Группировка иммуномодуляции с криоаблацией (LOGIC) при раке молочной железы (LOGIC)

ЦЕЛИ:

Основная цель предлагаемого исследования - оценить синергизм криоабляции опухоли и ингибитора иммунных контрольных точек при раке молочной железы высокого риска у людей. Это будет достигнуто путем сравнения криоаблации отдельно и криоаблации в сочетании с пембролизумабом — [ингибитором контрольной точки (антитело к PD-1/PD-L1), в настоящее время одобренным FDA для лечения рака] с текущим стандартом лечения, включая хирургическую резекцию. Нынешний стандарт неоадъювантной/адъювантной терапии останется неизменным по этическим соображениям предоставления наиболее известного стандарта лечения для всех пациентов.

ЦЕЛИ:

Мы предлагаем проспективное рандомизированное исследовательское исследование, в котором пациенты с клинической стадией I/II, трижды негативным инвазивным раком молочной железы, будут рандомизированы в одну из трех групп исследования:

1. Стандарт лечения - неоадъювантная терапия с последующей хирургической резекцией с последующей соответствующей адъювантной терапией по мере необходимости.
2. Рука криоаблации - криоаблация с последующей соответствующей неоадъювантной терапией с последующей хирургической резекцией с последующей соответствующей адъювантной терапией по мере необходимости.

3. Криоаблация пембролизумабом. Однократная доза пембролизумаба 200 мг до (в течение 24-48 часов) криоаблации с последующей соответствующей неоадъювантной терапией с последующей хирургической резекцией и соответствующей адъювантной терапией по мере необходимости.

   Критерии исхода будут включать анализ крови и опухоли на иммунный ответ с проточной цитометрией и анализом цитокинов на исходном уровне, после вмешательства и до операции. Ткани из основной биопсии на исходном уровне, повторной биопсии перед химиотерапией и резекцией опухоли также будут проанализированы на микроокружение опухоли.

   ВВЕДЕНИЕ / ПРЕДЫСТОРИЯ / ЗНАЧЕНИЕ:

   Рак молочной железы высокого риска и потребность в новых подходах к лечению. Трижды негативный рак молочной железы, который составляет 15-20% всех диагнозов рака молочной железы, считается высоким риском. В то время как хирургическая резекция остается основой лечения, терапевтическая основа включает неоадъювантную и адъювантную химиотерапию. Для пациентов, у которых сохраняется значительное остаточное заболевание даже после хирургической резекции и завершения химиотерапии, проводятся дальнейшие агрессивные системные терапии, такие как капецитабин. Тройной негативный подтип связан с наибольшим количеством мутаций в геноме, а неметастатическое заболевание связано с 17-20% локальной неудачей и 35-40% отдаленной неудачей в течение 5-10 лет наблюдения. Эти данные свидетельствуют о том, что микрометастатическое гематогенное распространение происходит у значительного числа пациентов с операбельным раком молочной железы высокого риска, и требуются новые подходы, которые усиливают местный контроль и одновременно контролируют системное распространение болезни.

   Область применения иммуномодуляции. Иммунотерапия рака добилась необычайного успеха в последние десятилетия. Антигены, которые могут вызывать противоопухолевый иммунный ответ, образуют подходящую иммунотерапевтическую мишень. Подход к терапии блокадой контрольных точек Т-клеток показал замечательные клинические ответы при нескольких типах солидных раков, таких как меланома, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря и рак с дефицитом репарации. Считается, что эффективный противоопухолевый иммунный ответ инициируется поглощением опухолевых антигенов антигенпрезентирующими клетками (АРС), которые, в свою очередь, представляют их и передают костимулирующие сигналы как CD4+, так и CD8+ Т-клеткам. АПК, особенно дендритные клетки, обрабатывают антигены посредством экзогенного пути процессинга антигена, при котором материал опухолевых клеток фагоцитируется и превращается в связывающие пептиды HLA класса I и класса II, которые презентируются CD8+ (перекрестная презентация) и CD4+ Т-клеткам соответственно. Используя эти знания, недавние испытания фазы 1 сообщили об усилении ответа на терапию ингибиторами контрольных точек иммунного ответа в сочетании с традиционной химиотерапией при тройном негативном раке молочной железы. Определенно, процент инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) был идентифицирован как важный иммунологический параметр, особенно для рака молочной железы с высоким риском, который коррелирует с ответом на системную терапию, предполагая сильную роль иммунного ответа хозяина в борьбе с раком независимо от терапевтического вмешательства. .

   Ограничение иммуномодуляции. Т-клетки играют ключевую роль в противоопухолевом иммунитете и поэтому являются основной мишенью для иммунотерапевтических исследований. Текущий прорыв в иммунотерапии рака является результатом идентификации и нацеливания на механизм контрольных точек, включающий CTLA-4, PD-1 и PD-L1. CTLA-4 и PD-1 являются коингибирующими рецепторами, обнаруженными на поверхности Т-клеток. При связывании с соответствующими лигандами (CD 80/86 и PD-L1/L2 соответственно) Т-клетки становятся анергическими - физиологический механизм толерантности. В контексте микроокружения опухоли аберрантная экспрессия наряду с хроническим воздействием опухолевых антигенов может привести к нежелательному подавлению Т-клеточного иммунитета.

   Недавно разработанные блокаторы контрольных точек, такие как ингибитор PD-1/PD-L1, пембролизумаб, стали новым оружием против рака с длительными клиническими ответами и длительными ремиссиями. Однако было показано, что блокада контрольных точек наиболее эффективна при опухолях с высокой мутационной нагрузкой, что соответствует представлению о том, что распознавание Т-клетками неоантигенов играет важную роль в блокаде контрольных точек. Многие исследования показывают, что при отсутствии или низком инфильтрате опухолереактивных Т-клеток (низкий процент TIL) отсутствует субстрат для блокады контрольных точек. Кроме того, большинство пациентов с так называемыми гипермутированными опухолями не реагируют на блокаду контрольных точек из-за иммунного редактирования, что ставит под угрозу способность Т-клеток выполнять свою цитотоксическую активность по адекватной инфильтрации опухоли и распознаванию класса HLA, нагруженного опухолевым антигеном. Я молекулы. Следовательно, усиление презентации антигена в опухоли необходимо для эффективности блокады контрольных точек.

   Роль аблативной терапии, особенно криоабляции: термическая абляция с криотерапией, лазером, радиочастотой, микроволновым излучением и сфокусированным ультразвуком представляет собой уникальную возможность воздействовать как на первичную опухоль, так и на микрометастатическое заболевание. Эффекты абляции опухоли многогранны: (1) разрушение опухолевой массы, снижение опухолевой массы и (2) высвобождение опухолевых антигенов, что делает их доступными для поглощения антигенпрезентирующими клетками (АРС), а само лечение приводит к (3 ) высвобождение связанных с повреждением молекулярных паттернов (DAMP) и (4) индукция физиологического ответа на заживление ран. Абляция приводит к созданию депо антигена in situ, содержащему все типы опухолевых белков, что приводит к инициации системного противоопухолевого иммунного ответа, который потенциально может устранить скрытое метастатическое заболевание. Абляция опухолей при температуре выше 65 °С приводит к денатурации белков. Это может влиять на иммунный ответ противоположным образом, поскольку высокие температуры денатурируют сигналы активации иммунитета, такие как сигналы опасности, такие как белки теплового шока (HSP). Таким образом, криоабляция является наиболее многообещающей абляционной техникой, поскольку она предлагает минимальную инвазивность, меньшее повреждение окружающих тканей и лучшее сохранение опухолевых антигенов, а также самые надежные данные об иммунной стимуляции.

   Иммунная стимуляция, вызванная криоаблацией. Глубокое замораживание и оттаивание во время криоаблации вызывают некроз и активацию молекул DAMP, что делает опухолевые клетки более восприимчивыми к APC и опухолеспецифическому уничтожению Т-клеток. Криоаблация активирует DAMP, такие как HMG1, кальретикулин, S100A8/A9 и HSP70, которые стимулируют иммунную систему через рецептор конечных продуктов усиленного гликозилирования (RAGE) и толл-подобные рецепторы и усиливают презентацию антигена. Кроме того, цитокиновая среда центральной зоны, полученная в результате криоабляции, обычно представляет собой цитокиновый профиль Th1 IL-2, INF-γ, TNF-α и IL-12.28 Эти цитокины и DAMP предположительно управляют цитотоксическим ответом Т-клеток CD8+. Доклинические данные, подтверждающие иммунный ответ на криоаблацию: в нескольких доклинических исследованиях по криоиммунологии изучалось, может ли замораживание опухоли и оставление ее на месте сделать животное устойчивым к повторному заражению. Животные модели с использованием клеточных линий карциномы и саркомы у кроликов и мышей продемонстрировали опухолеспецифическую устойчивость к повторному заражению. Повторное заражение теми же опухолевыми клеточными линиями показало резистентность к росту у животных после криоабляции по сравнению с хирургической резекцией. Об аналогичном опыте сообщили Блэквуд и Купер с моделями, включающими крыс, инокулированных клеточными линиями миосаркомы и карциносаркомы. Крысы с криоаблированными опухолями с большей вероятностью сопротивлялись повторному заражению и демонстрировали регрессию вторичных опухолей по сравнению с крысами, подвергшимися хирургическому лечению. Бэгли и др. сравнивали криоабляцию с хирургическим вмешательством при фибросаркоме MCA-10 у мышей C57BL/6, собирая лимфоциты селезенки с недельными интервалами после лечения для анализа цитотоксичности. Мыши, подвергшиеся криоаблации, имели значительно более высокую цитотоксичность, чем мыши, подвергшиеся хирургическому лечению или необработанные. Сабель и др. изучали опухоли аденокарциномы молочной железы MT-901 у мышей BALB/c, получавших криоабляцию или хирургическую резекцию. После повторного заражения у 86% мышей, прошедших хирургическое вмешательство, развились вторые опухоли по сравнению с 16% мышей, прошедших криоабляцию. Это было специфично для опухоли, так как криоабляция не обеспечивала защиты от заражения другими клеточными линиями. Совсем недавно Ким и соавт. использование клеточных линий почечно-клеточной карциномы у мышей BALB/c показало аналогичные результаты. Совсем недавно в результате системного иммунного ответа сообщалось об абскопическом эффекте регрессии опухоли в необработанных опухолях на животных моделях, где только одна из имплантированных опухолей подвергалась криоабляции.

   Клинические данные, подтверждающие иммунный ответ криоаблации: хотя клиническое использование криоаблации для лечения рака в последнее время расширилось, существует относительно мало исследований, изучающих иммунологическое воздействие на людей. Равиндранат и др. измеряли уровень сывороточных опухолевых ганглиозидов и титры антител к ним у пациентов, перенесших криоаблацию, радиочастотную абляцию или резекцию метастазов в печень колоректального рака. Уровни ганглиозидов в сыворотке были значительно выше у пациентов с криоаблацией по сравнению с радиочастотой или хирургическим вмешательством. Пациенты с криоаблацией также продемонстрировали более высокие титры IgM против опухолевых ганглиозидов. Си и др. изучили 20 пациентов с раком предстательной железы, подвергшихся криоабляции первичной опухоли, и сообщили об увеличении цитолитической активности в отношении LNCaP и увеличении количества Т-клеток, продуцирующих IFN-ɣ. Такур и др. провели пилотное исследование криоаблации и GM-SCF у пациентов с метастазами почечно-клеточного рака в легкие. GM-CSF инфильтрировали рядом с метастатическим поражением легкого, выбранным для криоаблации. После процедуры использовалась дополнительная терапия GM-CSF. Комбинация GM-CSF и криоаблации вызывала усиленный иммунный ответ с точки зрения цитотоксичности и сывороточных антител.

   Ограничения криоаблации. Несмотря на рассмотренные выше данные, иммунный ответ на криоаблацию не был однородным. Некоторые доклинические исследования остеогенной саркомы и моделей рака предстательной железы не показали какого-либо повышения иммунной функции после криоаблации. Что еще более важно, в нескольких исследованиях сообщалось о подавлении иммунитета при криохирургии. Большинство этих исследований включало клеточные линии фибросаркомы у крыс и показало снижение устойчивости к повторному заражению после криоаблации, а также увеличение роста метастатических опухолей и вторичных опухолей. С точки зрения рака молочной железы Sabel et al. сообщили, что высокая скорость замораживания приводила к увеличению опухолеспецифических Т-клеток в опухолевых дренирующих лимфатических узлах, уменьшению метастазирования в легкие и улучшению выживаемости по сравнению с низкими скоростями замораживания, которые также имели больше Treg (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Таким образом, величина системного эффекта, вызванного одной только криотерапией, оказалась либо недостаточной, либо контрпродуктивной. Текущее понимание состоит в том, что близко к аблативному источнику, прямое повреждение и гибель клеток с некрозом высвобождают опухолевые антигены и (DAMP), которые рекрутируют и активируют дендритные клетки, которые, в свою очередь, стимулируют пролиферацию Т-клеток и иммунных компонентов. Зона перехода от аблативного источника вызывает непрямое клеточное повреждение и апоптозную гибель клеток без высвобождения DAMP, что вызывает высвобождение подавляющих цитокинов и клональную делецию Т-клеток и анергию. Интуитивно криоабляция стимулирует иммунный ответ, но окончательный клинический эффект определяется соотношением CD4+ Т-эффекторных клеток и Т-регуляторных клеток. Более высокое отношение Т-эффекторов к Т-регуляторным клеткам способствует более благоприятному ответу цитотоксических Т-клеток CD8. В то время как цитотоксические клетки CD8+ устраняют первичную опухоль и системные микрометастазы, важно, чтобы анергия находилась под контролем, а эффекторные (CD45RO+, CCR7-) и центральные (CCR7+, CD45RO+) Т-клетки памяти устанавливались для долговременной защиты от антигена. опухолевый иммунитет.

   ГИПОТЕЗА:

   «Сочетание криоаблации с пембролизумабом для локального контроля при тройном негативном раке молочной железы с высоким риском превосходит только хирургическую резекцию или только криоаблацию в создании противоопухолевого иммунного ответа».

   МЕТОДЫ:

   Место обучения:

   Предлагаемая исследовательская работа представляет собой рандомизированное исследование, которое будет проводиться в Центре медицинских наук Техасского технологического университета — Центре передового опыта в области молочной железы, Онкологическом центре UMC.

   Тип исследования:

   Проспективное рандомизированное исследование - основано на гипотезе

   Экспериментальная дизайн:

   Мы предлагаем одно слепое проспективное рандомизированное исследование, в котором женщины с тройным негативным раком молочной железы стадии I/II будут включены в одну из трех групп рандомизированным образом 1:1:1: (I) контрольная группа с неоадъювантной химиотерапией с последующей лампэктомией/ мастэктомия с биопсией сторожевого узла +/- подмышечная диссекция; (II) Вмешательство только с криоаблацией с последующей неоадъювантной химиотерапией с последующей лампэктомией/мастэктомией с биопсией сторожевого узла +/- подмышечная диссекция; (III) Вмешательство с криоабляцией + пембролизумаб с последующей неоадъювантной химиотерапией с последующей лампэктомией/мастэктомией с биопсией сторожевого узла +/- подмышечная диссекция. График лечения предназначен для оптимизации времени воздействия антигена [Рисунок 2]. Испытание будет зарегистрировано в Национальной сети клинических испытаний после получения одобрения IRB.

   Предметы:

   Всем пациентам в возрасте 18 лет и старше с клиническими стадиями трижды негативного заболевания I/II будет предложено принять участие. Эти пациенты будут обследованы исследовательской группой во время посещения онкологического/хирургического отделения. Компьютеризированный список рандомизации будет использоваться для назначения группы лечения с использованием веб-сайта:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Критерии включения:

   • Женщины
   • Рак I/II стадии
   • Возрастной диапазон 18 - 89 лет
   • Диагнозы: Инвазивная карцинома, ER-, PR-, HER2- (тройной негатив)
   • Рентгенологические данные: одноочаговое заболевание видно на УЗИ.

   Критерий исключения:

   • Дополнительный первичный рак
   • Воспалительный рак молочной железы
   • История аутоиммунного заболевания
   • История хронической иммуносупрессии
   • Предшествующая иммунотерапия
   • Недавняя вакцинация (в течение 4 нед.)
   • Предшествующая лучевая терапия
   • Предшествующая терапия исследуемым агентом в течение последнего 1 года
   • Беременность на момент постановки диагноза и/или лечения
   • Грудное вскармливание

   Учебные визиты:

   Будет получено информированное согласие, после чего пациент будет рандомизирован. Все посещения будут совпадать со стандартными посещениями по уходу. Далее произойдет следующее:

   Визит 1: День 1:

   Базовый забор крови; в пробирки с ЭДТА будет собрано до 20 мл; кровь будет центрифугирована в TTUHSC. Плазма будет использоваться для анализа цитокинов и фенотипирования в лаборатории ТТУ. Одна пробирка с ЭДТА будет отправлена ​​в Хьюстонский университет (на протяжении всего периода исследования). Будут измеряться следующие результаты:

   Цитокиновый анализ

   • Анализ секвенирования РНК РВМС Исходная ткань основной биопсии (уже полученная в результате диагностического исследования) будет оцениваться на предмет: (будут подготовлены 2 неокрашенных предметных стекла для секвенирования РНК из фиксированной ткани)
   • ТИЛ %
   • опухолевая ткань РНК Seq

   Визит 2 (только группы II и III) После криоаблации: День 3 (+/- 7 дней):

   Забор крови после аблации (группа II и III) – до 10 мл крови в пробирках с ЭДТА:

   • Анализ цитокинов

   Посещение 3 (все группы) Предварительная неоадъювантная химиотерапия: День 21 (+/- 14 дней):

   Забор крови во время введения порта для химиотерапии – до 20 мл крови в пробирках с ЭДТА:

   • Иммунное фенотипирование методом проточной цитометрии
   • Цитокиновый анализ
   • Анализ секвенирования РНК PBMC
   • Биопсия опухоли будет повторена для анализа последовательностей TIL и РНК.

   Визит 4 (все группы): Резекция после химиотерапии (примерно через 6 месяцев после первоначальной биопсии):

   Предоперационный забор крови – до 20 мл крови в пробирки с ЭДТА (аналогично исходному уровню):

   • Иммунное фенотипирование методом проточной цитометрии
   • Цитокиновый анализ
   • Секвенирование РНК Анализ РВМС Хирургический анализ ткани (2 неокрашенных слайда из фиксированных тканей будут подготовлены для секвенирования РНК)
   • до%
   • РНК секвенирование опухолевой ткани

   Размер образца:

   Опухолеинфильтрирующие лимфоциты (TIL), особенно в строме трижды негативного рака молочной железы, являются прогностическим фактором ответа на терапию. Поэтому для расчета размера выборки для этого проекта были использованы рекомендации Международной рабочей группы по TIL. Предполагается, что процентное изменение TIL составляет 10 % для контрольной группы и 50 % для лечебной группы. Выборка из 10 пациентов в группе может достичь мощности 80% для обнаружения средней разницы 0,4 (0,5 против 0,1) со стандартным отклонением 0,3 с использованием двустороннего двухвыборочного t-критерия равной дисперсии (альфа = 0,05) . Предполагая, что показатель отсева составляет 30%, всего 12 пациентов в каждой группе будет достаточно для 36 пациентов; это позволит достичь 90% мощности. Это означает, что минимум 10 пациентов в группе и максимум 12 пациентов в группе приведут к статистически значимому исследованию.

   Статистический план:

   Описательная статистика будет использоваться для расчета диапазонов, средних значений и отклонений для независимых переменных стандартная помощь, крио, крио + пембро. Это предполагает, что концентрация наблюдений вокруг среднего значения и отклонение наблюдений от среднего значения. Тест на нормальность будет использоваться для проверки того, соответствуют ли данные нормальному распределению. Нормальные графики квантилей-квантилей (также называемые графиками q-q) будут использоваться для определения того, получены ли наборы данных из нормальной совокупности. Для обнаружения выбросов (если они есть) будут приняты во внимание несколько статистических показателей. Для проверки однородности дисперсий независимых переменных стандартная помощь, крио, крио+пембро будет проведен тест Левена путем постановки нулевой и альтернативной гипотез. Чтобы сравнить разницу значимости между средними значениями переменных, будет выполнен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Будут введены нулевая и альтернативная гипотезы для средних. В ANOVA будет проверена статистическая значимость средних значений (α = 0,05) с использованием статистики F-критерия. Если в средних значениях будет обнаружено статистически значимое различие, будут проведены апостериорные тесты множественных сравнений. Последующие тесты множественных сравнений (LSD, Бонферрони, Шеффе, Тьюки и т. д.) будут использоваться для определения соответствующих средних значений значимой группы. Если выборки не соответствуют предположениям о нормальности, то для статистического анализа будет рассмотрено несколько непараметрических тестов.

   Криоабляция опухоли:

   Все зарегистрированные пациенты будут рандомизированы в одну из трех групп исследования. Пациентам в группах II и III будет проведена криоаблация в соответствии со следующим протоколом (аналогичным протоколу, используемому в исследовании ACOSOG Z1072).

   Устройство для криоаблации: Криоаблация будет проводиться с использованием имеющейся в продаже криохирургической системы ProSense (IceCure Medical Ltd, Кесария, Израиль), состоящей из консоли, криозонда и связанного жидкого азота (криогена) Case Dewars. Консоль представляет собой автономное устройство с интерфейсом для контроля и мониторинга процедуры криоаблации. Он работает со стандартной мощностью 120 В переменного тока (60 Гц).

   Работа устройства: Криохирургическая система ProSense использует закрытую систему для циркуляции жидкого азота внутри наконечника криозонда, создавая температуры ниже точки замерзания, что приводит к абляции ткани-мишени. Поражение идентифицируют с помощью ультразвука, криозонд помещают в центр поражения под ультразвуковым контролем после адекватной местной анестезии, а аблацию проводят в соответствии с заданным алгоритмом замораживания-оттаивания-замораживания. Затем датчик нагревается внутренним электрическим нагревателем сопротивления и удаляется от пациента. Процедура криоаблации. Опухоль идентифицируют с помощью линейного ультразвукового датчика высокого разрешения в двух ортогональных проекциях. При параллельном введении зонда определяется самый длинный размер опухоли. Это измерение вводится в консоль; на консоли указана длина наконечника криозонда, который должен пройти над поражением при введении. После введения положение зонда подтверждается в двух ортогональных проекциях. Криоаблацию проводят с использованием цикла замораживания-оттаивания-замораживания в зависимости от размера опухоли. Всю процедуру контролируют под визуальным контролем, и во избежание обморожения кожи вводят физиологический раствор путем гидрорассечения кожи вдали от ледяного шарика. Размер ледяного шара записан в ортогональных измерениях. В нашем протоколе, если у пациента имеется более одного очага, абляции будет подвергаться только один очаг; однако биопсии из других поражений будут изучаться на наличие абскопального эффекта.

   Инфузия пембролизумаба и дозировка:

   В качестве начального шага мы подтвердили безопасность и переносимость ингибиторов иммунных контрольных точек с помощью криоабляции опухоли у женщин с недавно диагностированным раком молочной железы. Одним из важных соображений был выбор иммуномодулирующего антитела. Пембролизумаб, одобренное FDA антитело против PD-1/PD-L1, имеет хорошо зарекомендовавший себя профиль безопасности и вызывает длительные ремиссии продолжительностью более 10 лет у 10-20% пациентов с запущенной меланомой.50 Кроме того, поскольку Т-клетки резко усиливают экспрессию PD-1/PD-L1 после воздействия антигенов,51 что, в свою очередь, может притупить цитотоксический ответ, пембролизумаб идеально подходит для иммуномодуляции в сочетании с криоабляции. Мемориальный онкологический центр имени Слоуна-Кеттеринга (MSKCC) опубликовал пилотное исследование этой комбинации; о серьезных побочных эффектах, связанных с ипилимумабом, не сообщалось; ни одна операция не была отложена. MSKCC использовал 10 мг/кг в качестве разовой дозы; однако, поскольку исследования сообщают о более высоких побочных эффектах при этой дозе, мы предлагаем рекомендуемую дозу 200 мг для внутривенного введения в течение 90 минут до криоаблации, которая в настоящее время используется в клинических условиях для тройного негативного рака.

   Методология оценки результатов:

   Мы будем наблюдать и контролировать иммунный ответ (реакции) после процедур криоабляции с пембролизумабом и без него. Образцы крови будут собраны в пробирки для сбора крови с ЭДТА, а затем разделены на аликвоты для фенотипического анализа Т-клеток и сбора плазмы на цитокин/хемокин и для анализа секвенирования РНК в указанные моменты времени. Слайды патологии будут сделаны для исследования образцов основной биопсии на исходном уровне, а также лампэктомии и сигнальных лимфоузлов во время операции. Для каждого образца (после завершения обычной патологии) будет сделано пять слайдов для H&E и иммуногистохимии для инфильтратов иммунных клеток для расчета процента TIL. Все сотрудники/ключевой персонал, участвующие в проведении анализа показателей результатов, не будут знать группы рандомизации.

   Ниже приведены подробности для анализа результатов:

   Расчет TIL: Все образцы тканей, которые проходят стандартную отчетность о патологии, будут оцениваться для отчета TIL в соответствии с рекомендациями, разработанными Международной рабочей группой TIL. Изменение показателя TIL между исходной тканью основной биопсии и хирургической тканью будет в центре внимания анализа для оценки воздействия предлагаемых вмешательств.

   Измерение изменений Т-клеток в крови: Подтипы Т-клеток можно определить по дифференциальной экспрессии маркеров клеточной поверхности. Мы будем следить за активацией Т-клеток, увеличением количества эффекторных Т-клеток CD8+ и развитием эффекторной и центральной памяти. Для фенотипирования Т-клеток будет проведено окрашивание цельной крови (100 мкл/окраска) антителами к CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 и Ki67 с соответствующими изотипическими контролями.55 После лизиса эритроцитов окрашенные мононуклеары прогоняют на 14-цветном проточном цитометре Attune NxT (Thermofisher, Waltham, MA) и анализируют с использованием программного обеспечения FlowJo (Becton, Dickinson and Company). Т-клетки (CD3+, CD4+ или CD8+) будут проанализированы на предмет изменений наивной (CD27+, CCR7+, CD45RO-), эффекторной (CCR7-, CD45RO-), эффекторной памяти (CD27-, CCR7-, CD45RO+) и центральной памяти ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) фенотипических маркеров, а также для активации (ICOS и CD137) и пролиферации (Ki67). Далее мы проанализируем процент Т-регуляторных клеток (CD25+, CD127-). Мы будем использовать эти данные для определения Т-клеточной иммунной сигнатуры, чтобы сопоставить эффективность криоаблации +/- пембролизумаб для прогнозирования долгосрочного противоопухолевого иммунитета.

   Анализ цитокинов/хемокинов плазмы. Наш первоначальный анализ будет заключаться в том, чтобы определить, какие цитокины/хемокины и какие концентрации обнаруживаются в крови после криоаблации +/- пембролизумаб и как изменяются их профили. Мы сосредоточимся на профилях цитокинов воспалительных и хелперных Т-клеток и на том, как эти цитокины влияют и направляют ответ Т-клеток. Кроме того, мы рассмотрим изменения в хемокинах. Было показано, что их измененная экспрессия при злокачественных новообразованиях диктует привлечение и активацию лейкоцитов, ангиогенез, пролиферацию раковых клеток и метастазирование на всех стадиях заболевания.56 На исходном уровне, через 24-48 часов после абляции, между предварительной химиотерапией, будет собираться кровь и выделяться плазма путем центрифугирования 1-2 мл крови при 1-2000 x g в течение 10 минут, а затем аликвоты 120 мкл в микроцентрифужные пробирки объемом 0,65 мл. Стандартная группа лечения будет иметь только 3 точки времени взятия проб крови. Образцы плазмы будут проанализированы с помощью Bio-Plex 200 в Eve Technologies Corporation (Калгари, AB, Канада) с использованием 14-плексного массива обнаружения человеческих Т-клеток высокой чувствительности (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12р70, ИЛ-13, ИЛ-17А, ИЛ-23, ФНО-а.

   ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ:

   См. Таблицу Excel. Последовательность РНК будет собрана в виде тепловых карт для дифференциально экспрессируемых генов.

   РИСКИ:

   Риски забора крови:

   Риски взятия крови включают: боль, дискомфорт, кровотечение, кровоподтеки, покраснение, инфекцию в месте проникновения иглы под кожу; чувство головокружения, обмороки.

   Риски, связанные с криоаблацией:

   Криоабляция была очень безопасной процедурой; PI регулярно предлагает эту процедуру при доброкачественных и раковых заболеваниях молочной железы; на данный момент этой процедуре подверглись 18 больных раком и 36 доброкачественных новообразований. До сих пор сообщалось о следующих легких осложнениях:

   • Синяк в месте абляции - самокупирующийся.
   • Боль - купируется безрецептурными анальгетиками.
   • Однако некроз кожи теоретически возможен в соответствии с протоколом процедуры; у нас никогда не было этого осложнения.

   Риски, связанные с пембролизумабом:

   Были проведены обширные исследования токсичности ингибиторов иммунных контрольных точек.57 Стандартная рекомендуемая доза пемролизумаба составляет 200 мг в/в на дозу (одобрено FDA). Ожидаемые побочные эффекты включают:

   • Сыпь
   • Диарея
   • Запор
   • Тошнота
   • Потеря веса
   • Сухие глаза
   • Усталость
   • Головная боль
   • Высокая температура
   • Боль в суставах
   • Дисфункция щитовидной железы

   Потеря конфиденциальности:

   Все данные будут храниться в защищенных паролем файлах в офисе CRI и PI. Все данные будут деидентифицированы для компиляции и анализа. Будут соблюдены все протоколы соответствия HIPAA. Однако минимальный риск нарушения конфиденциальности возможен из-за человеческой ошибки.

   ПРЕИМУЩЕСТВА:

   Пациенты из группы II и III могут получить пользу от участия в исследовании. Если наша интуиция об иммуномодуляции с помощью комбинации криотерапии и препарата-ингибитора контрольных точек действительно влияет на контроль над опухолью, эти две группы получат непосредственную пользу от участия. Тем не менее, контрольная группа I не получит пользы от исследования, кроме предоставления группы сравнения для исследования. Основная цель предлагаемого исследования - определить новый подход к лечению этих раковых заболеваний с низким риском, который в конечном итоге принесет пользу будущим онкологическим больным.

   МОНИТОРИНГ:

   Чтобы обеспечить соответствие протоколу исследования, руководствам GCP и исследовательским политикам и процедурам Программы защиты исследований человека TTUHSC во время проведения исследования, а также качественным данным, наблюдатель в Институте клинических исследований будет проводить мониторинг исследования. Первый контрольный визит будет проведен в течение двух недель после того, как первый субъект будет включен в исследование. Последующие визиты для мониторинга будут планироваться периодически, но не реже, чем каждые 2 месяца, если есть активный участник исследования, в сроки, взаимно согласованные PI и наблюдателем исследования. Все собранные данные будут на 100% проверены исходным документом. Наблюдатель за исследованием может проверять и проверять все документы исследования, т. е. формы для сбора данных, анкеты, отчетность о лекарствах и медицинские записи в соответствии с применимыми правилами конфиденциальности.

   ФИНАНСИРОВАНИЕ:

   Подал заявку на грант NIH R21