유방암에 대한 냉동절제(LOGIC)를 통한 면역 조절 그룹화 (LOGIC)

목표:

제안된 연구의 주요 목표는 인간의 고위험 유방암에서 종양 냉동 절제술과 면역 관문 억제제의 시너지 효과를 평가하는 것입니다. 이는 냉동절제술 단독과 [현재 FDA에서 암 치료제로 승인된 체크포인트 억제제(항 PD-1/PD-L1 항체)]인 펨브롤리주맙과 함께 냉동절제술을 외과적 절제를 포함한 현재 치료 표준과 비교함으로써 달성될 것입니다. 신보조/보조 요법의 현재 표준은 모든 환자에게 가장 잘 알려진 표준 치료를 제공한다는 윤리적 이유로 변경되지 않습니다.

목표:

우리는 임상 1기/2기 삼중 음성 침윤성 유방암 환자가 연구의 세 가지 부문 중 하나에 무작위 배정되는 전향적 무작위 탐색 시험을 제안합니다.

1. 치료 표준 - 신보강 요법에 이어 외과적 절제 후 필요에 따라 적절한 보조 요법이 뒤따릅니다.
2. 냉동절제 팔 - 냉동절제 후 적절한 신보강 요법, 외과적 절제, 필요에 따라 적절한 보조 요법.

3. 펨브롤리주맙을 사용한 동결 절제 - 동결 절제 전(24-48시간 이내) 펨브롤리주맙 200mg의 단일 용량, 적절한 신보조 요법, 수술 절제, 필요에 따라 적절한 보조 요법.

   결과 측정에는 베이스라인, 개입 후 및 수술 전 유세포 분석 및 사이토카인 분석을 통한 면역 반응의 혈액 및 종양 분석이 포함됩니다. 기준선에서 코어 생검으로부터의 조직, 화학요법 및 종양 절제 전 반복 생검은 또한 종양 미세환경에 대해 분석될 것이다.

   소개 / 배경 / 의의:

   고위험 유방암 및 새로운 치료 접근법의 필요성: 모든 유방암 진단의 15-20%를 차지하는 삼중 음성 유방암은 고위험으로 간주됩니다. 외과적 절제술이 치료의 주류로 남아 있지만, 치료 백본에는 신보강 및 보조 화학요법이 포함됩니다. 수술적 절제와 화학요법 종료 후에도 유의미한 잔존질환이 지속되는 환자에 대해서는 카페시타빈과 같은 보다 적극적인 전신요법을 시행한다. 삼중 음성 하위 유형은 게놈 전체에서 가장 많은 수의 돌연변이와 관련이 있으며 비전이성 질환은 5-10년 추적 조사에서 17-20%의 국소 실패 및 35-40%의 원격 실패와 관련이 있습니다. 이러한 데이터는 수술 가능한 고위험 유방암 환자의 상당한 수에서 미세전이성 혈행성 확산이 발생하며 국소 제어를 강화하는 동시에 질병의 전신 확산을 제어하는 ​​새로운 접근 방식이 필요함을 시사합니다.

   면역 조절 범위: 암 면역 요법은 최근 수십 년 동안 엄청난 성공을 거두었습니다. 항종양 면역 반응을 유발할 수 있는 항원은 적합한 면역치료 표적을 형성합니다. T 세포 체크포인트 차단 요법의 접근 방식은 흑색종, 비소세포 폐암, 방광암 및 불일치 복구 결핍 암과 같은 여러 유형의 고형 암에서 놀라운 임상 반응을 보여주었습니다. 효과적인 항종양 면역 반응은 항원 제시 세포(APC)가 종양 항원을 흡수함으로써 시작되는 것으로 생각되며, APC는 종양 항원을 제시하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에 공동 자극 신호를 제공합니다. APC, 특히 수지상 세포는 종양 세포 물질이 식균되고 각각 CD8+(교차 제시) 및 CD4+ T 세포에 제시되는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 펩티드로 전환되는 외인성 항원 처리 경로를 통해 항원을 처리합니다. 이 지식을 활용하여 최근 1상 시험에서 삼중 음성 유방암에서 기존 화학 요법과 병용한 면역 관문 억제제 요법에 대한 반응이 향상되었다고 보고되었습니다. 확실히, 종양 침윤성 림프구(TIL)의 백분율은 특히 고위험 유방암의 경우 전신 요법에 대한 반응과 상관관계가 있는 중요한 면역학적 매개변수로 확인되었으며, 이는 치료 개입과 상관없이 암 조절에서 숙주 면역 반응의 강력한 역할을 시사합니다. .

   면역 조절의 한계 - T 세포는 항종양 면역의 핵심 역할을 하므로 면역 치료 연구의 주요 대상이 됩니다. 암 면역 요법의 현재 돌파구는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1과 관련된 체크포인트 메커니즘의 식별 및 표적화에서 비롯됩니다. CTLA-4 및 PD-1은 T 세포 표면에서 발견되는 공동 억제 수용체입니다. T 세포는 상응하는 리간드(각각 CD 80/86 및 PD-L1/L2)에 결합하면 내성의 생리학적 메커니즘인 무감각 상태가 됩니다. 종양 미세 환경의 맥락에서 종양 항원에 대한 만성 노출과 함께 비정상적인 발현은 T 세포 면역의 바람직하지 않은 억제를 초래할 수 있습니다.

   PD-1/PD-L1 억제제인 ​​pembrolizumab과 같은 최근에 개발된 관문 차단제는 지속적인 임상 반응과 장기적인 완화로 암에 대한 새로운 무기를 제공합니다. 그러나 신항원의 T 세포 인식이 체크포인트 차단에 중요한 역할을 한다는 개념과 일치하여 체크포인트 차단은 돌연변이 부담이 높은 종양에서 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 많은 연구에서 종양 반응성 T 세포 침윤이 없거나 낮을 때(TIL의 낮은 비율) 체크포인트 차단을 위한 기질이 부족하다는 것을 보여줍니다. 또한, 소위 과돌연변이 종양을 가진 대부분의 환자는 면역 편집으로 인한 체크포인트 차단에 반응하지 않으며, 이는 적절한 종양 침윤 및 종양 항원 부하 HLA 클래스 인식의 세포독성 활동을 수행하는 T 세포의 능력을 손상시킵니다. 나 분자. 따라서 종양 내에서 항원 제시를 강화하는 것은 체크포인트 차단이 효과적이기 위해 필수적입니다.

   절제 요법의 역할 - 특히 냉동절제: 냉동요법, 레이저, 고주파, 마이크로웨이브 및 집속 초음파를 이용한 열 절제는 원발성 종양과 미세전이성 질환을 모두 해결할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 종양 절제의 효과는 여러 가지입니다. (1) 종양 덩어리의 파괴, 종양 부담 감소 및 (2) 종양 항원의 방출로 항원 제시 세포(APC)에 의한 흡수가 가능하도록 하며 치료 자체는 (3 ) 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 방출 및 (4) 생리학적 상처 치유 반응의 유도. 절제는 모든 유형의 종양 단백질을 포함하는 in situ 항원 저장소의 생성으로 이어지며 잠재적으로 잠재 전이성 질환을 제거할 수 있는 전신 항종양 면역 반응의 개시로 이어집니다. 65 °C 이상의 온도에서 종양을 절제하면 단백질이 변성됩니다. 이것은 고온이 열 충격 단백질(HSP)과 같은 위험 신호와 같은 면역 활성화 신호를 변성시키기 때문에 반대 방식으로 면역 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 cryoablation은 최소 침습성, 주변 조직에 대한 손상 감소, 종양 항원의 더 나은 보존 및 면역 자극에 대한 가장 강력한 데이터를 제공하기 때문에 가장 유망한 절제 기술입니다.

   냉동절제에 의한 면역 자극 - 냉동절제 동안의 깊은 동결 및 해동은 종양 세포를 APC 및 종양 특이적 T 세포 매개 살해에 더 취약하게 만드는 DAMP 분자의 괴사와 상향 조절을 유도합니다. Cryoablation은 HMG1, calreticulin, S100A8/A9 및 HSP70과 같은 DAMP를 상향 조절하며, 이는 최종 당화 최종 제품에 대한 수용체(RAGE) 및 톨 유사 수용체에 대한 수용체를 통해 면역 체계를 자극하고 항원 제시를 향상시킵니다. 또한, 저온 절제로 인한 중앙 영역 사이토카인 환경은 일반적으로 IL-2, INF-γ, TNF-α 및 IL-12.28의 Th1 사이토카인 프로필입니다. 이러한 사이토카인과 DAMP는 아마도 세포독성 CD8+ T 세포 반응을 유도합니다. 냉동 절제의 면역 반응을 뒷받침하는 전임상 증거: 냉동 면역학에 대한 여러 전임상 연구에서 종양을 동결하고 제자리에 두는 것이 동물이 재도전에 대한 내성을 갖게 하는지 여부를 조사했습니다. 토끼와 생쥐의 암종과 육종 세포주를 활용한 동물 모델은 재공격에 대한 종양 특이적 저항성을 입증했습니다. 동일한 종양 세포주에 대한 재도전은 외과적 절제와 비교하여 냉동절제 후 동물의 성장에 대한 저항성을 나타냈습니다. 유사한 경험이 근육종 및 암육종 세포주로 접종된 쥐를 포함하는 모델에 대해 Blackwood 및 Cooper에 의해 보고되었습니다. 냉동 절제된 종양이 있는 쥐는 재도전에 저항할 가능성이 더 높았으며 외과적으로 치료받은 쥐에 비해 이차 종양의 퇴행을 입증했습니다. Bagleyet al. C57BL/6 마우스에서 MCA-10 섬유육종을 사용하여 세포독성 분석을 위한 치료 후 매주 간격으로 비장 림프구를 채취하여 냉동 절제술과 수술을 비교했습니다. cryoablation을 겪고 있는 마우스는 외과적으로 치료되거나 치료되지 않은 마우스보다 훨씬 더 높은 세포 독성을 보였습니다. Sabelet al. 냉동절제술 또는 외과적 절제술로 치료받은 BALB/c 마우스에서 MT-901 유선 선암종 종양을 연구했습니다. 재도전 후, 수술을 받은 쥐의 86%에서 두 번째 종양이 발생한 반면 냉동절제술을 받은 쥐는 16%에서 발생했습니다. 냉동절제술이 다른 세포주와의 공격에 대해 보호를 제공하지 않았기 때문에 이것은 종양 특이적이었습니다. 최근에는 Kim et al. BALB/c 마우스에서 신장 세포 암종 세포주를 사용하여 유사한 결과를 보고했습니다. 보다 최근에는 이식된 종양 중 하나만 냉동 절제된 동물 모델에서 치료되지 않은 종양에서 종양 퇴행의 전신 효과가 전신 면역 반응의 결과로 보고되었습니다.

   cryoablation의 면역 반응을 뒷받침하는 임상 증거: 최근 암에 대한 cryoablation의 임상적 사용이 확대되었지만 인간의 면역학적 영향을 조사한 연구는 상대적으로 적습니다. Ravindranathet al. 결장직장암으로 인한 간 전이 절제술, 고주파 절제술 또는 절제술을 받은 환자에서 혈청 종양 강글리오시드 수준과 항체 역가를 측정했습니다. 혈청 강글리오사이드 수치는 고주파 또는 수술에 비해 냉동 절제된 환자에서 유의하게 더 높았습니다. Cryoablated 환자는 또한 종양 강글리오사이드에 대한 IgM의 더 높은 역가를 보여주었습니다. Si et al. 원발성 종양의 냉동절제술을 받는 전립선암 환자 20명을 연구한 결과 LNCaP에 대한 세포용해 활동의 증가와 IFN-ɣ 생산 T 세포의 수가 증가했다고 보고했습니다. Thakur et al. 폐로 전이된 신장 세포 암종 환자를 대상으로 냉동절제 및 GM-SCF에 대한 파일럿 연구를 수행했습니다. GM-CSF는 동결 절제를 위해 선택된 폐 전이성 병변 근처에 침윤되었습니다. 추가 GM-CSF 요법은 시술 후 사용되었습니다. GM-CSF와 냉동 절제의 조합은 세포 독성 및 혈청 항체 측면에서 향상된 면역 반응을 생성했습니다.

   냉동 절제술의 한계: 위에서 검토한 데이터에도 불구하고 냉동 절제술에 대한 면역 반응은 균일하지 않았습니다. 골육종 및 전립선암 모델에 대한 일부 전임상 연구에서는 냉동절제 후 면역 기능의 증가를 보여주지 못했습니다. 더 중요한 것은 여러 연구에서 냉동 수술로 인한 면역 억제를 보고한 것입니다. 이러한 연구의 대부분은 쥐의 섬유육종 세포주와 관련이 있으며 냉동절제 후 재도전 저항성이 감소하고 전이성 종양 및 이차 종양의 성장이 증가하는 것으로 나타났습니다. 유방암 관점에서 Sabel et al. Treg(CD3, CD4, CD127-, CD25+)가 더 많은 낮은 동결 속도에 비해 높은 동결 속도는 종양 배액 림프절에서 종양 특이적 T 세포 증가, 폐 전이 감소 및 생존율 향상을 가져왔다고 보고했습니다. 따라서 냉동 요법만으로 유도되는 전신 효과의 크기는 불충분하거나 역효과를 낳는 것으로 입증되었습니다. 현재의 이해는 절제 소스에 가까운 직접적인 손상과 괴사로 인한 세포 사멸이 종양 항원과 수지상 세포를 모집하고 활성화하여 T 세포와 면역 구성 요소의 증식을 자극하는 종양 항원(DAMP)을 방출한다는 것입니다. 절제 소스에서 멀어지는 전이 영역은 DAMP의 방출 없이 간접적인 세포 손상 및 세포자살 세포 사멸을 유발하며, 이는 억제성 사이토카인 및 T 세포 클론 결실 및 아네르기의 방출을 유발합니다. 직관적으로 cryoablation은 면역 반응을 자극하지만 궁극적인 임상 영향은 T 조절 세포에 대한 CD4+ T 효과기 세포의 비율에 의해 결정됩니다. T-조절 세포 비율에 대한 T-이펙터의 비율이 높을수록 더 유리한 CD8 세포독성 T 세포 반응이 촉진됩니다. CD8+ 세포독성 세포가 원발성 종양 및 전신 미세전이를 제거하는 동안, anergy를 억제하고 효과기(CD45RO+, CCR7-) 및 중추(CCR7+, CD45RO+) 기억 T-세포 모두 장기 보호 항-암 종양 면역.

   가설:

   "고위험 삼중음성 유방암의 국소 조절을 위한 냉동절제술과 Pembrolizumab의 병용은 항종양 면역 반응을 생성하는 데 있어서 외과적 절제술 단독 또는 냉동절제술 단독보다 우수합니다."

   행동 양식:

   연구 장소:

   제안된 탐색 작업은 Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center에서 수행될 무작위 시험입니다.

   연구 유형:

   전향적 무작위 시험 - 가설 기반

   실험적 설계:

   우리는 1기/2기 삼중 음성 유방암을 가진 여성이 1:1:1 무작위 방식으로 3개 군 중 하나에 등록되는 단일 맹검 전향적 무작위 시험을 제안합니다. 센티넬 노드 생검 +/- 액와 절제술을 통한 유방 절제술; (II) 냉동절제 단독 중재 후 신보조적 화학요법 후 감시림프절 생검 +/- 액와 절제술과 함께 종괴절제술/유방절제술; (III) 냉동절제술 + 펨브롤리주맙에 이어 신보강 화학요법에 이어 감시 림프절 생검 +/- 겨드랑이 절제술을 통한 유방 절제술/유방 절제술을 통한 개입. 치료 일정은 항원 노출 시간을 최적화하도록 설계되었습니다[그림-2]. 시험은 IRB 승인을 받으면 National Clinical Trials Network에 등록됩니다.

   주제:

   임상 1기/2기 삼중 음성 질환이 있는 18세 이상의 모든 환자가 참여하도록 제안됩니다. 이 환자들은 연구 팀에 의해 종양학/수술 약속 중에 선별될 것입니다. 전산화된 무작위 목록은 다음 웹사이트를 사용하여 치료군 할당에 사용됩니다.

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   포함 기준:

   • 안
   • 1기/2기 암
   • 연령대 18 - 89세
   • 진단: 침윤성 암종, ER -, PR-, HER2-(삼중 음성)
   • 영상의학 소견: 초음파에서 보이는 단발성 질환

   제외 기준:

   • 추가 원발성 암
   • 염증성 유방암
   • 자가 면역 질환의 역사
   • 만성 면역억제 병력
   • 선행 면역 요법
   • 최근 접종(4주 이내)
   • 이전 방사선 요법
   • 지난 1년 이내의 이전 시험약제 치료
   • 진단 및/또는 치료 당시의 임신
   • 모유 수유

   연구 방문:

   정보에 입각한 동의를 얻은 후 환자를 무작위 배정합니다. 모든 방문은 표준 치료 방문과 일치합니다. 다음으로 다음이 발생합니다.

   방문 1: 1일차:

   베이스라인 채혈; 최대 20ml가 EDTA 튜브에 수집됩니다. 혈액은 TTUHSC에서 원심분리됩니다. 혈장은 TTU 연구실에서 사이토카인 분석 및 표현형 분석에 사용됩니다. 하나의 EDTA 튜브가 University of Houston으로 보내질 것입니다(연구 시점 전체). 다음 결과가 측정됩니다.

   사이토카인 분석

   • RNA seq PBMC 분석 베이스라인 코어 생검 조직(진단 정밀 검사에서 이미 사용 가능)은 다음에 대해 평가됩니다.
   • %까지
   • RNA Seq 종양 조직

   방문 2(그룹 II 및 III에만 해당) 동결절제 후: 3일(+/- 7일):

   절제 후 채혈(그룹 II 및 III) - EDTA 튜브에 최대 10ml의 혈액:

   • 사이토카인 분석

   방문 3(모든 그룹) 신보강 화학요법 전: 21일(+/- 14일):

   화학 요법을 위한 포트 삽입 시 채혈 - EDTA 튜브에 최대 20ml의 혈액:

   • 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형
   • 사이토카인 분석
   • RNA seq PBMC 분석
   • TIL 및 RNA seq 분석을 위해 종양 생검을 반복할 것입니다.

   방문 4(모든 그룹): 화학요법 절제 후(원래 생검 후 약 6개월):

   수술 전 채혈 - EDTA 튜브에 최대 20ml 혈액 채혈(기준선과 유사):

   • 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형
   • 사이토카인 분석
   • RNA seq PBMC 분석 외과 표본 조직 분석(고정된 조직에서 염색되지 않은 슬라이드 2개가 RNA seq용으로 준비됨)
   • 틸%
   • RNA seq 종양 조직

   표본의 크기:

   종양 침윤 림프구(TIL), 특히 삼중 음성 유방암의 기질에서 치료에 대한 반응을 예측하고 예측합니다. 따라서 International TILs Working Group의 권장 사항을 사용하여 이 프로젝트의 샘플 크기를 계산했습니다. TIL의 백분율 변화는 대조군의 경우 10%, 치료군의 경우 50%로 가정합니다. 그룹당 10명의 환자 샘플은 양측 2-샘플 등분산 t-검정(알파=0.05)을 사용하여 표준 편차 0.3으로 평균 차이 0.4(0.5 대 0.1)를 탐지하는 80% 검정력을 달성할 수 있습니다. . 탈락률이 30%라고 가정하면 각 부문에 총 12명의 환자가 있으면 총 36명의 환자에 대해 충분합니다. 이것은 90%의 힘을 얻을 것입니다. 즉, 팔당 최소 10명의 환자와 팔당 최대 12명의 환자가 통계적으로 의미 있는 연구로 이어질 것입니다.

   통계 계획:

   기술 통계는 표준 치료, cryo, cryo+pembro 독립 변수에 대한 범위, 평균 및 분산을 계산하는 데 사용됩니다. 이것은 평균 주변의 관측치 집중과 평균에서 관측치의 변동을 제안합니다. 정규성 테스트는 데이터가 정규 분포를 따르는지 여부를 확인하는 것으로 간주됩니다. 일반 분위수 플롯(q-q 플롯이라고도 함)은 데이터 세트가 일반 모집단에서 나온 것인지 확인하는 데 사용됩니다. 이상치(있는 경우)를 감지하기 위해 몇 가지 통계적 측정이 고려됩니다. 독립변수 standard care, cryo, cryo+pembro에 대한 분산의 동질성을 확인하기 위해 귀무가설과 대립가설을 설정하여 Levene's test를 수행합니다. 변수 평균 간의 유의차를 비교하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)이 수행됩니다. 수단에 대한 귀무가설과 대립가설을 소개합니다. ANOVA에서 평균의 통계적 유의성은 F-테스트 통계를 사용하여 테스트됩니다(α = 0.05). 평균이 통계적으로 유의미한 차이가 발견되면 사후 다중 비교 테스트가 수행됩니다. 사후 다중 비교 테스트(LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey 등)를 사용하여 적절한 유의 그룹 평균을 감지합니다. 샘플이 정규성 가정을 충족하지 않으면 통계 분석을 위해 여러 비모수 테스트가 고려됩니다.

   종양 냉동절제술:

   등록된 모든 환자는 연구의 세 부문 중 하나에 무작위 배정됩니다. 팔 II 및 III의 환자는 다음 프로토콜(ACOSOG Z1072 시험에서 사용된 프로토콜과 유사)에 따라 냉동절제술을 받게 됩니다.

   냉동절제 장치: 냉동절제술은 콘솔, 냉동탐침 및 관련 액체 질소(저온유체) 케이스 듀어로 구성된 상업적으로 이용 가능한 ProSense 냉동수술 시스템(IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israel)을 사용하여 수행됩니다. 콘솔은 cryoablation 절차를 제어하고 모니터링하기 위한 인터페이스를 특징으로 하는 독립형 장치입니다. 표준 120VAC(60Hz) 전원으로 작동합니다.

   장치 작동: ProSense 냉동 수술 시스템은 폐쇄형 시스템을 사용하여 냉동 탐침 팁 내에서 액체 질소를 순환시켜 대상 조직을 제거하는 영하의 온도를 생성합니다. 초음파로 병변을 확인하고 적절한 국소마취 후 초음파 유도하 병변 중앙에 cryoprobe를 위치시키고 소정의 동결-해동-동결 알고리즘에 따라 절제를 시행한다. 프로브는 내부 전기 저항 히터에 의해 따뜻해지며 환자에게서 제거됩니다. 냉동절제 절차: 종양은 2개의 직교 보기에서 고해상도 선형 배열 초음파 탐침을 사용하여 식별됩니다. 프로브의 병렬 삽입을 위해 종양의 가장 긴 치수가 식별됩니다. 이 차원은 콘솔에 입력됩니다. 콘솔은 삽입 시 병변을 지나도록 cryoprobe 팁의 길이를 제공합니다. 삽입 후 두 개의 직교 보기에서 프로브 위치를 확인합니다. Cryoablation은 종양 크기에 따라 동결-해동-동결 주기를 사용하여 수행됩니다. 전체 절차는 육안으로 모니터링하고 얼음 공에서 피부를 수압 절개하여 피부 동상을 방지하기 위해 식염수를 침투시킵니다. 얼음 공의 크기는 직교 차원으로 기록됩니다. 프로토콜에서 환자에게 하나 이상의 병변이 있는 경우 하나의 병변만 절제됩니다. 그러나 다른 병변의 생검은 전신 영향에 대해 연구될 것입니다.

   Pembrolizumab 주입 및 투약:

   초기 단계로 새로 유방암 진단을 받은 여성에서 종양 냉동 절제술을 통한 면역 관문 억제제의 안전성과 내약성을 확인했습니다. 한 가지 중요한 고려 사항은 면역 조절 항체의 선택이었습니다. PD-1/PD-L1에 대한 FDA 승인 항체인 Pembrolizumab은 안전성 프로파일이 잘 확립되어 있으며 진행성 흑색종 환자의 10~20%에서 10년 이상 지속되는 장기 관해를 유도합니다.50 또한 T 세포는 항원에 노출된 후 PD-1/PD-L1의 발현을 급격하게 상향 조절하여51 세포독성 반응을 둔화시킬 수 있기 때문에 pembrolizumab은 냉동 절제와 함께 면역 조절에 이상적으로 적합합니다. MSKCC(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)는 이 조합에 대한 파일럿 연구를 발표했습니다. 이필리무맙으로 인한 심각한 부작용은 보고되지 않았으며; 수술이 지연되지 않았습니다. MSKCC는 단일 용량으로 10mg/Kg을 사용했습니다. 그러나 연구에서 해당 용량에서 더 높은 부작용이 보고되었기 때문에 우리는 현재 삼중 음성 암에 대한 임상 환경에서 사용되는 용량인 냉동 절제 전 90분 용량에 걸쳐 IV에 대해 권장되는 200mg을 제안합니다.

   결과 측정 방법론:

   우리는 pembrolizumab을 사용하거나 사용하지 않고 cryoablation 절차에 따른 면역 반응을 관찰하고 모니터링합니다. 혈액 샘플을 EDTA-혈액 수집 튜브에 수집한 다음 표시된 시점에서 T 세포 표현형 분석, 사이토카인/케모카인 및 RNA seq 분석을 위한 혈장 수집을 위해 분주합니다. 병리학 슬라이드는 기준선에서 핵심 생검 샘플과 수술 시 유방절제술 및 센티넬 노드로부터 연구를 위해 만들어질 것입니다. TIL 백분율을 계산하기 위해 면역 세포 침윤에 대한 H&E 및 면역조직화학을 위해 표본당 5개의 슬라이드가 만들어집니다(일상적인 병리학 완료 후). 결과 측정 분석을 수행하는 데 관련된 모든 협력자/핵심 인력은 무작위 그룹에 대해 눈이 멀게 됩니다.

   다음은 결과 분석에 대한 세부 정보입니다.

   TIL 계산: 일상적인 병리 보고를 받는 모든 조직 표본은 International TILs Working Group에서 제시한 지침에 따라 TIL 보고를 위해 평가됩니다. 원래 핵심 생검 조직과 수술 조직 간의 TIL 점수 변화는 제안된 개입의 영향을 평가하기 위한 분석의 초점이 될 것입니다.

   혈액 내 T 세포 변화의 측정: T 세포 아형은 세포 표면 마커의 차등 발현에 의해 정의될 수 있습니다. 활성화, CD8+ 이펙터 T 세포 증가, 이펙터 및 중앙 기억의 발달에 대해 T 세포를 모니터링할 것입니다. T-세포 표현형 분석을 위해 전혈 염색(100 μl/염색)은 적절한 이소타입 컨트롤과 함께 CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 및 Ki67에 대한 항체로 수행됩니다.55 RBC 용해 후 염색된 단핵 세포는 Attune NxT 14색 유세포 분석기(Thermofisher, Waltham, MA)에서 실행되고 FlowJo 소프트웨어(Becton, Dickinson and Company)를 사용하여 분석됩니다. T 세포(CD3+, CD4+ 또는 CD8+)는 나이브(CD27+, CCR7+, CD45RO-), 효과기(CCR7-, CD45RO-), 효과기 기억(CD27-, CCR7-, CD45RO+) 및 중앙 기억( CD27+, CCR7+, CD45RO+) 표현형 마커 및 활성화(ICOS 및 CD137) 및 증식(Ki67). 우리는 T 조절 세포(CD25+, CD127-)의 백분율을 추가로 분석할 것입니다. 우리는 장기 항종양 면역을 예측하기 위해 cryoablation +/- Pembrolizumab의 효과를 상호 연관시키기 위해 T 세포 면역 서명을 결정하기 위해 이 데이터를 사용할 것입니다.

   혈장 사이토카인/케모카인 분석: 우리의 초기 분석은 어떤 사이토카인/케모카인과 어떤 농도가 냉동 절제 +/- 펨브롤리주맙 후 혈액에서 검출되는지, 그리고 그들의 프로파일이 어떻게 변경되는지를 결정하는 것입니다. 우리는 염증 및 헬퍼 T 세포 사이토카인 프로파일과 이러한 사이토카인이 T 세포 반응에 어떻게 영향을 미치고 지시하는지에 초점을 맞출 것입니다. 또한 케모카인의 변화를 살펴보겠습니다. 악성 종양에서 이들의 변형된 발현은 질병의 모든 단계에서 백혈구 모집 및 활성화, 혈관신생, 암세포 증식 및 전이를 지시하는 것으로 나타났습니다.56 기준선에서 절제 후 24-48시간, 화학요법 전 사이에 혈액을 수집하고 1-2000 x g에서 10분 동안 혈액 1-2 ml를 원심분리한 다음 120 μl를 0.65 mL 마이크로원심분리기 튜브에 분주하여 혈장을 분리합니다. 표준 관리 그룹에는 3개의 혈액 샘플 시점만 있습니다. 혈장 샘플은 Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex(HDHSTC14)를 사용하여 Eve Technologies Corporation(Calgary, AB Canada)의 Bio-Plex 200으로 분석됩니다: GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   데이터 시트:

   Excel 스프레드시트를 참조하십시오. RNA seq는 차별적으로 발현된 유전자에 대한 히트 맵으로 수집됩니다.

   위험:

   채혈 위험:

   채혈의 위험은 다음과 같습니다: 통증, 불편함, 출혈, 멍, 발적, 바늘이 피부에 들어가는 감염; 현기증, 실신.

   냉동절제 관련 위험:

   Cryoablation은 매우 안전한 절차였습니다. PI는 이 절차를 유방의 양성 및 암 질환에 정기적으로 제공하고 있습니다. 지금까지 18명의 암 환자와 36명의 양성 병변이 시술을 받았습니다. 지금까지 다음과 같은 가벼운 합병증이 보고되었습니다.

   • 절제 부위의 멍 - 자가 제한적.
   • 통증 - OTC 진통제로 관리됩니다.
   • 그러나 피부 괴사는 절차 프로토콜에 따라 이론적인 가능성이 있습니다. 우리는 이런 합병증을 겪어본 적이 없습니다.

   펨브롤리주맙 관련 위험:

   면역 체크포인트 억제제의 독성에 대한 광범위한 연구가 있었습니다.57 Pemrolizumab의 표준 권장 용량은 용량당 200mg IV입니다(FDA 승인). 예상되는 부작용은 다음과 같습니다.

   • 발진
   • 설사
   • 변비
   • 메스꺼움
   • 체중 감량
   • 안구건조증
   • 피로
   • 두통
   • 발열
   • 관절 통증
   • 갑상선 기능 장애

   기밀성 상실:

   모든 데이터는 CRI 및 PI 사무실 내에서 암호로 보호된 파일에 보관됩니다. 모든 데이터는 편집 및 분석을 위해 익명화됩니다. HIPAA 준수를 위한 모든 프로토콜을 따릅니다. 그러나 사람의 실수로 인해 기밀이 침해될 위험이 최소화됩니다.

   이익:

   II군과 III군 환자는 임상시험에 참여함으로써 혜택을 볼 수 있습니다. 냉동 요법과 체크포인트 억제제 약물의 조합을 통한 면역 조절에 대한 우리의 직감이 실제로 종양 제어에 영향을 미친다면 이 두 그룹은 참여를 통해 직접적인 혜택을 받을 것입니다. 그러나 대조군 I은 연구를 위한 비교군을 제공하는 것 이상으로 임상시험에서 이익을 얻지 못할 것입니다. 제안된 연구의 주요 목표는 미래의 암 환자에게 궁극적으로 도움이 될 이러한 고위험 암에 대한 새로운 저위험 치료 접근법을 식별하는 것입니다.

   모니터링:

   연구 수행 중 연구 프로토콜, GCP 지침, TTUHSC 인간 연구 보호 프로그램 연구 정책 및 절차와 품질 데이터를 준수하기 위해 임상 연구소의 모니터가 연구 모니터링을 수행합니다. 첫 번째 모니터링 방문은 첫 번째 피험자가 연구에 등록한 후 2주 이내에 수행됩니다. 후속 모니터링 방문은 PI와 연구 모니터가 상호 합의한 기간에 활성 연구 참가자가 있는 경우 2개월마다 정기적으로 일정을 잡습니다. 수집된 모든 데이터는 100% 원본 문서로 검증됩니다. 연구 모니터는 해당 기밀 규정 내에서 모든 연구 문서, 즉 데이터 수집 양식, 설문지, 약물 책임 및 의료 기록을 검사하고 감사할 수 있습니다.

   자금:

   NIH 보조금 R21 신청