Gruppering af immunmodulation med kryoablation (LOGIC) for brystkræft (LOGIC)

MÅL:

Hovedmålet med den foreslåede undersøgelse er at vurdere synergien mellem tumorkryoablation og immuncheckpoint-hæmmer i højrisiko brystkræft hos mennesker. Dette vil blive opnået ved at sammenligne cryoablation alene og cryoablation i kombination med pembrolizumab - en [checkpoint-hæmmer (anti PD-1/PD-L1 antistof) i øjeblikket FDA godkendt som cancerterapi] med den nuværende standard for pleje, herunder kirurgisk resektion. Den nuværende standard for neoadjuverende/adjuverende terapier vil forblive uændret af etiske årsager for at give den bedst kendte standard for pleje til alle patienter.

MÅL:

Vi foreslår et prospektivt randomiseret eksplorativt forsøg, hvor patienter med klinisk fase I/II, triple negativ invasiv brystkræft vil blive randomiseret til en af ​​de tre arme af undersøgelsen:

1. Standardbehandling - neoadjuverende terapi efterfulgt af kirurgisk resektion efterfulgt af passende adjuverende terapi efter behov.
2. Kryoablationsarm - kryoablation efterfulgt af passende neoadjuverende terapi efterfulgt af kirurgisk resektion efterfulgt af passende adjuverende terapi efter behov.

3. Kryoablation med Pembrolizumab - Enkeltdosis af Pembrolizumab på 200 mg før (inden for 24-48 timer) efter kryoablation efterfulgt af passende neoadjuverende terapi efterfulgt af kirurgisk resektion efterfulgt af passende adjuverende terapi efter behov.

   Resultatmål vil omfatte blod- og tumoranalyse af immunrespons med flowcytometri og cytokinanalyse ved baseline, efter intervention og før operation. Væv fra kernebiopsi ved baseline, gentagen biopsi før kemoterapi og tumorresektion vil også blive analyseret for tumormikromiljø.

   INTRODUKTION / BAGGRUND / BETYDNING:

   Højrisiko brystkræft og behov for nyere behandlingsmetoder: Tredobbelt negativ brystkræft, som repræsenterer 15-20 % af alle brystkræftdiagnoser, betragtes som højrisiko. Mens kirurgisk resektion fortsat er grundpillen i behandlingen, omfatter terapeutisk rygrad neoadjuverende og adjuverende kemoterapi. For patienter, der fortsætter med at have betydelig restsygdom, selv efter kirurgisk resektion og afslutning af kemoterapi, udføres yderligere aggressive systemiske behandlinger såsom capecitabin. Triple-negativ subtype er forbundet med det højeste antal mutationer på tværs af genomet, og ikke-metastatisk sygdom er forbundet med 17-20% lokal svigt og 35-40% fjernsvigt ved 5-10 års opfølgning. Disse data tyder på, at mikrometastatisk hæmatogen spredning sker hos et betydeligt antal patienter med operationerbar højrisiko brystcancer, og der kræves nyere tilgange, som forstærker lokal kontrol og samtidig kontrollerer den systemiske spredning af sygdommen.

   Omfang af immunmodulering: Kræftimmunterapi har oplevet ekstraordinær succes i de seneste årtier. Antigener, der kan fremkalde antitumorimmunresponser, danner et egnet immunterapeutisk mål. Tilgangen til T-celle checkpoint-blokadeterapier har vist bemærkelsesværdige kliniske responser i flere typer solide kræftformer, såsom melanom, ikke-småcellet lungekræft, blærekræft og mismatch reparationsmanglende kræftformer. Et effektivt antitumorimmunrespons menes at blive initieret af optagelsen af ​​tumorantigener af antigenpræsenterende celler (APC'er), som er tur til stede dem og giver co-stimulerende signaler til både CD4+ og CD8+ T-celler. APC'er, især dendritiske celler, behandler antigener gennem en eksogen antigenbehandlingsvej, hvor tumorcellemateriale fagocyteres og omdannes til HLA klasse I- og klasse II-bindingspeptider, der præsenteres for henholdsvis CD8+ (krydspræsentation) og CD4+ T-celler. Ved at udnytte denne viden har nylige fase 1-forsøg rapporteret øget respons på immun checkpoint-hæmmerterapi i kombination med konventionel kemoterapi ved triple-negative brystkræftformer. Ganske vist er procentdelen af ​​tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) blevet identificeret som en vigtig immunologisk parameter, især for højrisiko brystcancer, der korrelerer med respons på systemisk terapi, hvilket tyder på en stærk rolle af værtens immunrespons i cancerkontrol uanset terapeutisk intervention .

   Begrænsning af immunmodulation - T-celler er nøglespillere i antitumorimmunitet og udgør derfor det vigtigste mål for immunterapeutisk forskning. Det nuværende gennembrud inden for cancerimmunterapi er resultatet af identifikation og målretning af checkpoint-mekanisme, der involverer CTLA-4, PD-1 og PD-L1. CTLA-4 og PD-1 er co-inhiberende receptorer, der findes på overfladen af ​​T-celler. Ved binding til deres tilsvarende ligander (henholdsvis CD 80/86 og PD-L1/L2) bliver T-celler anergiske - en fysiologisk tolerancemekanisme. I sammenhæng med tumormikromiljø kan den afvigende ekspression sammen med kronisk eksponering for tumorantigener føre til uønsket undertrykkelse af T-celleimmunitet.

   Nyligt udviklede checkpoint-blokkere, såsom PD-1/PD-L1-hæmmer, pembrolizumab, har givet et nyt våben mod kræft med holdbare kliniske responser og langsigtede remissioner. Checkpoint-blokade har dog vist sig at være mest effektiv i tumorer med høj mutationsbyrde, i tråd med forestillingen om, at T-celle-genkendelse af neo-antigener spiller en stor rolle i checkpoint-blokade. Mange undersøgelser viser, at når det tumor-reaktive T-celle-infiltrat er fraværende eller lavt (lav procentdel af TIL'er), mangler substratet for checkpoint-blokade. Derudover reagerer flertallet af patienter med såkaldte hypermuterede tumorer ikke på kontrolpunktblokade på grund af immunredigering, hvilket kompromitterer T-cellernes evne til at opfylde deres cytotoksiske aktivitet med tilstrækkelig tumorinfiltration og genkendelse af tumorantigen-belastet HLA-klasse I molekyler. Derfor er det essentielt at forbedre antigenpræsentationen i tumoren for at checkpoint-blokaden er effektiv.

   Ablative terapiers rolle - Især kryoablation: Termisk ablation med kryoterapi, laser, radiofrekvens, mikrobølger og fokuseret ultralyd giver en unik mulighed for at behandle både den primære tumor og den mikrometastatiske sygdom. Effekterne af tumorablation er flerfoldige: (1) ødelæggelse af tumormasse, sænkning af tumorbyrde og (2) frigivelse af tumorantigener, hvilket gør dem tilgængelige for optagelse af antigenpræsenterende celler (APC'er), og selve behandlingen fører til (3) ) frigivelsen af ​​skadesassocierede molekylære mønstre (DAMP'er) og (4) induktionen af ​​et fysiologisk sårhelingsrespons. Ablation fører til oprettelse af et in situ antigen depot indeholdende alle typer tumorprotein, hvilket fører til initiering af systemisk antitumor immunrespons, der potentielt kan eliminere okkult metastatisk sygdom. Ablation af tumorer ved temperaturer over 65 °C fører til denaturering af proteiner. Dette kan påvirke immunresponser på modsatte måder, da høje temperaturer denaturerer immunaktiverende signaler, såsom faresignaler som varmechokproteiner (HSP'er). Derfor er kryoablation den mest lovende ablative teknik, da den giver minimal invasivitet, mindre skade på omgivende væv og bedre bevarelse af tumorantigener og mest robuste data om immunstimulering.

   Immunstimulering påvirket af kryoablation - Dybfrysning og optøning under kryoablation inducerer nekrose og opregulering af DAMP-molekyler, der gør tumorceller mere modtagelige for APC'er og tumorspecifik T-celle-medieret drab. Kryoablation opregulerer DAMP'er, såsom HMG1, calreticulin, S100A8/A9 og HSP70, som stimulerer immunsystemet gennem Receptor for Advanced Glycosylation End-products (RAGE) og toll-lignende receptorer og forbedrer antigenpræsentationen. Derudover er cytokinmiljøet i den centrale zone, der er et resultat af cryoablation, typisk en Th1-cytokinprofil af IL-2, INF-y, TNF-α og IL-12.28 Disse cytokiner og DAMP'er driver formentlig den cytotoksiske CD8+ T-celle respons. Præklinisk evidens, der understøtter immunrespons ved kryoablation: Adskillige prækliniske undersøgelser af kryoimmunologi undersøgte, om frysning af tumoren og efterladelse af den in situ ville gøre dyret modstandsdygtigt over for en genudfordring. Dyremodeller, der anvender carcinom- og sarkomcellelinjer i kaniner og mus, viste tumorspecifik modstand mod genudfordring. Genudfordring med samme tumorcellelinjer viste resistens over for vækst hos dyr efter kryoablation sammenlignet med kirurgisk resektion. Lignende erfaringer blev rapporteret af Blackwood og Cooper med modeller, der involverede rotter inokuleret med myosarcoma og carcinosarcoma cellelinjer. Rotter med kryoablerede tumorer var mere tilbøjelige til at modstå genudfordring og viste regression af sekundære tumorer sammenlignet med kirurgisk behandlede rotter. Bagley et al. sammenlignede kryoablation med kirurgi ved brug af MCA-10 fibrosarkom i C57BL/6-mus, høst af miltlymfocytter med ugentlige intervaller efter behandling for cytotoksicitetsassays. Mus, der undergik cryoablation, havde signifikant højere cytotoksicitet end kirurgisk behandlede eller ubehandlede mus. Sabel et al. undersøgte MT-901 brystadenokarcinomtumorer i BALB/c-mus behandlet med kryoablation eller kirurgisk resektion. Efter genudfordring udviklede 86% af musene, der blev behandlet med kirurgi, anden tumor sammenlignet med 16% af musene, der blev behandlet med kryoablation. Dette var tumorspecifikt, da cryoablationen ikke gav nogen beskyttelse mod udfordring med andre cellelinjer. For nylig har Kim et al. anvendelse af nyrecellecarcinomcellelinjer i BALB/c-mus rapporterede lignende resultater. For nylig er der rapporteret abskopal effekt af tumorregression i ubehandlede tumorer i dyremodeller, hvor kun en af ​​de implanterede tumorer var kryoableret, som et resultat af systemisk immunrespons.

   Klinisk evidens, der understøtter immunrespons af cryoablation: Selvom klinisk brug af cryoablation til cancer for nylig er blevet udvidet, er der relativt få undersøgelser, der undersøger den immunologiske påvirkning hos mennesker. Ravindranath et al. målte niveauet af serumtumorgangliosider og deres antistoftitre hos patienter, der modtog kryoablation, radiofrekvensablation eller resektion af levermetastaser fra kolorektal cancer. Serumgangliosidniveauer var signifikant højere hos cryoablerede patienter sammenlignet med radiofrekvens eller kirurgi. Cryoablerede patienter viste også højere titere af IgM mod tumorgangliosider. Si et al. undersøgte 20 patienter med prostatacancer, der gennemgår cryoablation af primær tumor og rapporterede en stigning i cytolytisk aktivitet mod LNCaP og en stigning i antallet af IFN-ɣ-producerende T-celler. Thakur et al. udførte en pilotundersøgelse af kryoablation og GM-SCF for patienter med nyrecellekarcinom, der er metastaserende til lunge. GM-CSF blev infiltreret nær en lungemetastatisk læsion udvalgt til kryoablation. Yderligere GM-CSF-terapi blev anvendt efter proceduren. Kombinationen af ​​GM-CSF og cryoablation producerede et forbedret immunrespons med hensyn til cytotoksicitet og serumantistoffer.

   Begrænsning af cryoablation: På trods af de data, der er gennemgået ovenfor, har immunresponset på cryoablation ikke været ensartet. Nogle prækliniske undersøgelser af osteogent sarkom og prostatacancermodeller viste ikke nogen stigning i immunfunktionen efter cryoablation. Endnu vigtigere, flere undersøgelser har rapporteret immunsuppression med kryokirurgi. Størstedelen af ​​disse undersøgelser involverede fibrosarkomcellelinjer i rotter og viste nedsat resistens over for genudfordring efter kryoablation samt øget vækst af metastatiske tumorer og sekundære tumorer. Fra et brystkræftperspektiv har Sabel et al. rapporterede, at en høj frysehastighed resulterede i øgede tumorspecifikke T-celler i de tumordrænende lymfeknuder, reduktion i lungemetastaser og forbedret overlevelse sammenlignet med lave frysehastigheder, som også havde flere Tregs (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Derfor har omfanget af systemisk effekt induceret af kryoterapi alene vist sig at være enten utilstrækkelig eller kontraproduktiv. Den nuværende forståelse er, at tæt på den ablative kilde frigiver direkte skade og celledød med nekrose tumorantigener og (DAMP'er), som rekrutterer og aktiverer dendritiske celler, som igen stimulerer proliferation af T-celler og immunkomponenter. Overgangszone væk fra den ablative kilde forårsager indirekte cellulær skade og apoptotisk celledød uden frigivelse af DAMP'er, hvilket forårsager frigivelse af suppressive cytokiner og T-celle klonal deletion og anergi. Intuitivt stimulerer kryoablation et immunrespons, men den ultimative kliniske effekt er dikteret af forholdet mellem CD4+ T-effektorceller og T-regulatoriske celler. Højere forhold mellem T-effektor og T-regulerende celle fremmer det mere gunstige CD8 cytotoksiske T-cellerespons. Mens CD8+ cytotoksiske celler eliminerer den primære tumor og systemiske mikrometastase, er det vigtigt, at anergi holdes i skak, og både effektor- (CD45RO+, CCR7-) og centrale (CCR7+, CD45RO+) hukommelses-T-celler etableres til langsigtet beskyttende anti- tumor immunitet.

   HYPOTESE:

   "Kombination af cryoablation med Pembrolizumab til lokal kontrol ved højrisiko triple negativ brystkræft er overlegen i forhold til kirurgisk resektion alene eller cryoablation alene til at generere antitumor immunrespons".

   METODER:

   Studiested:

   Foreslået sonderende arbejde er et randomiseret forsøg, der vil blive udført ved Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center.

   Type studie:

   Prospektivt randomiseret forsøg - hypotesedrevet

   Eksperimentelt design:

   Vi foreslår et enkelt blindet prospektivt randomiseret forsøg, hvor kvinder med Trin I/II trippel negativ brystkræft vil blive indskrevet i en af ​​de tre arme på 1:1:1 randomiseret måde: (I) Kontrolarm med neoadjuverende kemoterapi efterfulgt af lumpektomi/ mastektomi med sentinel node biopsi +/- aksillær dissektion; (II) Intervention med cryoablation alene efterfulgt af neoadjuverende kemoterapi efterfulgt af lumpektomi/mastektomi med sentinel node biopsi +/- aksillær dissektion; (III) Intervention med kryoablation + Pembrolizumab efterfulgt af neoadjuverende kemoterapi efterfulgt af lumpektomi/mastektomi med sentinel node biopsi +/- aksillær dissektion. Behandlingsplanen er designet til at optimere antigeneksponeringstiden [Figur-2]. Forsøget vil blive registreret hos National Clinical Trials Network, når IRB-godkendelse er opnået.

   Emner:

   Alle patienter 18 år og ældre med klinisk stadium I/II tripel negativ sygdom vil blive tilbudt at deltage. Disse patienter vil blive screenet under en onkologisk/kirurgisk aftale af undersøgelsesteamet. En computerstyret randomiseringsliste vil blive brugt til tildeling af behandlingsarm ved hjælp af hjemmesiden:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Inklusionskriterier:

   • Kvinder
   • Fase I/II Kræft
   • Aldersgruppe 18 - 89 år
   • Diagnoser: Invasivt karcinom, ER -, PR-, HER2- (tredobbelt negativ)
   • Radiologiske fund: Unifokal sygdom synlig på ultralyd

   Ekskluderingskriterier:

   • Yderligere primær cancer
   • Inflammatorisk brystkræft
   • Historie om autoimmun sygdom
   • Anamnese med kronisk immunsuppression
   • Tidligere immunterapi
   • Nylig vaccination (inden for 4 uger.)
   • Forudgående strålebehandling
   • Forudgående behandling med forsøgsmiddel inden for det sidste år
   • Graviditet på tidspunktet for diagnose og/eller behandling
   • Amning

   Studiebesøg:

   Informeret samtykke vil blive indhentet, derefter vil patienten blive randomiseret. Alle besøg vil falde sammen med standard plejebesøg. Dernæst vil følgende ske:

   Besøg 1: Dag 1:

   Baseline Blodtagning; op til 20 ml vil blive opsamlet i EDTA-rør; blodet vil blive centrifugeret ved TTUHSC. Plasma vil blive brugt til cytokinanalyse og fænotypebestemmelse på TTU lab. Et EDTA-rør vil blive sendt til University of Houston (gennem hele studietiden). Følgende resultater vil blive målt:

   Cytokinanalyse

   • RNA-seq PBMC-analyse Baseline-kernebiopsivæv (allerede tilgængelig fra diagnostisk oparbejdning) vil blive evalueret for: (2 ufarvede objektglas vil blive forberedt til RNA-seq fra fikseret væv)
   • TIL %
   • RNA Seq tumorvæv

   Besøg 2 (kun gruppe II og III) efter kryoablation: Dag 3 (+/- 7 dage):

   Blodudtagning efter ablation (Gruppe II & III) - op til 10 ml blod i EDTA-rør:

   • Cytokinanalyse

   Besøg 3 (alle grupper) Præ-neoadjuverende kemoterapi: Dag 21 (+/- 14 dage):

   Blodudtagning på tidspunktet for indsættelse af porten til kemoterapi - op til 20 ml blod i EDTA-rør:

   • Immunfænotypning ved flowcytometri
   • Cytokinanalyse
   • RNA-seq PBMC-analyse
   • Tumorbiopsi vil blive gentaget til TIL- og RNA-seq-analyse

   Besøg 4 (alle grupper): Efter kemoterapi resektion (ca. 6 måneder efter original biopsi):

   Præoperativ blodudtagning til 20 ml blod i EDTA-rør (svarende til baseline):

   • Immunfænotypning ved flowcytometri
   • Cytokinanalyse
   • RNA-seq PBMC-analyse Kirurgisk prøvevævsanalyse (2 ufarvede objektglas fra fikserede væv vil blive forberedt til RNA-seq)
   • TIL %
   • RNA seq tumorvæv

   Prøvestørrelse:

   Tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er), især i stroma af triple negativ brystkræft, er prognostiske og forudsigende for respons på terapi. Derfor blev anbefalinger fra International TILs Working Group brugt til at beregne stikprøvestørrelsen for dette projekt. Den procentvise ændring af TIL'er antages at være 10 % for kontrolarmen og 50 % for behandlingsarmen. En prøve på 10 patienter pr. gruppe kan opnå 80 % kraft til at detektere en gennemsnitlig forskel på 0,4 (0,5 vs. 0,1) med en standardafvigelse på 0,3, ved at bruge en tosidet to-prøve lige varians t-test (alfa=0,05) . Hvis man antager 30 % frafaldsrate, ville i alt 12 patienter i hver arm være tilstrækkeligt til i alt 36 patienter; dette ville opnå en effekt på 90%. Det betyder, at minimum 10 patienter pr. arm og maksimalt 12 patienter pr. arm vil føre til en statistisk meningsfuld undersøgelse.

   Statistisk plan:

   Beskrivende statistik vil blive brugt til at beregne intervaller, middelværdier og varianser for de uafhængige variabler standardpleje, cryo, cryo+pembro. Dette vil antyde, at koncentrationen af ​​observationerne omkring middelværdien og variation af observationerne fra middelværdierne. Normalitetstesten vil blive overvejet for at kontrollere, om data følger normalfordelingen eller ej. Normale kvantil-kvantile plots (også kaldet q-q plots) vil blive brugt til at bestemme, om datasæt kommer fra en normal population. For at detektere afvigelserne (hvis der er nogen) vil flere statistiske mål blive taget i betragtning. For at kontrollere variansens homogenitet for de uafhængige variable standardpleje, cryo, cryo+pembro, vil Levenes test blive udført ved at opstille nul- og alternative hypoteser. For at sammenligne signifikansforskellen mellem variablernes middelværdier vil der blive udført en envejsvariansanalyse (ANOVA). Nul- og alternative hypoteser for midlerne vil blive introduceret. I ANOVA vil statistisk signifikans af middelværdierne blive testet (α = 0,05) ved at bruge F-teststatistikken. Hvis middelværdierne findes statistisk signifikant forskel, vil de post-hoc multiple sammenligningstests blive udført. Post-hoc multiple sammenligningstests (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey osv.) vil blive brugt til at detektere de relevante signifikante gruppemidler. Hvis prøverne ikke opfylder normalitetsantagelserne, vil flere ikke-parametriske tests blive taget i betragtning til de statistiske analyser.

   Tumor kryoablation:

   Alle registrerede patienter vil blive randomiseret til en af ​​undersøgelsens tre arme. Patienter i arm II og III vil modtage kryoablation i henhold til følgende protokol (svarende til den protokol, der blev brugt i ACOSOG Z1072-studiet).

   Kryoablationsenhed: Kryoablation vil blive udført ved hjælp af det kommercielt tilgængelige ProSense kryokirurgiske system (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israel) bestående af en konsol, kryoprobe og tilhørende flydende nitrogen (kryogen) Case Dewars. Konsollen er en selvstændig enhed, der har en grænseflade til styring og overvågning af cryoablationsproceduren. Den fungerer med standard 120 VAC (60Hz) strøm.

   Betjening af enheden: ProSense kryokirurgiske system bruger et lukket system til at cirkulere flydende nitrogen inde i kryoprobens spids, hvilket skaber temperaturer under frysepunktet, der resulterer i ablation af målvæv. Læsionen identificeres med ultralyd, og kryoproben placeres i midten af ​​læsionen under ultralydsvejledning efter tilstrækkelig lokalbedøvelse, og ablation udføres i henhold til en forudbestemt fryse-tø-frys-algoritme. Sonden opvarmes derefter af en intern elektrisk modstandsvarmer og fjernes fra patienten. Kryoablationsprocedure: Tumor identificeres ved hjælp af højopløsnings lineær array ultralydssonde i to ortogonale visninger. Tumorens længste dimension er identificeret for parallel indsættelse af proben. Denne dimension indtastes i konsollen; konsollen giver længden af ​​cryoprobe-spidsen, der skal være forbi læsionen ved indsættelse. Efter indsættelse bekræftes sondepositionen i to ortogonale visninger. Kryoablation udføres ved hjælp af fryse-tø-fryse-cyklussen i henhold til tumorstørrelsen. Hele proceduren overvåges under syn, og saltvand infiltreres for at undgå forfrysninger ved at hydrodissektionere huden væk fra iskuglen. Iskuglens størrelse registreres i ortogonale dimensioner. I vores protokol, hvis en patient har mere end én læsion, vil kun én læsion blive fjernet; dog vil biopsier fra andre læsioner blive undersøgt for abskopal affekt.

   Infusion af Pembrolizumab og dosering:

   Som et indledende trin bekræftede vi sikkerheden og tolerabiliteten af ​​immun checkpoint-hæmmere med tumorkryoablation hos kvinder med nyligt diagnosticeret brystkræft. En vigtig overvejelse var udvælgelse af et immunmodulerende antistof. Pembrolizumab, et FDA-godkendt antistof mod PD-1/PD-L1, har en veletableret sikkerhedsprofil og inducerer langsigtede remissioner, der varer >10 år hos 10-20 % af fremskredne melanompatienter.50 Desuden, fordi T-celler akut opregulerer ekspression af PD-1/PD-L1 efter at være blevet eksponeret for antigener51, som igen kan gøre det cytotoksiske respons sløvet, er pembrolizumab ideelt egnet til immunmodulation i kombination med kryoablation. Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) offentliggjorde en pilotundersøgelse om denne kombination; ingen alvorlige bivirkninger, der kan tilskrives ipilimumab, blev rapporteret; ingen operation blev forsinket. MSKCC brugte 10 mg/kg som en enkelt dosis; men da undersøgelserne rapporterer højere bivirkninger ved den dosis, foreslår vi den anbefalede 200 mg til IV over 90 minutters dosis før cryoablation, som er den aktuelt anvendte dosis i kliniske omgivelser for triple negative cancere.

   Metode til resultatmål:

   Vi vil observere og overvåge immunresponset/-erne efter kryoablationsprocedurerne med og uden pembrolizumab. Blodprøver vil blive opsamlet i EDTA-blodopsamlingsrør og derefter aliquoteret til T-celle fænotypisk analyse og plasmaopsamling for cytokin/kemokin og til RNA-seq-analyse på de angivne tidspunkter. Patologiglas vil blive lavet til forskning fra kernebiopsiprøver ved baseline og fra lumpektomi og sentinel noder på operationstidspunktet. Fem objektglas vil blive lavet pr. prøve (efter afslutning af rutinepatologi) for H&E og immunhistokemi for immuncelleinfiltrater for at beregne TILs procent. Alle samarbejdspartnere/nøglepersonale, der er involveret i at udføre resultatmålsanalysen, vil blive blindet over for randomiseringsgrupperne.

   Følgende er detaljerne for resultatanalyse:

   TIL-beregning: Alle vævsprøver, der gennemgår rutinemæssig patologirapportering, vil blive evalueret for TIL-rapportering i henhold til retningslinjer fremsat af International TILs arbejdsgruppe. Ændring i TIL-score mellem originalt kernebiopsivæv og kirurgisk væv vil være fokus for analysen for at vurdere virkningen af ​​foreslåede indgreb.

   Måling af T-celleændringer i blod: T-celleundertyper kan defineres ved differentiel ekspression af celleoverflademarkører. Vi vil overvåge T-celler for aktivering, øget CD8+ effektor T-celler og udvikling af effektor og central hukommelse. Til fænotypning af T-celler udføres fuldblodsfarvning (100 µl/farvning) med antistoffer mod CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 og Ki67 med passende isotypekontroller.55 Efter RBC-lyse vil de farvede mononukleære celler blive kørt på et Attune NxT 14-farvet flowcytometer (Thermofisher, Waltham, MA) og analyseret ved hjælp af FlowJo-software (Becton, Dickinson and Company). T-celler (CD3+, CD4+ eller CD8+) vil blive analyseret for ændringer i naiv (CD27+, CCR7+, CD45RO-), effektor (CCR7-, CD45RO-), effektorhukommelse (CD27-, CCR7-, CD45RO+) og central hukommelse ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) fænotypiske markører samt for aktivering (ICOS og CD137) og proliferation (Ki67). Vi vil yderligere analysere for procenter af T-regulatoriske celler (CD25+, CD127-). Vi vil bruge disse data til at bestemme en T-celle immunsignatur for at korrelere effektiviteten af ​​cryoabalation+/- Pembrolizumab til at forudsige den langsigtede antitumorimmunitet.

   Plasmacytokin/kemokinanalyse: Vores indledende analyse vil være at bestemme, hvilke cytokiner/kemokiner og hvilke koncentrationer der påvises i blodet efter kryoablation +/- pembrolizumab, og hvordan deres profiler ændres. Vi vil fokusere på de inflammatoriske og hjælpere T-celle cytokinprofiler og hvordan disse cytokiner påvirker og styrer T-celleresponsen. Derudover vil vi se på ændringer i kemokiner. Deres ændrede udtryk i maligniteter har vist sig at diktere leukocytrekruttering og aktivering, angiogenese, cancercelleproliferation og metastasering i alle sygdommens stadier.56 Ved baseline, 24-48 timer efter ablation, mellem præ-kemoterapi, vil blod blive opsamlet og plasmaisoleret ved at centrifugere 1-2 ml blod ved 1-2000 x g i 10 minutter og derefter uddele 120 µl i 0,65 ml mikrocentrifugerør. Standardbehandlingsgruppen vil kun have 3 blodprøvetidspunkter. Plasmaprøver vil blive analyseret med en Bio-Plex 200 hos Eve Technologies Corporation (Calgary, AB Canada) ved hjælp af Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   DATABLAD:

   Se Excel-regneark. RNA-sekvensen vil blive indsamlet som varmekort for differentielt udtrykte gener.

   RISICI:

   Risiko for blodudtagning:

   Risikoen ved en blodprøve omfatter: smerte, ubehag, blødning, blå mærker, rødme, infektion, hvor nålen kommer ind i huden; føler sig svimmel, besvimelse.

   Kryoablationsrelaterede risici:

   Kryoablation har været en meget sikker procedure; PI har rutinemæssigt tilbudt denne procedure til godartede og kræftsygdomme i brystet; indtil videre er 18 kræftpatienter og 36 benigne læsioner blevet udsat for proceduren. Følgende milde komplikationer er blevet rapporteret indtil videre:

   • Blå mærker på ablationsstedet - selvbegrænsende.
   • Smerter - håndteres med OTC-analgetika.
   • Hudnekrose er dog en teoretisk mulighed, hvis man følger procedureprotokollen; vi har aldrig haft denne komplikation.

   Pembrolizumab-relaterede risici:

   Der har været omfattende undersøgelser af toksicitet af immun checkpoint-hæmmere.57 Standard anbefalet dosis for Pemrolizumab er 200 mg IV pr. dosis (godkendt af FDA). Forventede bivirkninger omfatter:

   • Udslæt
   • Diarré
   • Forstoppelse
   • Kvalme
   • Vægttab
   • Tørre øjne
   • Træthed
   • Hovedpine
   • Feber
   • Ledsmerter
   • Skjoldbruskkirtel dysfunktion

   Tab af fortrolighed:

   Alle data vil blive opbevaret i adgangskodebeskyttede filer på CRI's og PI's kontor. Alle data vil blive afidentificeret til kompilering og analyse. Alle protokoller for overholdelse af HIPAA vil blive fulgt. Der er dog minimal risiko for brud på fortroligheden på grund af menneskelige fejl.

   FORDELE:

   Patienterne i arm II og III kan have gavn af at deltage i forsøget. Hvis vores intuition af immunmodulering via kombination af kryoterapi og checkpoint-hæmmer-lægemiddel faktisk påvirker kontrollen af ​​tumor, vil disse to grupper direkte gavne af deltagelse. Kontrolarm I vil dog ikke få gavn af forsøget ud over at give en sammenligningsarm til undersøgelsen. Hovedmålet med den foreslåede undersøgelse er at identificere en ny lavrisikobehandlingstilgang til disse højrisikokræftformer, som i sidste ende vil gavne fremtidige kræftpatienter.

   OVERVÅGNING:

   For at sikre overholdelse af undersøgelsesprotokollen, GCP-retningslinjerne og TTUHSC Human Research Protection Programs forskningspolitikker og -procedurer under udførelsen af ​​undersøgelsen, samt kvalitetsdata, vil en monitor i Clinical Research Institute udføre overvågningen af ​​undersøgelsen. Det første kontrolbesøg vil blive gennemført inden for to uger efter, at det første forsøgsperson er blevet optaget i undersøgelsen. De efterfølgende overvågningsbesøg vil blive planlagt periodisk, men ikke mindre end hver 2. måned, når der er en aktiv studiedeltager, på en gensidigt aftalt tidsramme af PI og undersøgelsesmonitor. Alle indsamlede data vil være 100 % kildedokument verificeret. Undersøgelsesmonitoren kan inspicere og revidere alle undersøgelsesdokumenter, dvs. dataindsamlingsformularer, spørgeskemaer, lægemiddelansvarlighed og lægejournaler inden for de gældende fortrolighedsbestemmelser.

   FINANSIERING:

   Ansøgte om NIH-tilskud R21