Análise por Citometria de Fluxo de Eosinófilos em Pacientes com Asma Grave.

O sujeito que satisfaça os critérios de elegibilidade será convidado a participar do estudo; todos receberão uma explicação detalhada da natureza do estudo, das metas e objetivos. Após assinatura do consentimento informado, os pacientes serão divididos em dois grupos, com base em seu estado clínico: grupo asma controlada (grupo A) e grupo asma grave (grupo B). As visitas serão planeadas no momento do recrutamento, após um período de rodagem (3 meses), com o objetivo de otimizar o tratamento médico de primeira e segunda linha e confirmar o diagnóstico de asma grave. Após o período de run-in, os pacientes serão reavaliados e a terapia médica apropriada será adaptada (T0). Para o grupo B, será administrada terapia com Mepolizumab ou Omalizumab, de acordo com as diretrizes padrão. Em T0 será coletada uma amostra de sangue (3ml) para avaliação do fenótipo dos eosinófilos por citometria de fluxo (ver abaixo). Após 6 meses (T1/2) e 12 meses (T1) os pacientes serão visitados novamente e uma amostra de sangue será coletada para análise de citometria de fluxo. Todas as amostras serão devidamente armazenadas e enviadas para análise, de acordo com as melhores práticas e estado da arte critérios, até 6 horas após a coleta da amostra. Os dados serão coletados e armazenados de acordo com o GDPR (Regulamento Geral de Proteção de Dados, EU 2016/679). O material biológico coletado será utilizado apenas para o ensaio indicado e o material excedente será descartado.

• Avaliação inicial (T'0) Em caso de aceitação, e após a assinatura de um consentimento informado, os participantes serão solicitados a coletar um histórico médico completo, incluindo alergias e comorbidades relacionadas à asma; um exame físico abrangente e testes de função respiratória que consistem em: espirometria fluxo-volume mais volume residual e determinação de DLCO. No caso de um primeiro diagnóstico de asma, será obtida uma resposta ao broncodilatador ou um teste de provocação com metacolina. No caso de diagnóstico preexistente de asma, será colhido exame prévio confirmando e comprovando o diagnóstico.
• Ferramenta de avaliação Os seguintes dados serão coletados em T'0, T'1/2 (seis meses) e T'1 (doze meses): Avaliação clínica: ACT, sob demanda ou terapia de resgate, exacerbações agudas, consultas médicas, faltas ao trabalho , internações hospitalares. Avaliação funcional: Curva fluxo volume, Volume residual, Ig E e contagem de eosinófilos, FeNO, teste de caminhada de 6 minutos.
• Citometria de fluxo Os pesquisadores avaliarão, por citometria de fluxo multicolorida, a expressão de moléculas na membrana de eosinófilos, utilizando um protocolo de coloração de sangue total, de modo que as amostras de sangue sejam minimamente manipuladas, reduzindo assim a possibilidade de artefatos. Resumidamente, as amostras de sangue periférico serão processadas dentro de 6 horas após a retirada. As amostras serão armazenadas em temperatura ambiente até o processamento. Amostras de sangue serão coradas, utilizando-se anticorpos conjugados de fluorocromo direcionados às moléculas de superfície dos eosinófilos. Em particular, os pesquisadores usarão anticorpos contra CD45, CD66, CD15, CD16 e Siglec-8, que serão usados ​​para identificar eosinófilos entre outros leucócitos; CD63, CD294 (CRTH2, receptor de prostaglandina D2), CD125 (receptor de IL-5), CD193 (receptor para várias quimiocinas, como por exemplo RANTES, Eotaxina, MCP-3, MIP1α) e HLA-DR: essas moléculas são reguladas positivamente com ativação dos eosinófilos, podendo ter uma expressão alterada em pacientes com asma grave. Após 30 minutos de incubação a 4°C, a solução de lise FACS (BD Bioscience) será utilizada para remover os eritrócitos, de acordo com as instruções do fabricante. As amostras serão ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adquiridas em citômetro de fluxo LSRFortessa X-20 (BD Bioscience), equipado com quatro lasers.