Seskupení imunitní modulace s kryoablací (LOGIC) pro rakovinu prsu (LOGIC)

CÍLE:

Hlavním cílem navrhované studie je posoudit synergii kryoablace nádoru a inhibitoru imunitního kontrolního bodu u vysoce rizikového karcinomu prsu u lidí. Toho bude dosaženo srovnáním samotné kryoablace a kryoablace v kombinaci s pembrolizumabem – [checkpoint inhibitorem (anti PD-1/PD-L1 protilátka) v současnosti schváleným FDA jako terapie rakoviny] se současným standardem péče včetně chirurgické resekce. Současný standard neoadjuvantní/adjuvantní terapie zůstane nezměněn z etických důvodů poskytování nejlepšího standardu péče všem pacientům.

CÍLE:

Navrhujeme prospektivní randomizovanou explorativní studii, kde budou pacientky s klinickým stadiem I/II, triple negativním invazivním karcinomem prsu randomizovány do jedné ze tří větví studie:

1. Standardní péče – neoadjuvantní terapie s následnou chirurgickou resekcí s následnou vhodnou adjuvantní terapií dle potřeby.
2. Rameno kryoablace – kryoablace s následnou vhodnou neoadjuvantní terapií s následnou chirurgickou resekcí s následnou vhodnou adjuvantní terapií podle potřeby.

3. Kryoablace s pembrolizumabem - Jednorázová dávka 200 mg pembrolizumabu před (během 24-48 hodin) kryoablací následovaná vhodnou neoadjuvantní terapií následovanou chirurgickou resekcí následovanou vhodnou adjuvantní terapií podle potřeby.

   Výsledná opatření budou zahrnovat krevní a nádorovou analýzu imunitní odpovědi s průtokovou cytometrií a analýzou cytokinů na začátku, po intervenci a před operací. Tkáň ze základní biopsie na začátku, opakování biopsie před chemoterapií a resekce tumoru bude také analyzována na mikroprostředí tumoru.

   ÚVOD / POZADÍ / VÝZNAM:

   Vysoce rizikový karcinom prsu a potřeba novějších léčebných přístupů: Triple-negativní karcinom prsu, který představuje 15-20 % všech diagnóz karcinomu prsu, je považován za vysoce rizikový. Zatímco chirurgická resekce zůstává základem léčby, terapeutická páteř zahrnuje neoadjuvantní a adjuvantní chemoterapii. U pacientů, kteří mají i po chirurgické resekci a dokončení chemoterapie nadále významnou reziduální chorobu, se provádějí další agresivní systémové terapie, jako je kapecitabin. Triple-negativní podtyp je spojen s nejvyšším počtem mutací napříč genomem a nemetastatické onemocnění je spojeno s 17–20 % lokálním selháním a 35–40 % vzdáleným selháním po 5–10 letech sledování. Tyto údaje naznačují, že mikrometastatické hematogenní šíření se děje u značného počtu pacientů s operabilním vysoce rizikovým karcinomem prsu a jsou vyžadovány novější přístupy, které zesilují lokální kontrolu a současně kontrolují systémové šíření onemocnění.

   Rozsah imunitní modulace: Imunoterapie rakoviny zaznamenala v posledních desetiletích mimořádný úspěch. Antigeny, které mohou vyvolat protinádorové imunitní reakce, tvoří vhodný imunoterapeutický cíl. Přístup terapií blokádou kontrolních bodů T buněk ukázal pozoruhodné klinické odezvy u několika typů solidních rakovin, jako je melanom, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom močového měchýře a karcinomy s nedostatkem opravy chybného párování. Předpokládá se, že účinná protinádorová imunitní odpověď je zahájena vychytáváním nádorových antigenů buňkami prezentujícími antigen (APC), které je následně prezentují a poskytují kostimulační signály jak CD4+, tak CD8+ T buňkám. APC, zejména dendritické buňky, zpracovávají antigeny cestou zpracování exogenního antigenu, kde je materiál nádorových buněk fagocytován a přeměněn na vazebné peptidy HLA třídy I a třídy II, které jsou prezentovány CD8+ (křížová prezentace) a CD4+ T buňkám, v daném pořadí. S využitím těchto poznatků nedávné studie fáze 1 zaznamenaly zvýšenou odpověď na léčbu inhibitorem imunitního kontrolního bodu v kombinaci s konvenční chemoterapií u triple-negativních karcinomů prsu. Procento tumor infiltrujících lymfocytů (TIL) bylo jistě identifikováno jako důležitý imunologický parametr, zejména u vysoce rizikových karcinomů prsu, který koreluje s odpovědí na systémovou léčbu, což naznačuje silnou roli hostitelské imunitní odpovědi v kontrole rakoviny bez ohledu na terapeutickou intervenci. .

   Omezení imunitní modulace – T buňky jsou klíčovými hráči v protinádorové imunitě, a proto tvoří hlavní cíl imunoterapeutického výzkumu. Současný průlom v imunoterapii rakoviny je výsledkem identifikace a cílení mechanismu kontrolních bodů zahrnujících CTLA-4, PD-1 a PD-L1. CTLA-4 a PD-1 jsou koinhibiční receptory nacházející se na povrchu T buněk. Po navázání na jejich odpovídající ligandy (CD 80/86, resp. PD-L1/L2) se T buňky stávají anergickými - fyziologický mechanismus tolerance. V kontextu nádorového mikroprostředí může aberantní exprese spolu s chronickou expozicí nádorovým antigenům vést k nežádoucímu potlačení imunity T buněk.

   Nedávno vyvinuté blokátory kontrolních bodů, jako je inhibitor PD-1/PD-L1, pembrolizumab, poskytují novou zbraň proti rakovině s trvalou klinickou odpovědí a dlouhodobými remisemi. Ukázalo se však, že blokáda kontrolních bodů je nejúčinnější u nádorů s vysokou mutační zátěží, v souladu s představou, že rozpoznávání neoantigenů T buňkami hraje hlavní roli v blokádě kontrolních bodů. Mnoho studií ukazuje, že když infiltrát T lymfocytů reagujících na nádor chybí nebo je nízký (nízké procento TIL), chybí substrát pro blokádu kontrolních bodů. Navíc většina pacientů s takzvanými hypermutovanými nádory nereaguje na blokádu kontrolních bodů v důsledku imunitní úpravy, což ohrožuje schopnost T buněk plnit svou cytotoxickou aktivitu adekvátní nádorové infiltrace a rozpoznání třídy HLA s nádorovým antigenem. I molekuly. Pro účinnou blokádu kontrolních bodů je proto nezbytné zvýšení prezentace antigenu v nádoru.

   Role ablativních terapií – zejména kryoablace: Tepelná ablace s kryoterapií, laserem, radiofrekvenčním, mikrovlnným a fokusovaným ultrazvukem představuje jedinečnou příležitost k řešení jak primárního nádoru, tak mikrometastatického onemocnění. Účinky ablace nádoru jsou mnohostranné: (1) destrukce nádorové hmoty, snížení nádorové zátěže a (2) uvolnění nádorových antigenů, jejich zpřístupnění pro příjem antigen prezentujícími buňkami (APC) a samotná léčba vede k (3 ) uvolnění molekulárních vzorů spojených s poškozením (DAMP) a (4) indukce fyziologické reakce hojení ran. Ablace vede k vytvoření in situ antigenního depotu obsahujícího všechny typy nádorových proteinů, což vede k iniciaci systémové protinádorové imunitní odpovědi, která může potenciálně eliminovat okultní metastatické onemocnění. Ablace nádorů při teplotách nad 65 °C vede k denaturaci proteinů. To může ovlivnit imunitní reakce opačným způsobem, protože vysoké teploty denaturují imunitní aktivační signály, jako jsou nebezpečné signály, jako jsou proteiny tepelného šoku (HSP). Proto je kryoablace nejslibnější ablační technikou, protože nabízí minimální invazivitu, menší poškození okolních tkání a lepší uchování nádorových antigenů a nejvíce robustní údaje o imunitní stimulaci.

   Imunitní stimulace vyvolaná kryoablací - Hluboké zmrazení a rozmrazování během kryoablace indukuje nekrózu a up-regulaci molekul DAMP, které činí nádorové buňky náchylnějšími k APC a zabíjení zprostředkované nádorovými T-buňkami. Kryoablace upreguluje DAMP, jako je HMG1, calreticulin, S100A8/A9 a HSP70, které stimulují imunitní systém prostřednictvím receptorů pro pokročilou glykosylaci konečných produktů (RAGE) a toll-like receptorů a zvyšují prezentaci antigenu. Kromě toho je cytokinovým prostředím centrální zóny, které je výsledkem kryoablace, typicky Th1 cytokinový profil IL-2, INF-γ, TNF-α a IL-12.28. Tyto cytokiny a DAMP pravděpodobně řídí cytotoxickou odpověď CD8+ T-buněk. Předklinické důkazy podporující imunitní odpověď na kryoablace: Několik preklinických studií kryoimunologie zkoumalo, zda zmrazení nádoru a jeho ponechání in situ zajistí odolnost zvířete vůči opětovné expozici. Zvířecí modely využívající buněčné linie karcinomu a sarkomu u králíků a myší prokázaly nádorově specifickou rezistenci vůči opětovné expozici. Opětovné vystavení stejným nádorovým buněčným liniím vykazovalo odolnost vůči růstu u zvířat po kryoablaci ve srovnání s chirurgickou resekcí. Podobné zkušenosti uvedli Blackwood a Cooper s modely zahrnujícími krysy inokulované buněčnými liniemi myosarkomu a karcinosarkomu. Krysy s kryoablovanými nádory s větší pravděpodobností odolávaly opětovné expozici a prokázaly regresi sekundárních nádorů ve srovnání s chirurgicky ošetřenými krysami. Bagley a kol. porovnali kryoablace s chirurgickým zákrokem při použití fibrosarkomu MCA-10 u myší C57BL/6, přičemž slezinné lymfocyty byly odebírány v týdenních intervalech po léčbě pro testy cytotoxicity. Myši podstupující kryoablace měly významně vyšší cytotoxicitu než chirurgicky léčené nebo neléčené myši. Sabel a kol. studovali nádory adenokarcinomu mléčné žlázy MT-901 u myší BALB/c léčených kryoablací nebo chirurgickou resekcí. Po opětovné expozici se u 86 % myší léčených chirurgicky vyvinuly druhé nádory ve srovnání s 16 % myší léčených kryoablací. To bylo nádorově specifické, protože kryoablace nenabízela žádnou ochranu proti napadení jinými buněčnými liniemi. Nedávno Kim et al. při použití buněčných linií karcinomu ledviny u BALB/c myší byly hlášeny podobné výsledky. V poslední době byl jako výsledek systémové imunitní odpovědi popsán abskopální účinek regrese nádoru u neléčených nádorů na zvířecích modelech, kde byl pouze jeden z implantovaných nádorů kryoablatován.

   Klinické důkazy podporující imunitní odpověď kryoablace: Ačkoli se klinické použití kryoablace u rakoviny v poslední době rozšířilo, existuje relativně málo studií zkoumajících imunologický dopad u lidí. Ravindranath a kol. měřili hladinu sérových nádorových gangliosidů a jejich titry protilátek u pacientů, kteří dostávali kryoablaci, radiofrekvenční ablaci nebo resekci jaterních metastáz z kolorektálního karcinomu. Hladiny gangliosidů v séru byly významně vyšší u pacientů s kryoablací ve srovnání s radiofrekvencí nebo chirurgickým zákrokem. Kryoablovaní pacienti také vykazovali vyšší titry IgM proti nádorovým gangliosidům. Si a kol. studovali 20 pacientů s rakovinou prostaty podstupujících kryoablaci primárního nádoru a zaznamenali zvýšení cytolytické aktivity proti LNCaP a zvýšení počtu T buněk produkujících IFN-ɣ. Thakur a kol. provedli pilotní studii kryoablace a GM-SCF u pacientů s renálním karcinomem metastatickým do plic. GM-CSF byl infiltrován v blízkosti plicní metastatické léze vybrané pro kryoablace. Po zákroku byla použita další terapie GM-CSF. Kombinace GM-CSF a kryoablace vyvolala zesílenou imunitní odpověď ve smyslu cytotoxicity a sérových protilátek.

   Omezení kryoablace: Navzdory výše uvedeným údajům nebyla imunitní odpověď na kryoablaci jednotná. Některé předklinické studie na modelech osteogenního sarkomu a rakoviny prostaty neprokázaly žádné zvýšení imunitní funkce po kryoablaci. Ještě důležitější je, že několik studií uvádí potlačení imunity pomocí kryochirurgie. Většina těchto studií zahrnovala buněčné linie fibrosarkomu u potkanů ​​a vykazovala sníženou odolnost vůči opětovné expozici po kryoablaci, stejně jako zvýšený růst metastatických nádorů a sekundárních nádorů. Z hlediska rakoviny prsu Sabel et al. uvedli, že vysoká míra zmrazení vedla ke zvýšení nádorově specifických T-buněk v lymfatických uzlinách odvádějících nádor, snížení plicních metastáz a zlepšení přežití ve srovnání s nízkou rychlostí zmrazení, která měla také více Tregs (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Proto se velikost systémového účinku vyvolaného samotnou kryoterapií ukázala být buď nedostatečná, nebo kontraproduktivní. Současné chápání je, že v blízkosti ablativního zdroje přímé poškození a buněčná smrt s nekrózou uvolňuje nádorové antigeny a (DAMP), které získávají a aktivují dendritické buňky, které zase stimulují proliferaci T buněk a imunitních složek. Přechodová zóna od ablativního zdroje způsobuje nepřímé buněčné poškození a apoptotickou buněčnou smrt bez uvolnění DAMP, což způsobuje uvolnění supresivních cytokinů a klonální deleci T-buněk a anergii. Intuitivně kryoablace stimuluje imunitní odpověď, ale konečný klinický dopad je dán poměrem CD4+ T-efektorových buněk k T-regulačním buňkám. Vyšší poměr T-efektoru k T-regulačním buňkám podporuje příznivější odpověď CD8 cytotoxických T buněk. Zatímco CD8+ cytotoxické buňky eliminují primární nádor a systémové mikrometastázy, je důležité, aby byla anergie udržována pod kontrolou a jak efektorové (CD45RO+, CCR7-) tak centrální (CCR7+, CD45RO+) paměťové T-buňky byly vytvořeny pro dlouhodobou ochrannou anti- nádorová imunita.

   HYPOTÉZA:

   „Kombinace kryoablace s Pembrolizumabem pro lokální kontrolu u vysoce rizikového triple negativního karcinomu prsu je lepší než samotná chirurgická resekce nebo samotná kryoablace při vytváření protinádorové imunitní odpovědi“.

   METODY:

   Místo studia:

   Navrhovaná průzkumná práce je randomizovaná studie, která bude provedena v Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center.

   Typ studia:

   Prospektivní randomizovaná studie - řízená hypotézou

   Experimentální design:

   Navrhujeme jednu zaslepenou prospektivní randomizovanou studii, kde budou ženy s trojitě negativním karcinomem prsu stadia I/II zařazeny do jednoho ze tří ramen randomizovaným způsobem 1:1:1: (I) Kontrolní rameno s neoadjuvantní chemoterapií s následnou lumpektomií/ mastektomie s biopsií sentinelové uzliny +/- disekce axily; (II) Intervence samotnou kryoablací s následnou neoadjuvantní chemoterapií s následnou lumpektomií/mastektomií s biopsií sentinelové uzliny +/- axilární disekce; (III) Intervence kryoablace + Pembrolizumab s následnou neoadjuvantní chemoterapií s následnou lumpektomií/mastektomií s biopsií sentinelové uzliny +/- disekce axily. Plán léčby je navržen tak, aby optimalizoval dobu expozice antigenu [obrázek 2]. Po získání souhlasu IRB bude studie registrována v síti National Clinical Trials Network.

   Předměty:

   Účast bude nabídnuta všem pacientům ve věku 18 let a starším s klinickým stadiem I/II triple negativním onemocněním. Tito pacienti budou vyšetřeni studijním týmem během schůzky na onkologii/chirurgickém zákroku. Počítačový randomizační seznam bude použit pro přiřazení léčebných ramen pomocí webové stránky:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Kritéria pro zařazení:

   • Ženy
   • Rakovina stadia I/II
   • Věkové rozmezí 18 - 89 let
   • Diagnózy: Invazivní karcinom, ER -, PR-, HER2- (triple negativní)
   • Radiologický nález: Unifokální onemocnění viditelné na ultrazvuku

   Kritéria vyloučení:

   • Další primární rakovina
   • Zánětlivá rakovina prsu
   • Autoimunitní onemocnění v anamnéze
   • Chronická imunosuprese v anamnéze
   • Předchozí imunoterapie
   • Nedávné očkování (do 4 týdnů)
   • Předchozí radiační terapie
   • Předchozí terapie zkoumanými látkami během posledního 1 roku
   • Těhotenství v době diagnózy a/nebo léčby
   • Kojení

   Studijní pobyty:

   Bude získán informovaný souhlas a poté bude pacient randomizován. Všechny návštěvy se budou shodovat s návštěvami standardní péče. Dále dojde k následujícímu:

   Návštěva 1: Den 1:

   Základní odběr krve; do zkumavek s EDTA bude odebráno až 20 ml; krev bude centrifugována na TTUHSC. Plazma bude použita pro analýzu cytokinů a fenotypizaci v laboratoři TTU. Jedna zkumavka s EDTA bude zaslána na University of Houston (v průběhu časových bodů studie). Budou měřeny následující výsledky:

   Analýza cytokinů

   • RNA seq Analýza PBMC Základní tkáň základní biopsie (již dostupná z diagnostického zpracování) bude hodnocena pro: (budou připravena 2 neobarvená sklíčka pro RNA seq z fixované tkáně)
   • DIL %
   • Nádorová tkáň RNA Seq

   Návštěva 2 (pouze skupina II a III) po kryoablace: 3. den (+/- 7 dní):

   Poablační odběr krve (skupina II a III) – až 10 ml krve v EDTA zkumavce:

   • Analýza cytokinů

   Návštěva 3 (všechny skupiny) Pre neoadjuvantní chemoterapie: Den 21 (+/- 14 dní):

   Odběr krve v době zavedení portu pro chemoterapii – až 20 ml krve ve zkumavkách s EDTA:

   • Imunitní fenotypizace průtokovou cytometrií
   • Analýza cytokinů
   • Analýza RNA seq PBMC
   • Nádorová biopsie bude opakována pro analýzu TIL a RNA seq

   Návštěva 4 (všechny skupiny): Po chemoterapeutické resekci (přibližně 6 měsíců po původní biopsii):

   Předoperační odběr krve do 20 ml krve do zkumavek s EDTA (podobně jako výchozí):

   • Imunitní fenotypizace průtokovou cytometrií
   • Analýza cytokinů
   • RNA seq Analýza PBMC Chirurgická tkáňová analýza (pro RNA seq budou připravena 2 neobarvená sklíčka z fixovaných tkání)
   • TIL %
   • RNA seq nádorové tkáně

   Velikost vzorku:

   Tumor-infiltrující lymfocyty (TIL), zejména ve stromatu triple negativního karcinomu prsu, jsou prognostické a prediktivní pro odpověď na terapii. Proto byla pro výpočet velikosti vzorku pro tento projekt použita doporučení Mezinárodní pracovní skupiny TILs. Procentuální změna TIL se předpokládá 10 % pro kontrolní rameno a 50 % pro léčebné rameno. Vzorek 10 pacientů na skupinu může dosáhnout 80% síly k detekci středního rozdílu 0,4 (0,5 vs. 0,1) se směrodatnou odchylkou 0,3 pomocí dvoustranného dvouvýběrového t-testu se stejnou variací (alfa=0,05) . Za předpokladu 30% míry předčasného ukončení léčby by celkem 12 pacientů v každé větvi stačilo na celkový počet 36 pacientů; tím by se dosáhlo 90% výkonu. To znamená, že minimálně 10 pacientů na rameno a maximálně 12 pacientů na rameno povede ke statisticky významné studii.

   Statistický plán:

   Popisná statistika bude použita k výpočtu rozsahů, průměrů a rozptylů pro nezávislé proměnné standardní péče, kryo, kryo+pembro. To naznačuje, že koncentrace pozorování kolem průměru a odchylka pozorování od průměru. Test normality bude zvažován, aby se ověřilo, zda data odpovídají normálnímu rozdělení. Normální kvantil-kvantilové grafy (také nazývané q-q grafy) budou použity k určení, zda soubory dat pocházejí z normální populace. Pro detekci odlehlých hodnot (pokud nějaké existují) bude vzato v úvahu několik statistických měření. Pro kontrolu homogenity rozptylů pro nezávislé proměnné standardní péče, kryo, kryo+pembro, bude proveden Leveneův test stanovením nulových a alternativních hypotéz. Pro porovnání rozdílu významnosti mezi průměry proměnných bude provedena jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA). Budou představeny nulové a alternativní hypotézy pro prostředky. V ANOVA bude testována statistická významnost průměrů (α = 0,05) pomocí statistiky F-testu. Pokud je zjištěn statisticky významný rozdíl průměrů, budou provedeny post-hoc vícenásobné srovnávací testy. Post-hoc vícenásobné srovnávací testy (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey, atd.) budou použity k detekci vhodných významných skupinových průměrů. Pokud vzorky nesplňují předpoklady normality, bude pro statistické analýzy uvažováno několik neparametrických testů.

   Kryoablace nádoru:

   Všichni registrovaní pacienti budou randomizováni do jednoho ze tří ramen studie. Pacienti v rameni II a III dostanou kryoablace podle následujícího protokolu (podobného protokolu použitému ve studii ACOSOG Z1072).

   Kryoablační zařízení: Kryoablace bude prováděna pomocí komerčně dostupného kryochirurgického systému ProSense (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Izrael) skládajícího se z konzoly, kryosondy a souvisejícího případu Dewars s kapalným dusíkem (kryogen). Konzole je samostatná jednotka s rozhraním pro ovládání a monitorování kryoablace. Pracuje se standardním napájením 120 VAC (60Hz).

   Provoz zařízení: Kryochirurgický systém ProSense využívá uzavřený systém k cirkulaci kapalného dusíku uvnitř hrotu kryosondy a vytváří teploty pod bodem mrazu, které vedou k ablaci cílové tkáně. Léze je identifikována ultrazvukem a kryosonda je umístěna do středu léze pod ultrazvukovým vedením po adekvátní lokální anestezii a ablace je provedena podle předem stanoveného algoritmu zmrazení-rozmrazení-zmrazení. Sonda se poté ohřeje vnitřním elektrickým odporovým ohřívačem a vyjme se z pacienta. Postup kryoablace: Nádor je identifikován pomocí lineární ultrazvukové sondy s vysokým rozlišením ve dvou ortogonálních pohledech. Pro paralelní zavedení sondy je identifikován nejdelší rozměr nádoru. Tento rozměr se zadává do konzoly; konzola poskytuje délku hrotu kryosondy, aby byla po vložení za lézí. Po vložení je poloha sondy potvrzena ve dvou ortogonálních pohledech. Kryoablace se provádí pomocí cyklu zmrazení-rozmrazení-zmrazení podle velikosti nádoru. Celá procedura je monitorována pod dohledem a fyziologický roztok je infiltrován, aby se zabránilo omrzlinám kůže hydrodisekcí kůže pryč z ledové koule. Velikost ledové koule se zaznamenává v ortogonálních rozměrech. V našem protokolu, pokud má pacient více než jednu lézi, bude odstraněna pouze jedna léze; avšak biopsie z jiných lézí budou studovány na abskopální účinek.

   Infuze pembrolizumabu a dávkování:

   Jako počáteční krok jsme potvrdili bezpečnost a snášenlivost inhibitorů imunitního kontrolního bodu s nádorovou kryoablací u žen s nově diagnostikovaným karcinomem prsu. Jedním z důležitých aspektů byl výběr protilátky modulující imunitu. Pembrolizumab, protilátka proti PD-1/PD-L1 schválená FDA, má dobře zavedený bezpečnostní profil a navozuje dlouhodobé remise trvající > 10 let u 10–20 % pacientů s pokročilým melanomem.50 Kromě toho, protože T buňky akutně upregulují expresi PD-1/PD-L1 poté, co byly vystaveny antigenům,51 což zase může otupit cytotoxickou odpověď, je pembrolizumab ideálně vhodný pro imunitní modulaci v kombinaci s kryoablací. Centrum pro rakovinu Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) publikovalo pilotní studii o této kombinaci; nebyly hlášeny žádné závažné nežádoucí účinky připisované ipilimumabu; žádná operace se nezdržela. MSKCC použil 10 mg/kg jako jednu dávku; nicméně, protože studie uvádějí vyšší nežádoucí účinky při této dávce, navrhujeme doporučenou dávku 200 mg pro IV po dobu 90 minut před kryoablací, což je v současnosti používaná dávka v klinickém prostředí pro trojnásobně negativní rakoviny.

   Metodika pro výstupní opatření:

   Budeme pozorovat a monitorovat imunitní odpověď (reakce) po kryoablace s pembrolizumabem a bez něj. Vzorky krve budou odebírány do zkumavek pro odběr krve s EDTA a poté rozděleny na alikvoty pro fenotypovou analýzu T-buněk a odběr plazmy pro cytokin/chemokin a pro analýzu RNA seq v uvedených časových bodech. Pro výzkum budou vyrobeny patologické preparáty ze vzorků základní biopsie na počátku az lumpektomie a sentinelových uzlin v době operace. Pro každý vzorek (po dokončení rutinní patologie) bude vyrobeno pět sklíček pro H&E a imunohistochemii pro infiltráty imunitních buněk pro výpočet procenta TIL. Všichni spolupracovníci/klíčoví pracovníci zapojení do provádění analýzy výsledků měření budou zaslepeni vůči randomizačním skupinám.

   Níže jsou uvedeny podrobnosti pro analýzu výsledku:

   Výpočet TIL: Všechny tkáňové vzorky, které podstoupí rutinní hlášení patologie, budou vyhodnoceny pro hlášení TIL podle pokynů vydaných Mezinárodní pracovní skupinou pro TIL. Změna skóre TIL mezi původní tkání z biopsie jádra a chirurgickou tkání bude předmětem analýzy pro posouzení dopadu navrhovaných intervencí.

   Měření změn T-buněk v krvi: Subtypy T-buněk lze definovat diferenciální expresí markerů buněčného povrchu. Budeme sledovat aktivaci T-buněk, zvýšené CD8+ efektorové T-buňky a vývoj efektorové a centrální paměti. Pro fenotypizaci T-buněk bude provedeno barvení plné krve (100 µl/barvení) protilátkami proti CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 a Ki67 s vhodnými izotypovými kontrolami.55 Po lýze RBC se obarvené mononukleární buňky zpracují na 14barevném průtokovém cytometru Attune NxT (Thermofisher, Waltham, MA) a analyzují se pomocí softwaru FlowJo (Becton, Dickinson and Company). T-buňky (CD3+, CD4+ nebo CD8+) budou analyzovány na změny v naivní (CD27+, CCR7+, CD45RO-), efektorové (CCR7-, CD45RO-), efektorové paměti (CD27-, CCR7-, CD45RO+) a centrální paměti ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) fenotypové markery a také pro aktivaci (ICOS a CD137) a proliferaci (Ki67). Dále budeme analyzovat procenta T-regulačních buněk (CD25+, CD127-). Tato data použijeme ke stanovení imunitního podpisu T-buněk ke korelaci účinnosti kryoabalace+/- pembrolizumabu k predikci dlouhodobé protinádorové imunity.

   Analýza plazmatických cytokinů/chemokinů: Naší počáteční analýzou bude určit, které cytokiny/chemokiny a jaké koncentrace jsou detekovány v krvi po kryoablaci +/- pembrolizumabu a jak se mění jejich profily. Zaměříme se na profily zánětlivých a pomocných T lymfocytů a na to, jak tyto cytokiny ovlivňují a řídí odpověď T lymfocytů. Dále se podíváme na změny v chemokinech. Ukázalo se, že jejich změněná exprese u malignit diktuje nábor a aktivaci leukocytů, angiogenezi, proliferaci rakovinných buněk a metastázy ve všech stádiích onemocnění.56 Na začátku, 24-48 hodin po ablaci, mezi před chemoterapií, bude odebrána krev a izolována plazma odstředěním 1-2 ml krve při 1-2000 x g po dobu 10 minut a poté alikvotováním 120 ul do 0,65 ml mikrocentrifugačních zkumavek. Skupina standardní péče bude mít pouze 3 časové body odběru krve. Vzorky plazmy budou analyzovány pomocí Bio-Plex 200 v Eve Technologies Corporation (Calgary, AB Kanada) za použití Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   DATOVÝ LIST:

   Viz tabulka Excel. Sekvence RNA budou shromážděny jako tepelné mapy pro odlišně exprimované geny.

   RIZIKA:

   Rizika odběru krve:

   Rizika odběru krve zahrnují: bolest, nepohodlí, krvácení, modřiny, zarudnutí, infekce v místě vpichu jehly do kůže; pocit točení hlavy, mdloby.

   Rizika související s kryoablací:

   Kryoablace byla velmi bezpečná procedura; PI rutinně nabízí tento postup u benigních a rakovinných onemocnění prsu; dosud bylo zákroku podrobeno 18 pacientů s rakovinou a 36 benigních lézí. Dosud byly hlášeny následující mírné komplikace:

   • Modřina v místě ablace - samoomezující.
   • Bolest – zvládnuta OTC analgetiky.
   • Nekróza kůže je však teoretickou možností, při dodržení protokolu postupu; nikdy jsme tuto komplikaci neměli.

   Rizika související s pembrolizumabem:

   Byly provedeny rozsáhlé studie o toxicitě inhibitorů imunitního kontrolního bodu.57 Standardní doporučená dávka pro Pemrolizumab je 200 mg IV na dávku (schváleno FDA). Mezi očekávané nežádoucí účinky patří:

   • Vyrážka
   • Průjem
   • Zácpa
   • Nevolnost
   • Ztráta váhy
   • Suché oči
   • Únava
   • Bolest hlavy
   • Horečka
   • Bolest kloubů
   • Dysfunkce štítné žlázy

   Ztráta důvěrnosti:

   Všechna data budou uchovávána v souborech chráněných heslem v kanceláři CRI a PI. Pro kompilaci a analýzu budou všechna data deidentifikována. Budou dodržovány všechny protokoly pro soulad s HIPAA. Kvůli lidské chybě je však možné minimální riziko porušení důvěrnosti.

   VÝHODY:

   Pacienti v rameni II a III mohou mít prospěch z účasti ve studii. Pokud naše intuice imunitní modulace prostřednictvím kombinace kryoterapie a léčivého inhibitoru kontrolního bodu skutečně ovlivní kontrolu nádoru, budou tyto dvě skupiny přímo těžit z účasti ve formě. Kontrolní větev I však nebude mít prospěch ze studie kromě poskytnutí srovnávací větve pro studii. Hlavním cílem navrhované studie je identifikovat nový nízkorizikový léčebný přístup k těmto vysoce rizikovým rakovinám, který bude v konečném důsledku přínosem pro budoucí pacienty s rakovinou.

   MONITOROVÁNÍ:

   Pro zajištění souladu s protokolem studie, směrnicemi GCP a výzkumnými zásadami a postupy programu ochrany lidského výzkumu TTUHSC během provádění studie a také s údaji o kvalitě bude sledování studie provádět monitor v Ústavu klinického výzkumu. První monitorovací návštěva bude provedena do dvou týdnů poté, co byl první subjekt zařazen do studie. Následující monitorovací návštěvy budou naplánovány pravidelně, ale ne méně než každé 2 měsíce, pokud je aktivní účastník studie, ve vzájemně dohodnutém časovém rámci mezi hlavním výzkumným pracovníkem a monitorujícím studiem. Všechna shromážděná data budou 100% ověřena zdrojovým dokumentem. Monitorující studie může kontrolovat a kontrolovat všechny dokumenty studie, tj. formuláře pro sběr dat, dotazníky, odpovědnost za léky a lékařské záznamy v rámci platných předpisů o důvěrnosti.

   FINANCOVÁNÍ:

   Žádost o grant NIH R21