Flowcytometrianalyse af eosinofiler hos patienter med svær astma.

Emne, der opfylder berettigelseskriterier, vil blive bedt om at deltage i undersøgelsen; alle vil modtage en detaljeret forklaring af undersøgelsens karakter, af målene og formålene. Efter at have underskrevet informeret samtykke vil patienter blive opdelt i to grupper baseret på deres kliniske status: kontrolleret astmagruppe (gruppe A) og svær astmagruppe (gruppe B). Besøg vil blive planlagt ved rekruttering, efter en indkøringsperiode (3 måneder), beregnet til at optimere første og anden linje medicinsk behandling og bekræfte diagnosen svær astma. Efter indkøringsperioden vil patienterne blive revurderet, og passende medicinsk behandling vil blive skræddersyet (T0). Til gruppe B vil behandling med Mepolizumab eller Omalizumab blive givet i henhold til standardretningslinjer. Ved T0 vil der blive udtaget en blodprøve (3 ml) for at evaluere eosinofilers fænotype ved flowcytometri (se nedenfor). Efter 6 måneder (T1/2) og 12 måneder (T1) vil patienterne blive besøgt igen, og der vil blive taget en blodprøve til flowcytometrianalyse. Alle prøver vil blive korrekt opbevaret og sendt til analyse i henhold til bedste praksis og state of art kriterier inden for 6 timer fra prøvens indsamling. Data vil blive indsamlet og opbevaret i henhold til GDPR (General Data Protection Regulation, EU 2016/679). Opsamlet biologisk materiale vil kun blive brugt til det angivne assay, og overskydende materiale vil blive udledt.

• Baseline-evaluering (T'0) I tilfælde af accept, og efter at have underskrevet et informeret samtykke, vil deltagerne blive bedt om at indsamle en komplet sygehistorie, inklusive allergier og astma-relaterede følgesygdomme; en omfattende fysisk undersøgelse og respiratoriske funktionstest bestående af: flow-volumen spirometri plus restvolumen og DLCO-bestemmelse. I tilfælde af en første diagnose af astma vil der blive opnået en bronkodilatator-respons eller en metacholin-provokationstest. I tilfælde af en allerede eksisterende diagnose af astma, vil tidligere undersøgelse, der bekræfter og beviser diagnosen, blive indsamlet.
• Evalueringsværktøj Følgende data vil blive indsamlet ved T'0, T'1/2 (seks måneder) og T'1 (tolv måneder): Klinisk vurdering: ACT, on demand eller redningsterapi, akutte eksacerbationer, lægebesøg, arbejdsfravær , hospitalsindlæggelser. Funktionel vurdering: Flowvolumen kurve, Residualvolumen, Ig E og eosinofilers antal, FeNO, 6 minutters gangtest.
• Flowcytometri Efterforskerne vil evaluere ekspressionen af ​​molekyler på eosinofilers membran ved hjælp af en helblodsfarvningsprotokol, således at blodprøver vil blive minimalt manipuleret, hvilket reducerer muligheden for artefakter. Kort fortalt vil perifere blodprøver blive behandlet inden for 6 timer efter tilbagetrækning. Prøver vil blive opbevaret ved stuetemperatur indtil behandling. Blodprøver vil blive farvet ved hjælp af fluorokrom-konjugatantistoffer rettet mod eosinofilers overflademolekyler. Især vil efterforskerne bruge antistoffer mod CD45, CD66, CD15, CD16 og Siglec-8, som vil blive brugt til at identificere eosinofiler mellem andre leukocytter; CD63, CD294 (CRTH2, prostaglandin D2-receptor), CD125 (IL-5-receptor), CD193 (receptor for flere kemokiner, som for eksempel RANTES, Eotaxin, MCP-3, MIP1α) og HLA-DR: disse molekyler er opreguleret med eosinofile aktivering, så de kan få et ændret udtryk hos svære astmapatienter. Efter 30 minutters inkubation ved 4°C vil FACS lyseringsopløsning (BD Bioscience) blive brugt til at fjerne erytrocytter i henhold til producentens anvisninger. Prøver vil blive resuspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS) og erhvervet på et LSRFortessa X-20 (BD Bioscience) flowcytometer, udstyret med fire lasere.