Immuunmodulatie groeperen met cryoablatie (LOGIC) voor borstkanker (LOGIC)

DOELEN:

Het belangrijkste doel van de voorgestelde studie is het beoordelen van de synergie van tumorcryoablatie en immuuncontrolepuntremmer bij borstkanker met een hoog risico bij mensen. Dit zal worden bereikt door alleen cryoablatie en cryoablatie in combinatie met pembrolizumab - een [checkpoint-remmer (anti-PD-1/PD-L1-antilichaam) momenteel door de FDA goedgekeurd als kankertherapie] te vergelijken met de huidige zorgstandaard, inclusief chirurgische resectie. De huidige standaard van neoadjuvante/adjuvante therapieën zal ongewijzigd blijven om ethische redenen om alle patiënten de best bekende standaard van zorg te bieden.

DOELSTELLINGEN:

We stellen een prospectieve gerandomiseerde verkennende studie voor waarbij patiënten met klinische stadium I/II, triple negatieve invasieve borstkanker gerandomiseerd zullen worden naar een van de drie takken van de studie:

1. Standaardbehandeling - neoadjuvante therapie gevolgd door chirurgische resectie gevolgd door passende adjuvante therapie indien nodig.
2. Cryoablatie-arm - cryoablatie gevolgd door passende neoadjuvante therapie gevolgd door chirurgische resectie gevolgd door passende adjuvante therapie indien nodig.

3. Cryoablatie met pembrolizumab - Een enkele dosis pembrolizumab van 200 mg vóór (binnen 24-48 uur) cryoablatie gevolgd door passende neoadjuvante therapie gevolgd door chirurgische resectie gevolgd door passende adjuvante therapie indien nodig.

   Uitkomstmaten omvatten bloed- en tumoranalyse van de immuunrespons met flowcytometrie en cytokine-analyse bij baseline, na interventie en vóór de operatie. Weefsel van kernbiopsie bij baseline, herhaalde biopsie vóór chemotherapie en tumorresectie zullen ook worden geanalyseerd op tumormicro-omgeving.

   INLEIDING / ACHTERGROND / BETEKENIS:

   Borstkanker met een hoog risico en behoefte aan nieuwere behandelingsbenaderingen: Triple-negatieve borstkanker, die 15-20% van alle borstkankerdiagnoses vertegenwoordigt, wordt als een hoog risico beschouwd. Hoewel chirurgische resectie de steunpilaar van de behandeling blijft, omvat de therapeutische ruggengraat neoadjuvante en adjuvante chemotherapie. Voor patiënten die zelfs na chirurgische resectie en voltooiing van chemotherapie nog steeds een significante restziekte hebben, worden verdere agressieve systemische therapieën zoals capecitabine uitgevoerd. Triple-negatief subtype wordt geassocieerd met het hoogste aantal mutaties in het hele genoom en niet-gemetastaseerde ziekte wordt geassocieerd met 17-20% lokaal falen en 35-40% falen op afstand na 5-10 jaar follow-up. Deze gegevens suggereren dat micrometastatische hematogene verspreiding plaatsvindt bij een aanzienlijk aantal patiënten met operabele borstkanker met een hoog risico en dat er nieuwere benaderingen nodig zijn die de lokale controle versterken en tegelijkertijd de systemische verspreiding van de ziekte beheersen.

   Reikwijdte van immuunmodulatie: Kankerimmunotherapie heeft de afgelopen decennia een buitengewoon succes gekend. Antigenen die antitumor immuunresponsen kunnen opwekken, vormen een geschikt immunotherapeutisch doelwit. De aanpak van T-cel checkpoint blokkadetherapieën heeft opmerkelijke klinische reacties opgeleverd bij verschillende soorten solide kankers, zoals melanoom, niet-kleincellige longkanker, blaaskanker en kankers met een gebrek aan herstel van de juiste combinatie. Aangenomen wordt dat een effectieve antitumorimmuunrespons wordt geïnitieerd door de opname van tumorantigenen door antigeenpresenterende cellen (APC's), die ze op hun beurt presenteren en co-stimulerende signalen afgeven aan zowel CD4+- als CD8+-T-cellen. APC's, met name dendritische cellen, verwerken antigenen via een exogene antigeenverwerkingsroute waarbij tumorcelmateriaal wordt gefagocyteerd en omgezet in HLA klasse I- en klasse II-bindende peptiden die worden gepresenteerd aan respectievelijk CD8+ (kruispresentatie) en CD4+ T-cellen. Gebruikmakend van deze kennis hebben recente fase 1-onderzoeken een verbeterde respons op therapie met immuuncheckpointremmers in combinatie met conventionele chemotherapie bij triple-negatieve borstkankers gemeld. Zeker, het percentage tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) is geïdentificeerd als een belangrijke immunologische parameter, met name voor borstkanker met een hoog risico, die correleert met de respons op systemische therapie, wat suggereert dat de immuunrespons van de gastheer een sterke rol speelt bij de controle van kanker, ongeacht therapeutische interventie. .

   Beperking van immuunmodulatie - T-cellen zijn sleutelspelers in antitumorimmuniteit en vormen daarom het belangrijkste doelwit voor immunotherapeutisch onderzoek. De huidige doorbraak in kankerimmunotherapie is het resultaat van de identificatie en doelgerichtheid van het controlepuntmechanisme met CTLA-4, PD-1 en PD-L1. CTLA-4 en PD-1 zijn co-remmende receptoren die op het oppervlak van T-cellen worden aangetroffen. Na binding aan hun overeenkomstige liganden (respectievelijk CD 80/86 en PD-L1/L2), worden T-cellen anergisch - een fysiologisch mechanisme van tolerantie. In de context van tumormicro-omgeving kan de afwijkende expressie samen met chronische blootstelling aan tumorantigenen leiden tot ongewenste onderdrukking van T-celimmuniteit.

   Recent ontwikkelde checkpoint-blokkers, zoals PD-1/PD-L1-remmer, pembrolizumab, hebben een nieuw wapen tegen kanker opgeleverd met duurzame klinische reacties en langdurige remissies. Het is echter aangetoond dat checkpoint-blokkade het meest effectief is bij tumoren met een hoge mutatiebelasting, in overeenstemming met het idee dat T-celherkenning van neo-antigenen een belangrijke rol speelt bij checkpoint-blokkade. Veel onderzoeken tonen aan dat wanneer het tumorreactieve T-celinfiltraat afwezig of laag is (laag percentage TIL's), het substraat voor checkpointblokkade ontbreekt. Bovendien reageert de meerderheid van de patiënten met zogenaamde hypergemuteerde tumoren niet op checkpointblokkade als gevolg van immuunbewerking, wat het vermogen van de T-cellen om hun cytotoxische activiteit van adequate tumorinfiltratie en herkenning van tumor-antigeen-geladen HLA-klasse te vervullen, aantast. ik moleculen. Daarom is het verbeteren van de antigeenpresentatie in de tumor essentieel om de checkpoint-blokkade effectief te laten zijn.

   De rol van ablatieve therapieën - met name cryoablatie: Thermische ablatie met cryotherapie, laser, radiofrequentie, microgolven en gefocusseerd ultrageluid biedt een unieke kans om zowel de primaire tumor als de micrometastatische ziekte aan te pakken. De effecten van tumorablatie zijn veelvoudig: (1) de vernietiging van tumormassa, verlaging van de tumorlast en (2) het vrijkomen van tumorantigenen, waardoor ze beschikbaar komen voor opname door antigeenpresenterende cellen (APC's) en de behandeling zelf leidt tot (3 ) het vrijgeven van schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's) en (4) de inductie van een fysiologische wondgenezingsreactie. Ablatie leidt tot het creëren van een in situ antigeendepot dat alle soorten tumoreiwitten bevat, wat leidt tot het initiëren van een systemische antitumorimmuunrespons die mogelijk occulte metastatische ziekte kan elimineren. Ablatie van tumoren bij temperaturen boven 65 °C leidt tot denaturatie van eiwitten. Dit kan de immuunresponsen op tegengestelde manieren beïnvloeden, aangezien hoge temperaturen immuunactiverende signalen denatureren, zoals gevaarsignalen zoals hitteschok-eiwitten (HSP's). Daarom is cryoablatie de meest veelbelovende ablatieve techniek, aangezien het minimale invasiviteit, minder schade aan omliggende weefsels, beter behoud van tumorantigenen en de meest robuuste gegevens over immuunstimulatie biedt.

   Immuunstimulatie door cryoablatie - Diep invriezen en ontdooien tijdens cryoablatie induceert necrose en de opwaartse regulatie van DAMP-moleculen die tumorcellen vatbaarder maken voor APC's en tumorspecifieke T-cel-gemedieerde doding. Cryoablatie reguleert DAMP's, zoals HMG1, calreticuline, S100A8/A9 en HSP70, die het immuunsysteem stimuleren via Receptor for Advanced Glycosylation End-products (RAGE) en toll-like receptoren en de antigeenpresentatie verbeteren. Bovendien is het cytokine-milieu in de centrale zone als gevolg van cryoablatie typisch een Th1-cytokineprofiel van IL-2, INF-γ, TNF-α en IL-12.28 Deze cytokinen en DAMP's sturen vermoedelijk de cytotoxische CD8+ T-celrespons aan. Preklinisch bewijs ter ondersteuning van de immuunrespons van cryoablatie: verschillende preklinische onderzoeken naar cryoimmunologie onderzochten of het bevriezen van de tumor en het in situ laten ervan het dier resistent zou maken tegen een nieuwe blootstelling. Diermodellen die gebruik maakten van carcinoom- en sarcoomcellijnen bij konijnen en muizen vertoonden tumorspecifieke resistentie tegen hernieuwde provocatie. Opnieuw provoceren met dezelfde tumorcellijnen toonde weerstand tegen groei bij dieren na cryoablatie in vergelijking met chirurgische resectie. Soortgelijke ervaring werd gerapporteerd door Blackwood en Cooper met modellen waarbij ratten waren geïnoculeerd met myosarcoom- en carcinosarcoomcellijnen. Ratten met ingevroren tumoren hadden meer kans om weerstand te bieden tegen hernieuwde provocatie en vertoonden regressie van secundaire tumoren in vergelijking met chirurgisch behandelde ratten. Bagley et al. vergeleek cryoablatie met chirurgie bij het gebruik van MCA-10 fibrosarcoom bij C57BL/6-muizen, waarbij miltlymfocyten met tussenpozen van een week na behandeling voor cytotoxiciteitstesten werden geoogst. Muizen die cryoablatie ondergingen hadden een significant hogere cytotoxiciteit dan chirurgisch behandelde of onbehandelde muizen. Sabel et al. bestudeerde MT-901 borstadenocarcinoomtumoren bij BALB/c-muizen die werden behandeld met cryoablatie of chirurgische resectie. Na hernieuwde provocatie ontwikkelde 86% van de muizen die met een operatie waren behandeld tweede tumoren vergeleken met 16% van de muizen die met cryoablatie waren behandeld. Dit was tumorspecifiek, aangezien de cryoablatie geen bescherming bood tegen provocatie met andere cellijnen. Meer recent hebben Kim et al. het gebruik van niercelcarcinoomcellijnen in BALB/c-muizen rapporteerde vergelijkbare resultaten. Meer recentelijk is het abscopale effect van tumorregressie in onbehandelde tumoren in diermodellen waarbij slechts één van de geïmplanteerde tumoren was ingevroren, gerapporteerd als resultaat van een systemische immuunrespons.

   Klinisch bewijs ter ondersteuning van de immuunrespons van cryoablatie: hoewel het klinische gebruik van cryoablatie voor kanker recentelijk is uitgebreid, zijn er relatief weinig studies die de immunologische impact bij mensen onderzoeken. Ravindranath et al. het niveau van serumtumorgangliosiden en hun antilichaamtiters gemeten bij patiënten die cryoablatie, radiofrequente ablatie of resectie van levermetastasen van colorectale kanker kregen. Gangliosidespiegels in het serum waren significant hoger bij gecryoablateerde patiënten in vergelijking met radiofrequentie of chirurgie. Gecryoablateerde patiënten vertoonden ook hogere IgM-titers tegen tumorgangliosiden. Si et al. bestudeerde 20 patiënten met prostaatkanker die cryoablatie van de primaire tumor ondergingen en rapporteerde een toename van de cytolytische activiteit tegen LNCaP en een toename van het aantal IFN-ɣ producerende T-cellen. Thakur et al. voerde een pilootstudie uit van cryoablatie en GM-SCF voor patiënten met niercelcarcinoom metastatisch naar de longen. GM-CSF werd geïnfiltreerd in de buurt van een longmetastatische laesie die was geselecteerd voor cryoablatie. Na de procedure werd aanvullende GM-CSF-therapie gebruikt. De combinatie van GM-CSF en cryoablatie produceerde een verbeterde immuunrespons in termen van cytotoxiciteit en serumantilichamen.

   Beperking van cryoablatie: ondanks de hierboven besproken gegevens is de immuunrespons op cryoablatie niet uniform geweest. Sommige preklinische onderzoeken naar osteogeen sarcoom en prostaatkankermodellen lieten geen toename van de immuunfunctie na cryoablatie zien. Wat nog belangrijker is, is dat verschillende onderzoeken immuunonderdrukking met cryochirurgie hebben gemeld. De meeste van deze onderzoeken hadden betrekking op fibrosarcoomcellijnen bij ratten en vertoonden verminderde weerstand tegen hernieuwde provocatie na cryoablatie, evenals toegenomen groei van metastatische tumoren en secundaire tumoren. Vanuit het perspectief van borstkanker, Sabel et al. rapporteerden dat een hoge bevriezingsgraad resulteerde in meer tumorspecifieke T-cellen in de tumorafvoerende lymfeklieren, vermindering van longmetastase en verbeterde overleving in vergelijking met lage bevriezingspercentages die ook meer Tregs hadden (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Daarom is bewezen dat de omvang van het systemische effect dat alleen door cryotherapie wordt veroorzaakt, onvoldoende of contraproductief is. Het huidige inzicht is dat dicht bij de ablatieve bron, direct letsel en celdood met necrose tumorantigenen en (DAMP's) vrijgeven die dendritische cellen rekruteren en activeren die op hun beurt de proliferatie van T-cellen en immuuncomponenten stimuleren. Overgangszone weg van de ablatieve bron veroorzaakt indirect cellulair letsel en apoptotische celdood zonder afgifte van DAMP's, wat afgifte van onderdrukkende cytokines en T-cel klonale deletie en anergie veroorzaakt. Intuïtief stimuleert cryoablatie een immuunrespons, maar de uiteindelijke klinische impact wordt bepaald door de verhouding tussen CD4+ T-effectorcellen en T-regulerende cellen. Hogere T-effector tot T-regulerende celverhouding bevordert de gunstiger CD8 cytotoxische T-celrespons. Hoewel CD8+ cytotoxische cellen de primaire tumor en systemische micrometastase elimineren, is het belangrijk dat de anergie onder controle wordt gehouden en zowel effector (CD45RO+, CCR7-) als centrale (CCR7+, CD45RO+) geheugen-T-cellen worden gevormd voor langdurige beschermende anti- tumor immuniteit.

   HYPOTHESE:

   "Combinatie van cryoablatie met pembrolizumab voor lokale controle bij triple-negatieve borstkanker met een hoog risico is superieur aan alleen chirurgische resectie of alleen cryoablatie bij het genereren van een antitumor immuunrespons".

   METHODEN:

   Site van studie:

   Het voorgestelde verkennende werk is een gerandomiseerde studie die zal worden uitgevoerd in het Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center.

   Type studie:

   Prospectief gerandomiseerd onderzoek - hypothesegestuurd

   Experimenteel ontwerp:

   We stellen een enkelvoudig geblindeerd, prospectief gerandomiseerd onderzoek voor, waarin vrouwen met stadium I/II triple-negatieve borstkanker zullen worden opgenomen in een van de drie armen op een 1:1:1 gerandomiseerde manier: (I) Controle-arm met neoadjuvante chemotherapie gevolgd door lumpectomie/ mastectomie met schildwachtklierbiopsie +/- okseldissectie; (II) Interventie met alleen cryoablatie gevolgd door neoadjuvante chemotherapie gevolgd door lumpectomie/mastectomie met schildwachtklierbiopsie +/- axillaire dissectie; (III) Interventie met cryoablatie + Pembrolizumab gevolgd door neoadjuvante chemotherapie gevolgd door lumpectomie/mastectomie met schildwachtklierbiopsie +/- axillaire dissectie. Het behandelingsschema is ontworpen om de blootstellingstijd aan antigeen te optimaliseren [Afbeelding-2]. De proef zal worden geregistreerd bij het National Clinical Trials Network zodra IRB-goedkeuring is verkregen.

   Onderwerpen:

   Alle patiënten van 18 jaar en ouder met klinische stadium I/II triple-negatieve ziekte zullen worden aangeboden om deel te nemen. Deze patiënten worden gescreend tijdens een afspraak voor oncologie/chirurgie door het onderzoeksteam. Een geautomatiseerde randomisatielijst zal worden gebruikt voor de toewijzing van de behandelingsarm met behulp van de website:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Inclusiecriteria:

   • Vrouwtjes
   • Kanker in stadium I/II
   • Leeftijdscategorie 18 - 89 jaar
   • Diagnoses: Invasief carcinoom, ER-, PR-, HER2- (triple negatief)
   • Radiologische bevindingen: Unifocale ziekte zichtbaar op echografie

   Uitsluitingscriteria:

   • Extra primaire kanker
   • Inflammatoire borstkanker
   • Geschiedenis van auto-immuunziekte
   • Geschiedenis van chronische immunosuppressie
   • Voorafgaande immunotherapie
   • Recente vaccinatie (binnen 4 weken)
   • Voorafgaande bestralingstherapie
   • Eerdere therapie met een onderzoeksgeneesmiddel in de afgelopen 1 jaar
   • Zwangerschap ten tijde van diagnose en/of behandeling
   • Borstvoeding

   Studiebezoeken:

   Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen en vervolgens wordt de patiënt gerandomiseerd. Alle bezoeken vallen samen met standaardzorgbezoeken. Vervolgens zal het volgende gebeuren:

   Bezoek 1: Dag 1:

   Basislijn Bloedafname; tot 20 ml wordt opgevangen in EDTA-buisjes; het bloed wordt gecentrifugeerd bij TTUHSC. Plasma zal worden gebruikt voor cytokine-analyse en fenotypering in het TTU-lab. Er wordt één EDTA-buis naar de Universiteit van Houston gestuurd (gedurende de studietijdstippen). De volgende resultaten worden gemeten:

   Cytokine-analyse

   • RNA seq PBMC-analyse Basislijn kernbiopsieweefsel (reeds beschikbaar bij diagnostisch onderzoek) zal worden beoordeeld op: (2 ongekleurde objectglaasjes zullen worden voorbereid voor RNA seq uit gefixeerd weefsel)
   • TIL %
   • RNA Seq-tumorweefsel

   Bezoek 2 (alleen Groep II & III) Na cryoablatie: Dag 3 (+/- 7 dagen):

   Bloedafname na ablatie (groep II en III) - tot 10 ml bloed in EDTA-buisje(s):

   • Cytokine-analyse

   Bezoek 3 (alle groepen) Pre-neoadjuvante chemotherapie: Dag 21 (+/- 14 dagen):

   Bloedafname op het moment van inbrengen van de poort voor chemotherapie - tot 20 ml bloed in EDTA-buisjes:

   • Immuun fenotypering door flowcytometrie
   • Cytokine-analyse
   • RNA seq PBMC-analyse
   • Tumorbiopsie zal worden herhaald voor TIL- en RNA-seq-analyse

   Bezoek 4 (alle groepen): Post-chemotherapie-resectie (ongeveer 6 maanden na de oorspronkelijke biopsie):

   Preoperatieve bloedafname tot 20 ml bloed in EDTA-buisjes (vergelijkbaar met baseline):

   • Immuun fenotypering door flowcytometrie
   • Cytokine-analyse
   • RNA seq PBMC-analyse Chirurgische monsterweefselanalyse (2 ongekleurde objectglaasjes van gefixeerd weefsel worden voorbereid voor RNA seq)
   • TIL%
   • RNA seq tumorweefsel

   Steekproefgrootte:

   Tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL's), met name in het stroma van triple-negatieve borstkanker, zijn prognostisch en voorspellend voor de respons op therapie. Daarom werden aanbevelingen van de International TILs Working Group gebruikt om de steekproefomvang voor dit project te berekenen. De procentuele verandering van TIL's wordt verondersteld 10% te zijn voor de controlearm en 50% voor de behandelarm. Een steekproef van 10 patiënten per groep kan een vermogen van 80% bereiken om een ​​gemiddeld verschil van 0,4 (0,5 vs. 0,1) met een standaarddeviatie van 0,3 te detecteren, met behulp van een tweezijdige twee-steekproeven gelijke variantie t-test (alfa=0,05) . Uitgaande van een uitvalpercentage van 30%, zou een totaal van 12 patiënten in elke arm voldoende zijn voor een totaal van 36 patiënten; dit zou een vermogen van 90% bereiken. Dit betekent dat minimaal 10 patiënten per arm en maximaal 12 patiënten per arm zullen leiden tot een statistisch zinvolle studie.

   Statistisch plan:

   Beschrijvende statistiek zal worden gebruikt om de bereiken, gemiddelden en varianties te berekenen voor de onafhankelijke variabelen standaardzorg, cryo, cryo+pembro. Dit suggereert dat de concentratie van de waarnemingen rond het gemiddelde en de variatie van de waarnemingen van de gemiddelden. De normaliteitstest zal worden overwogen om te controleren of gegevens al dan niet normaal verdeeld zijn. Normale kwantiel-kwantielplots (ook wel q-q-plots genoemd) worden gebruikt om te bepalen of datasets afkomstig zijn van een normale populatie. Om de uitschieters (als die er zijn) te detecteren, zullen verschillende statistische maatregelen in overweging worden genomen. Om de homogeniteit van varianties voor de onafhankelijke variabelen standaardzorg, cryo, cryo+pembro te controleren, zal Levene's test worden uitgevoerd door nul- en alternatieve hypothesen op te stellen. Om het significantieverschil tussen de gemiddelden van de variabelen te vergelijken, zal een one-way variantieanalyse (ANOVA) worden uitgevoerd. De nulhypothesen en alternatieve hypothesen voor de middelen worden geïntroduceerd. In ANOVA wordt de statistische significantie van de gemiddelden getest (α = 0,05) met behulp van de F-teststatistiek. Als de gemiddelden statistisch significant verschillen, worden de post-hoc meervoudige vergelijkingstests uitgevoerd. Post-hoc meervoudige vergelijkingstests (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey, enz.) zullen worden gebruikt om de juiste significante groepsgemiddelden te detecteren. Als de steekproeven niet voldoen aan de normaliteitsaannames, worden verschillende niet-parametrische tests overwogen voor de statistische analyses.

   Tumor Cryoablatie:

   Alle geregistreerde patiënten worden gerandomiseerd naar een van de drie takken van de studie. Patiënten in arm II en III zullen cryoablatie ondergaan volgens het volgende protocol (vergelijkbaar met het protocol gebruikt in de ACOSOG Z1072-studie).

   Cryoablatie-apparaat: Cryoablatie zal worden uitgevoerd met behulp van het in de handel verkrijgbare ProSense Cryosurgical System (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israël) bestaande uit een console, cryoprobe en bijbehorende vloeibare stikstof (cryogeen) Case Dewars. De console is een op zichzelf staande eenheid met een interface voor het besturen en bewaken van de cryoablatieprocedure. Het werkt met standaard 120 VAC (60Hz) vermogen.

   Werking van het apparaat: Het ProSense cryochirurgische systeem maakt gebruik van een gesloten systeem om vloeibare stikstof in de punt van de cryoprobe te laten circuleren, waardoor temperaturen onder het vriespunt ontstaan ​​die leiden tot ablatie van het doelweefsel. De laesie wordt geïdentificeerd met ultrageluid en de cryoprobe wordt onder echogeleide in het midden van de laesie geplaatst na adequate lokale anesthesie, en ablatie wordt uitgevoerd volgens het vooraf bepaalde bevriezen-ontdooien-bevriezen-algoritme. De sonde wordt vervolgens verwarmd door een interne elektrische weerstandsverwarmer en uit de patiënt verwijderd. Cryoablatieprocedure: de tumor wordt geïdentificeerd met behulp van een ultrasone sonde met lineaire array met hoge resolutie in twee orthogonale weergaven. De langste afmeting van de tumor wordt geïdentificeerd voor parallelle insertie van de sonde. Deze maat wordt ingevoerd in de console; de console biedt de lengte van de cryoprobe-tip om voorbij de laesie te zijn bij het inbrengen. Na het inbrengen wordt de positie van de sonde bevestigd in twee orthogonale weergaven. Cryoablatie wordt gedaan met behulp van de bevriezing-ontdooi-bevriezingscyclus volgens de tumorgrootte. De gehele procedure wordt onder zicht gevolgd en zoutoplossing wordt geïnfiltreerd om bevriezing van de huid te voorkomen door de huid weg te snijden van de ijsbal. Grootte van ijsbal wordt geregistreerd in orthogonale afmetingen. In ons protocol wordt, als een patiënt meer dan één laesie heeft, slechts één laesie geablateerd; biopsieën van andere laesies zullen echter worden onderzocht op abscopaal affect.

   Infusie van Pembrolizumab en dosering:

   Als eerste stap hebben we de veiligheid en verdraagbaarheid van immuuncontrolepuntremmers met tumorcryoablatie bevestigd bij vrouwen met nieuw gediagnosticeerde borstkanker. Een belangrijke overweging was de keuze van een immuunmodulerend antilichaam. Pembrolizumab, een door de FDA goedgekeurd antilichaam tegen PD-1/PD-L1, heeft een bewezen veiligheidsprofiel en induceert langdurige remissies van >10 jaar bij 10-20% van de patiënten met gevorderd melanoom.50 Bovendien, omdat T-cellen de expressie van PD-1/PD-L1 acuut opwaarts reguleren nadat ze zijn blootgesteld aan antigenen,51 die op hun beurt de cytotoxische respons kunnen afzwakken, is pembrolizumab bij uitstek geschikt voor immuunmodulatie in combinatie met cryoablatie. Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) publiceerde een pilotstudie over deze combinatie; er werden geen ernstige bijwerkingen gemeld die toe te schrijven zijn aan ipilimumab; geen enkele operatie werd uitgesteld. MSKCC gebruikte 10 mg/kg als een enkele dosis; aangezien de onderzoeken bij die dosis echter hogere bijwerkingen melden, stellen we de aanbevolen dosis van 200 mg voor IV gedurende 90 minuten vóór cryoablatie voor, wat de momenteel gebruikte dosis is in de klinische setting voor triple-negatieve kankers.

   Methodologie voor uitkomstmaten:

   We zullen de immuunrespons(en) observeren en monitoren na de cryoablatieprocedures met en zonder pembrolizumab. Bloedmonsters worden verzameld in EDTA-bloedafnamebuisjes en vervolgens verdeeld voor T-cel-fenotypische analyse en plasma-afname voor cytokine/chemokine, en voor RNA seq-analyse, op de aangegeven tijdstippen. Pathologie-objectglaasjes zullen worden gemaakt voor onderzoek van kernbiopsiemonsters bij baseline en van lumpectomie en schildwachtklieren op het moment van de operatie. Per monster worden vijf objectglaasjes gemaakt (na voltooiing van routinepathologie) voor H&E en immunohistochemie voor immuuncelinfiltraten om het TIL-percentage te berekenen. Alle medewerkers/sleutelpersoneel dat betrokken is bij het uitvoeren van de analyse van de uitkomstmaten zullen blind zijn voor de randomisatiegroepen.

   Hieronder volgen de details voor de uitkomstanalyse:

   TIL-berekening: Alle weefselspecimens die routinematige pathologierapportage ondergaan, zullen worden beoordeeld op TIL-rapportage volgens de richtlijnen van de International TILs Working Group. Verandering in TIL-score tussen origineel kernbiopsieweefsel en chirurgisch weefsel zal de focus zijn van analyse om de impact van voorgestelde interventies te beoordelen.

   Meting van T-celveranderingen in bloed: T-celsubtypen kunnen worden gedefinieerd door differentiële expressie van markers op het celoppervlak. We zullen T-cellen monitoren op activatie, verhoogde CD8+ effector T-cellen en ontwikkeling van effector en centraal geheugen. Voor T-cel fenotypering zal volbloedkleuring (100 µl/kleuring) worden uitgevoerd met antilichamen tegen CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 en Ki67 met geschikte isotypecontroles.55 Na RBC-lysis zullen de gekleurde mononucleaire cellen worden uitgevoerd op een Attune NxT 14-kleuren flowcytometer (Thermofisher, Waltham, MA) en geanalyseerd met behulp van FlowJo-software (Becton, Dickinson and Company). T-cellen (CD3+, CD4+ of CD8+) worden geanalyseerd op veranderingen in naïef (CD27+, CCR7+, CD45RO-), effector (CCR7-, CD45RO-), effectorgeheugen (CD27-, CCR7-, CD45RO+) en centraal geheugen ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) fenotypische markers evenals voor activatie (ICOS en CD137) en proliferatie (Ki67). We zullen verder analyseren op percentages T-regulerende cellen (CD25+, CD127-). We zullen deze gegevens gebruiken om een ​​T-cel immuunsignatuur te bepalen om de effectiviteit van de cryoabalatie +/- Pembrolizumab te correleren om de antitumorimmuniteit op lange termijn te voorspellen.

   Plasma cytokine/chemokine-analyse: Onze eerste analyse zal zijn om te bepalen welke cytokines/chemokines en welke concentraties in het bloed worden gedetecteerd na cryoablatie +/- pembrolizumab en hoe hun profielen zijn veranderd. We zullen ons concentreren op de inflammatoire en helper T-cel cytokineprofielen en hoe deze cytokines de T-celrespons beïnvloeden en sturen. Daarnaast zullen we kijken naar veranderingen in chemokines. Er is aangetoond dat hun veranderde expressie in maligniteiten de rekrutering en activering van leukocyten, angiogenese, proliferatie van kankercellen en metastase in alle stadia van de ziekte dicteert.56 Bij baseline, 24-48 uur na ablatie, tussen pre-chemotherapie, zal bloed worden verzameld en plasma worden geïsoleerd door 1-2 ml bloed te centrifugeren bij 1-2000 x g gedurende 10 minuten en vervolgens 120 µl in microcentrifugebuisjes van 0,65 ml te verdelen. De zorgstandaardgroep heeft slechts 3 tijdstippen voor bloedmonsters. Plasmamonsters zullen worden geanalyseerd met een Bio-Plex 200 bij Eve Technologies Corporation (Calgary, AB Canada) met behulp van de Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   DATA PAPIER:

   Zie Excel-spreadsheet. De RNA-seq zal worden verzameld als warmtekaarten voor differentieel tot expressie gebrachte genen.

   RISICO'S:

   Bloedafname risico's:

   De risico's van een bloedafname omvatten: pijn, ongemak, bloeding, blauwe plekken, roodheid, infectie waar de naald de huid binnendringt; zich licht in het hoofd voelen, flauwvallen.

   Cryoablatie gerelateerde risico's:

   Cryoablatie is een zeer veilige procedure geweest; PI heeft deze procedure routinematig aangeboden aan goedaardige en kankerziekten in de borst; tot nu toe zijn 18 kankerpatiënten en 36 goedaardige laesies aan de procedure onderworpen. De volgende milde complicaties zijn tot nu toe gemeld:

   • Blauwe plekken op de plaats van ablatie - zelfbeperkt.
   • Pijn - beheerd met OTC-analgetica.
   • Huidnecrose is echter een theoretische mogelijkheid, volgens het procedureprotocol; we hebben deze complicatie nog nooit gehad.

   Pembrolizumab-gerelateerde risico's:

   Er zijn uitgebreide onderzoeken gedaan naar de toxiciteit van immuuncontrolepuntremmers.57 De standaard aanbevolen dosis voor Pemrolizumab is 200 mg IV per dosis (goedgekeurd door de FDA). Verwachte bijwerkingen zijn onder meer:

   • Uitslag
   • Diarree
   • Constipatie
   • Misselijkheid
   • Gewichtsverlies
   • Droge ogen
   • Vermoeidheid
   • Hoofdpijn
   • Koorts
   • Gewrichtspijn
   • Schildklierdisfunctie

   Verlies van vertrouwelijkheid:

   Alle gegevens worden bewaard in met een wachtwoord beveiligde bestanden binnen het kantoor van de CRI en PI. Alle gegevens worden geanonimiseerd voor compilatie en analyse. Alle protocollen voor HIPAA-naleving zullen worden gevolgd. Er is echter een minimaal risico op schending van de vertrouwelijkheid mogelijk als gevolg van menselijke fouten.

   VOORDELEN:

   De patiënten in arm II en III kunnen baat hebben bij deelname aan de studie. Als onze intuïtie van immuunmodulatie via een combinatie van cryotherapie en een checkpoint-remmer daadwerkelijk de controle van de tumor beïnvloedt, zullen deze twee groepen direct profiteren van deelname. De controle-arm I zal echter niet profiteren van de proef, afgezien van het bieden van een vergelijkingsarm voor de studie. Het belangrijkste doel van de voorgestelde studie is het identificeren van een nieuwe behandelingsbenadering met een laag risico voor deze kankers met een hoog risico, die uiteindelijk de toekomstige kankerpatiënten ten goede zullen komen.

   TOEZICHT HOUDEN:

   Om te zorgen voor naleving van het onderzoeksprotocol, de GCP-richtlijnen en het onderzoeksbeleid en de procedures van het TTUHSC Human Research Protection Program tijdens de uitvoering van het onderzoek, evenals kwaliteitsgegevens, zal een monitor in het Clinical Research Institute de monitoring van het onderzoek uitvoeren. Het eerste controlebezoek vindt plaats binnen twee weken nadat de eerste proefpersoon voor het onderzoek is ingeschreven. De daaropvolgende monitoringbezoeken worden periodiek gepland, maar niet minder dan elke 2 maanden wanneer er een actieve studiedeelnemer is, op een onderling overeengekomen tijdschema door de PI en studiemonitor. Alle verzamelde gegevens zullen 100% brondocument geverifieerd zijn. De studiemonitor kan alle onderzoeksdocumenten, d.w.z. gegevensverzamelingsformulieren, vragenlijsten, medicijnverantwoording en medische dossiers, inspecteren en controleren binnen de toepasselijke vertrouwelijkheidsregels.

   FINANCIERING:

   Aangevraagd voor NIH subsidie ​​R21