Проточная цитометрия Анализ эозинофилов у пациентов с тяжелой астмой.

Субъекту, удовлетворяющему критериям приемлемости, будет предложено принять участие в исследовании; все получат подробное объяснение характера исследования, целей и задач. После подписания информированного согласия пациенты будут разделены на две группы в зависимости от их клинического состояния: группа с контролируемой астмой (группа А) и группа с тяжелой астмой (группа В). Визиты будут планироваться при приеме на работу после вводного периода (3 месяца) с целью оптимизации лечения первой и второй линии и подтверждения диагноза тяжелой астмы. После вводного периода пациенты будут повторно обследованы, и будет подобрана соответствующая медикаментозная терапия (T0). Группе В будет назначена терапия меполизумабом или омализумабом в соответствии со стандартными рекомендациями. В момент T0 будет взят образец крови (3 мл) для оценки фенотипа эозинофилов с помощью проточной цитометрии (см. ниже). Через 6 месяцев (T1/2) и 12 месяцев (T1) пациентов снова посетят и возьмут образец крови для анализа методом проточной цитометрии. Все образцы будут надлежащим образом храниться и отправляться для анализа в соответствии с передовой практикой и современным уровнем техники. критерии, в течение 6 часов после сбора образца. Данные будут собираться и храниться в соответствии с GDPR (Общее положение о защите данных, ЕС 2016/679). Собранный биологический материал будет использоваться только для указанного анализа, а излишки материала будут удалены.

• Исходная оценка (T'0) В случае принятия и после подписания информированного согласия участников попросят собрать полную историю болезни, включая аллергии и сопутствующие заболевания, связанные с астмой; всестороннее медицинское обследование и тесты функции дыхания, состоящие из: спирометрии потока и объема, а также остаточного объема и определения DLCO. В случае первого диагноза астмы будет получен ответ на бронхорасширяющее средство или тесты на провокацию метахолином. В случае ранее существовавшего диагноза астмы будут собраны данные предыдущего обследования, подтверждающие и подтверждающие диагноз.
• Инструмент оценки Следующие данные будут собраны в T'0, T'1/2 (шесть месяцев) и T'1 (двенадцать месяцев): Клиническая оценка: ACT, терапия по требованию или неотложная терапия, обострения, визиты к врачу, отсутствие на работе , госпитализация. Функциональная оценка: кривая объемного кровотока, остаточный объем, количество Ig E и эозинофилов, FeNO, тест 6-минутной ходьбы.
• Проточная цитометрия С помощью многоцветной проточной цитометрии исследователи будут оценивать экспрессию молекул на мембране эозинофилов, используя протокол окрашивания цельной крови, так что манипуляции с образцами крови будут минимальными, что снизит вероятность появления артефактов. Вкратце, образцы периферической крови будут обработаны в течение 6 часов после забора. Образцы будут храниться при комнатной температуре до обработки. Образцы крови будут окрашиваться с использованием конъюгатов флуорохромных антител, направленных на поверхностные молекулы эозинофилов. В частности, исследователи будут использовать антитела против CD45, CD66, CD15, CD16 и Siglec-8, которые будут использоваться для выявления эозинофилов среди других лейкоцитов; CD63, CD294 (CRTH2, рецептор простагландина D2), CD125 (рецептор IL-5), CD193 (рецептор для нескольких хемокинов, таких как, например, RANTES, эотаксин, MCP-3, MIP1α) и HLA-DR: эти молекулы активируются с помощью активация эозинофилов, поэтому они могут иметь измененную экспрессию у больных тяжелой астмой. После 30-минутной инкубации при 4°C лизирующий раствор FACS (BD Bioscience) будет использоваться для удаления эритроцитов в соответствии с инструкцией производителя. Образцы будут ресуспендированы в фосфатно-солевом буфере (PBS) и получены на проточном цитометре LSRFortessa X-20 (BD Bioscience), оснащенном четырьмя лазерами.