2), CD125 (receptor IL-5), CD193 (receptor kilku chemokin, jak na przykład RANTES, Eotaksyna, MCP-3, MIP1α) i HLA-DR: te cząsteczki są regulowane w górę przez aktywacji eozynofili, więc mogą mieć zmienioną ekspresję u pacjentów z ciężką astmą. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 4°C do usunięcia erytrocytów zostanie użyty roztwór do lizy FACS (BD Bioscience), zgodnie z instrukcją producenta. Próbki zostaną ponownie zawieszone w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pobrane na cytometrze przepływowym LSRFortessa X-20 (BD Bioscience), wyposażonym w cztery lasery.