Gruppierung der Immunmodulation mit Kryoablation (LOGIC) für Brustkrebs (LOGIC)

ZIELE:

Das Hauptziel der vorgeschlagenen Studie ist die Bewertung der Synergie von Tumor-Kryoablation und Immun-Checkpoint-Inhibitor bei Hochrisiko-Brustkrebs beim Menschen. Dies wird erreicht, indem die Kryoablation allein und die Kryoablation in Kombination mit Pembrolizumab – einem [Checkpoint-Inhibitor (Anti-PD-1/PD-L1-Antikörper), der derzeit von der FDA als Krebstherapie zugelassen ist] mit dem aktuellen Behandlungsstandard, einschließlich chirurgischer Resektion, verglichen wird. Der aktuelle Standard neoadjuvanter/adjuvanter Therapien wird aus ethischen Gründen unverändert bleiben, um allen Patienten den besten bekannten Behandlungsstandard zu bieten.

ZIELE:

Wir schlagen eine prospektive randomisierte explorative Studie vor, bei der Patientinnen mit dreifach negativem invasivem Brustkrebs im klinischen Stadium I/II randomisiert einem der drei Studienarme zugewiesen werden:

1. Behandlungsstandard – neoadjuvante Therapie, gefolgt von einer chirurgischen Resektion, gefolgt von einer geeigneten adjuvanten Therapie, falls erforderlich.
2. Kryoablationsarm – Kryoablation, gefolgt von einer geeigneten neoadjuvanten Therapie, gefolgt von einer chirurgischen Resektion, gefolgt von einer geeigneten adjuvanten Therapie, falls erforderlich.

3. Kryoablation mit Pembrolizumab – Einzeldosis von 200 mg Pembrolizumab vor (innerhalb von 24–48 Stunden) der Kryoablation, gefolgt von einer geeigneten neoadjuvanten Therapie, gefolgt von einer chirurgischen Resektion, gefolgt von einer geeigneten adjuvanten Therapie nach Bedarf.

   Zu den Ergebnismessungen gehören Blut- und Tumoranalysen der Immunantwort mit Durchflusszytometrie und Zytokinanalyse zu Studienbeginn, nach dem Eingriff und vor der Operation. Gewebe aus Kernbiopsien zu Studienbeginn, Wiederholungsbiopsien vor Chemotherapie und Tumorresektion werden ebenfalls auf die Tumormikroumgebung analysiert.

   EINFÜHRUNG / HINTERGRUND / BEDEUTUNG:

   Hochrisiko-Brustkrebs und Bedarf an neueren Behandlungsansätzen: Triple-negativer Brustkrebs, der 15-20 % aller Brustkrebsdiagnosen ausmacht, gilt als Hochrisiko. Während die chirurgische Resektion die Hauptstütze der Behandlung bleibt, umfasst das therapeutische Rückgrat die neoadjuvante und adjuvante Chemotherapie. Bei Patienten, die auch nach chirurgischer Resektion und Abschluss der Chemotherapie noch eine signifikante Resterkrankung aufweisen, werden weitere aggressive systemische Therapien wie Capecitabin durchgeführt. Der dreifach negative Subtyp ist mit der höchsten Anzahl von Mutationen im gesamten Genom verbunden, und eine nicht metastasierte Erkrankung ist mit 17-20 % lokalem Versagen und 35-40 % Fernversagen nach 5-10 Jahren Nachbeobachtung verbunden. Diese Daten legen nahe, dass eine mikrometastatische hämatogene Ausbreitung bei einer beträchtlichen Anzahl von Patienten mit operablem Hochrisiko-Brustkrebs auftritt und dass neuere Ansätze erforderlich sind, die die lokale Kontrolle potenzieren und gleichzeitig die systemische Ausbreitung der Krankheit kontrollieren.

   Umfang der Immunmodulation: Die Krebsimmuntherapie hat in den letzten Jahrzehnten außerordentliche Erfolge erzielt. Antigene, die Antitumor-Immunantworten hervorrufen können, bilden ein geeignetes immuntherapeutisches Ziel. Der Ansatz der T-Zell-Checkpoint-Blockade-Therapien hat bemerkenswerte klinische Reaktionen bei mehreren Arten von soliden Krebsarten wie Melanomen, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Blasenkrebs und Krebsarten mit Fehlpaarungsreparatur gezeigt. Es wird angenommen, dass eine wirksame Antitumor-Immunantwort durch die Aufnahme von Tumorantigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) initiiert wird, die diese wiederum präsentieren und costimulatorische Signale sowohl an CD4+- als auch an CD8+-T-Zellen liefern. APCs, insbesondere dendritische Zellen, verarbeiten Antigene über einen exogenen Antigenverarbeitungsweg, bei dem Tumorzellmaterial phagozytiert und in HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-bindende Peptide umgewandelt wird, die CD8+- (Kreuzpräsentation) bzw. CD4+-T-Zellen präsentiert werden. Auf der Grundlage dieses Wissens haben kürzlich durchgeführte Phase-1-Studien über ein verbessertes Ansprechen auf eine Therapie mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren in Kombination mit einer konventionellen Chemotherapie bei dreifach negativem Brustkrebs berichtet. Sicherlich wurde der Prozentsatz tumorinfiltrierender Lymphozyten (TILs) als wichtiger immunologischer Parameter identifiziert, insbesondere bei Hochrisiko-Brustkrebs, der mit dem Ansprechen auf eine systemische Therapie korreliert, was auf eine starke Rolle der Immunantwort des Wirts bei der Krebskontrolle unabhängig von der therapeutischen Intervention hindeutet .

   Einschränkung der Immunmodulation – T-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Anti-Tumor-Immunität und bilden daher das Hauptziel für die immuntherapeutische Forschung. Der aktuelle Durchbruch in der Krebs-Immuntherapie resultiert aus der Identifizierung und dem Targeting von Checkpoint-Mechanismen, an denen CTLA-4, PD-1 und PD-L1 beteiligt sind. CTLA-4 und PD-1 sind co-inhibitorische Rezeptoren, die auf der Oberfläche von T-Zellen zu finden sind. Nach der Bindung an ihre entsprechenden Liganden (CD 80/86 bzw. PD-L1/L2) werden T-Zellen anergisch – ein physiologischer Toleranzmechanismus. Im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung kann die abweichende Expression zusammen mit der chronischen Exposition gegenüber Tumorantigenen zu einer unerwünschten Unterdrückung der T-Zell-Immunität führen.

   Kürzlich entwickelte Checkpoint-Blocker wie der PD-1/PD-L1-Inhibitor Pembrolizumab bieten eine neue Waffe gegen Krebs mit dauerhaftem klinischem Ansprechen und langfristigen Remissionen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Checkpoint-Blockade bei Tumoren mit hoher Mutationslast am effektivsten ist, im Einklang mit der Vorstellung, dass die T-Zell-Erkennung von Neo-Antigenen eine wichtige Rolle bei der Checkpoint-Blockade spielt. Viele Studien zeigen, dass bei fehlendem oder geringem Tumor-reaktiven T-Zell-Infiltrat (niedriger Anteil an TILs) das Substrat für die Checkpoint-Blockade fehlt. Darüber hinaus reagiert die Mehrheit der Patienten mit sogenannten hypermutierten Tumoren nicht auf die Checkpoint-Blockade aufgrund von Immuneditierung, was die Fähigkeit der T-Zellen beeinträchtigt, ihre zytotoxische Aktivität einer adäquaten Tumorinfiltration und Erkennung der mit Tumorantigenen beladenen HLA-Klasse zu erfüllen Ich Moleküle. Daher ist die Verbesserung der Antigenpräsentation innerhalb des Tumors für eine wirksame Checkpoint-Blockade unerlässlich.

   Rolle ablativer Therapien – insbesondere Kryoablation: Thermische Ablation mit Kryotherapie, Laser, Hochfrequenz, Mikrowelle und fokussiertem Ultraschall bieten eine einzigartige Gelegenheit, sowohl den Primärtumor als auch die mikrometastatische Erkrankung anzugehen. Die Wirkungen der Tumorablation sind vielfältig: (1) die Zerstörung der Tumormasse, die Verringerung der Tumorlast und (2) die Freisetzung von Tumorantigenen, wodurch sie für die Aufnahme durch antigenpräsentierende Zellen (APCs) verfügbar gemacht werden, und die Behandlung selbst führt zu (3 ) die Freisetzung von Schaden-assoziierten molekularen Mustern (DAMPs) und (4) die Induktion einer physiologischen Wundheilungsreaktion. Die Ablation führt zur Bildung eines In-situ-Antigendepots, das alle Arten von Tumorproteinen enthält, was zur Initiierung einer systemischen Antitumor-Immunantwort führt, die möglicherweise okkulte Metastasen eliminieren kann. Die Ablation von Tumoren bei Temperaturen über 65 °C führt zur Denaturierung von Proteinen. Dies kann die Immunantworten auf gegensätzliche Weise beeinflussen, da hohe Temperaturen immunaktivierende Signale denaturieren, wie z. B. Gefahrensignale wie Hitzeschockproteine ​​(HSPs). Daher ist die Kryoablation die vielversprechendste ablative Technik, da sie minimale Invasivität, weniger Schädigung des umgebenden Gewebes und eine bessere Konservierung von Tumorantigenen sowie die robustesten Daten zur Immunstimulation bietet.

   Immunstimulation durch Kryoablation – Tiefgefrieren und Auftauen während der Kryoablation induziert Nekrose und die Hochregulierung von DAMP-Molekülen, die Tumorzellen anfälliger für APCs und tumorspezifische T-Zell-vermittelte Abtötung machen. Die Kryoablation reguliert DAMPs wie HMG1, Calreticulin, S100A8/A9 und HSP70 hoch, die das Immunsystem durch Rezeptoren für fortgeschrittene Glykosylierungsendprodukte (RAGE) und Toll-like-Rezeptoren stimulieren und die Antigenpräsentation verbessern. Außerdem ist das aus der Kryoablation resultierende Zytokinmilieu der zentralen Zone typischerweise ein Th1-Zytokinprofil von IL-2, INF-γ, TNF-α und IL-12.28 Diese Zytokine und DAMPs treiben vermutlich die zytotoxische CD8+-T-Zellantwort an. Präklinische Beweise, die die Immunantwort der Kryoablation unterstützen: Mehrere präklinische Studien zur Kryoimmunologie untersuchten, ob das Einfrieren des Tumors und das Belassen in situ das Tier resistent gegen eine erneute Herausforderung machen würde. Tiermodelle unter Verwendung von Karzinom- und Sarkom-Zelllinien bei Kaninchen und Mäusen zeigten eine tumorspezifische Resistenz gegenüber einer erneuten Herausforderung. Die erneute Herausforderung mit denselben Tumorzelllinien zeigte bei Tieren nach der Kryoablation im Vergleich zur chirurgischen Resektion eine Wachstumsresistenz. Ähnliche Erfahrungen wurden von Blackwood und Cooper mit Modellen mit Ratten berichtet, die mit Myosarkom- und Karzinosarkom-Zelllinien geimpft wurden. Ratten mit kryoablatierten Tumoren widerstanden mit größerer Wahrscheinlichkeit einer erneuten Herausforderung und zeigten im Vergleich zu chirurgisch behandelten Ratten eine Regression von Sekundärtumoren. Bagleyet al. verglichen die Kryoablation mit einem chirurgischen Eingriff bei der Verwendung von MCA-10-Fibrosarkom bei C57BL/6-Mäusen, wobei Milzlymphozyten in wöchentlichen Abständen nach der Behandlung für Zytotoxizitätsassays geerntet wurden. Mäuse, die sich einer Kryoablation unterzogen, hatten eine signifikant höhere Zytotoxizität als chirurgisch behandelte oder unbehandelte Mäuse. Sabelet al. untersuchten MT-901-Mamma-Adenokarzinom-Tumoren in BALB/c-Mäusen, die mit Kryoablation oder chirurgischer Resektion behandelt wurden. Nach erneuter Provokation entwickelten 86 % der operierten Mäuse Zweittumoren, verglichen mit 16 % der Mäuse, die mit Kryoablation behandelt wurden. Dies war tumorspezifisch, da die Kryoablation keinen Schutz gegen eine Provokation mit anderen Zelllinien bot. Kürzlich haben Kim et al. unter Verwendung von Nierenzellkarzinom-Zelllinien in BALB/c-Mäusen berichteten über ähnliche Ergebnisse. In jüngerer Zeit wurde über eine abskopale Wirkung der Tumorregression bei unbehandelten Tumoren in Tiermodellen, bei denen nur einer der implantierten Tumore kryoablatiert wurde, als Ergebnis einer systemischen Immunantwort berichtet.

   Klinische Beweise für die Immunantwort der Kryoablation: Obwohl die klinische Anwendung der Kryoablation bei Krebs in letzter Zeit zugenommen hat, gibt es relativ wenige Studien, die die immunologischen Auswirkungen beim Menschen untersuchen. Ravindranathet al. maßen den Gehalt an Serumtumorgangliosiden und ihre Antikörpertiter bei Patienten, die Kryoablation, Hochfrequenzablation oder Resektion von Lebermetastasen von Darmkrebs erhielten. Serum-Gangliosid-Spiegel waren bei kryoablatierten Patienten im Vergleich zu Radiofrequenz oder Operation signifikant höher. Kryoablatierte Patienten zeigten auch höhere IgM-Titer gegen Tumorganglioside. Siet al. untersuchten 20 Patienten mit Prostatakrebs, die sich einer Kryoablation des Primärtumors unterzogen, und berichteten über eine Zunahme der zytolytischen Aktivität gegen LNCaP und eine Zunahme der Anzahl von IFN-ɣ-produzierenden T-Zellen. Thakur et al. führte eine Pilotstudie zur Kryoablation und GM-SCF bei Patienten mit in die Lunge metastasiertem Nierenzellkarzinom durch. GM-CSF wurde in der Nähe einer metastatischen Lungenläsion infiltriert, die für die Kryoablation ausgewählt wurde. Nach dem Eingriff wurde eine zusätzliche GM-CSF-Therapie angewendet. Die Kombination von GM-CSF und Kryoablation führte zu einer verstärkten Immunantwort in Bezug auf Zytotoxizität und Serumantikörper.

   Einschränkung der Kryoablation: Trotz der oben aufgeführten Daten war die Immunantwort auf die Kryoablation nicht einheitlich. Einige präklinische Studien zu osteogenen Sarkomen und Prostatakrebsmodellen zeigten keine Verbesserung der Immunfunktion nach Kryoablation. Noch wichtiger ist, dass mehrere Studien über eine Immunsuppression mit Kryochirurgie berichtet haben. Die Mehrzahl dieser Studien umfasste Fibrosarkom-Zelllinien bei Ratten und zeigte eine verringerte Resistenz gegenüber einer erneuten Herausforderung nach der Kryoablation sowie ein erhöhtes Wachstum von metastatischen Tumoren und Sekundärtumoren. Aus Sicht des Brustkrebses haben Sabel et al. berichteten, dass eine hohe Freeze-Rate zu erhöhten tumorspezifischen T-Zellen in den tumordrainierenden Lymphknoten, einer Verringerung der Lungenmetastasen und einem verbesserten Überleben im Vergleich zu niedrigen Freeze-Raten führte, die auch mehr Tregs (CD3, CD4, CD127-, CD25+) aufwiesen. Daher hat sich das Ausmaß der durch Kryotherapie allein induzierten systemischen Wirkung entweder als unzureichend oder als kontraproduktiv erwiesen. Derzeitiges Verständnis ist, dass in der Nähe der ablativen Quelle, direkte Verletzung und Zelltod mit Nekrose Tumorantigene und (DAMPs) freisetzen, die dendritische Zellen rekrutieren und aktivieren, die wiederum die Proliferation von T-Zellen und Immunkomponenten stimulieren. Die Übergangszone weg von der ablativen Quelle verursacht indirekte Zellschädigung und apoptotischen Zelltod ohne Freisetzung von DAMPs, was die Freisetzung von unterdrückenden Zytokinen und klonale T-Zell-Deletion und Anergie verursacht. Intuitiv stimuliert die Kryoablation eine Immunantwort, aber die endgültige klinische Wirkung wird durch das Verhältnis von CD4+ T-Effektorzellen zu T-Regulationszellen bestimmt. Ein höheres Verhältnis von T-Effektor zu T-regulatorischen Zellen fördert die günstigere Antwort der zytotoxischen CD8-T-Zellen. Während zytotoxische CD8+-Zellen den Primärtumor und systemische Mikrometastasen eliminieren, ist es wichtig, dass die Anergie unter Kontrolle gehalten wird und sowohl Effektor- (CD45RO+, CCR7-) als auch zentrale (CCR7+, CD45RO+) Gedächtnis-T-Zellen für einen langfristigen Schutz gegen Tumorimmunität.

   HYPOTHESE:

   "Die Kombination von Kryoablation mit Pembrolizumab zur lokalen Kontrolle bei dreifach negativem Hochrisiko-Brustkrebs ist der chirurgischen Resektion allein oder der Kryoablation allein bei der Erzeugung einer Antitumor-Immunantwort überlegen."

   METHODEN:

   Studienort:

   Die vorgeschlagene Sondierungsarbeit ist eine randomisierte Studie, die am Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center, durchgeführt wird.

   Art des Studiums:

   Prospektive randomisierte Studie – hypothesengetrieben

   Experimentelles Design:

   Wir schlagen eine einfach verblindete, prospektive, randomisierte Studie vor, in der Frauen mit dreifach negativem Brustkrebs im Stadium I/II in einem der drei Arme in 1:1:1 randomisierter Weise aufgenommen werden: (I) Kontrollarm mit neoadjuvanter Chemotherapie, gefolgt von Lumpektomie/ Mastektomie mit Sentinel-Node-Biopsie +/- Axilladissektion; (II) Intervention mit Kryoablation allein, gefolgt von neoadjuvanter Chemotherapie, gefolgt von Lumpektomie/Mastektomie mit Sentinel-Node-Biopsie +/- Axilladissektion; (III) Intervention mit Kryoablation + Pembrolizumab, gefolgt von neoadjuvanter Chemotherapie, gefolgt von Lumpektomie/Mastektomie mit Sentinel-Node-Biopsie +/- Axilladissektion. Der Behandlungsplan ist darauf ausgelegt, die Antigen-Expositionszeit zu optimieren [Abbildung-2]. Die Studie wird beim National Clinical Trials Network registriert, sobald die Genehmigung des IRB vorliegt.

   Fächer:

   Allen Patienten ab 18 Jahren mit dreifach negativer Erkrankung im klinischen Stadium I/II wird die Teilnahme angeboten. Diese Patienten werden während eines onkologischen/chirurgischen Termins vom Studienteam untersucht. Eine computergestützte Randomisierungsliste wird für die Zuweisung des Behandlungsarms über die Website verwendet:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Einschlusskriterien:

   • Frauen
   • Krebs im Stadium I/II
   • Altersspanne 18 - 89 Jahre
   • Diagnosen: Invasives Karzinom, ER -, PR-, HER2- (dreifach negativ)
   • Radiologische Befunde: Unifokale Erkrankung im Ultraschall sichtbar

   Ausschlusskriterien:

   • Zusätzlicher primärer Krebs
   • Entzündlicher Brustkrebs
   • Vorgeschichte einer Autoimmunerkrankung
   • Geschichte der chronischen Immunsuppression
   • Vorherige Immuntherapie
   • Kürzliche Impfung (innerhalb von 4 Wochen)
   • Vorherige Strahlentherapie
   • Vorherige Behandlung mit Prüfsubstanz innerhalb des letzten 1 Jahres
   • Schwangerschaft zum Zeitpunkt der Diagnose und/oder Behandlung
   • Stillen

   Studienaufenthalte:

   Eine informierte Zustimmung wird eingeholt, dann wird der Patient randomisiert. Alle Besuche fallen mit den Standardpflegebesuchen zusammen. Als nächstes wird Folgendes passieren:

   Besuch 1: Tag 1:

   Baseline-Blutabnahme; bis zu 20 ml werden in EDTA-Röhrchen gesammelt; das Blut wird bei TTUHSC zentrifugiert. Plasma wird für die Zytokinanalyse und Phänotypisierung im TTU-Labor verwendet. Ein EDTA-Röhrchen wird an die University of Houston geschickt (während der gesamten Studienzeitpunkte). Folgende Ergebnisse werden gemessen:

   Zytokin-Analyse

   • RNA-seq PBMC-Analyse Baseline-Stanzbiopsiegewebe (bereits verfügbar aus der diagnostischen Aufarbeitung) wird bewertet auf: (2 ungefärbte Objektträger werden für RNA-seq aus fixiertem Gewebe vorbereitet)
   • BIS %
   • RNA Seq Tumorgewebe

   Besuch 2 (nur Gruppe II & III) Nach Kryoablation: Tag 3 (+/- 7 Tage):

   Blutentnahme nach der Ablation (Gruppe II & III) – bis zu 10 ml Blut in EDTA-Röhrchen:

   • Zytokinanalyse

   Besuch 3 (alle Gruppen) Präneoadjuvante Chemotherapie: Tag 21 (+/- 14 Tage):

   Blutentnahme zum Zeitpunkt der Portinsertion für die Chemotherapie – bis zu 20 ml Blut in EDTA-Röhrchen:

   • Immunphänotypisierung durch Durchflusszytometrie
   • Zytokin-Analyse
   • RNA seq PBMC-Analyse
   • Die Tumorbiopsie wird für die TIL- und RNA-Seq-Analyse wiederholt

   Besuch 4 (alle Gruppen): Post-Chemotherapie-Resektion (ungefähr 6 Monate nach der ursprünglichen Biopsie):

   Präoperative Blutabnahme – bis zu 20 ml Blut in EDTA-Röhrchen (ähnlich wie bei Baseline):

   • Immunphänotypisierung durch Durchflusszytometrie
   • Zytokin-Analyse
   • RNA-seq PBMC-Analyse Chirurgische Probengewebeanalyse (2 ungefärbte Objektträger aus fixiertem Gewebe werden für RNA-seq vorbereitet)
   • BIS%
   • RNA seq Tumorgewebe

   Probengröße:

   Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs), insbesondere im Stroma von dreifach negativem Brustkrebs, sind prognostisch und prädiktiv für das Ansprechen auf die Therapie. Daher wurden Empfehlungen der International TILs Working Group verwendet, um die Stichprobengröße für dieses Projekt zu berechnen. Die prozentuale Veränderung der TILs wird mit 10 % für den Kontrollarm und 50 % für den Behandlungsarm angenommen. Eine Stichprobe von 10 Patienten pro Gruppe kann eine Trennschärfe von 80 % erreichen, um eine mittlere Differenz von 0,4 (0,5 vs. 0,1) mit einer Standardabweichung von 0,3 unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests mit zwei Stichproben und gleicher Varianz (Alpha = 0,05) zu erkennen. . Unter der Annahme einer Drop-out-Rate von 30 % würden insgesamt 12 Patienten in jedem Arm für insgesamt 36 Patienten ausreichen; dies würde eine Leistung von 90 % erreichen. Das bedeutet, dass mindestens 10 Patienten pro Arm und maximal 12 Patienten pro Arm zu einer statistisch aussagekräftigen Studie führen.

   Statistischer Plan:

   Zur Berechnung der Bereiche, Mittelwerte und Varianzen für die unabhängigen Variablen Standardversorgung, Kryo, Kryo+Pembro werden deskriptive Statistiken verwendet. Dies legt nahe, dass die Konzentration der Beobachtungen um den Mittelwert und die Abweichung der Beobachtungen von den Mittelwerten liegen. Der Normalitätstest wird in Betracht gezogen, um zu prüfen, ob die Daten der Normalverteilung folgen oder nicht. Normale Quantil-Quantil-Plots (auch q-q-Plots genannt) werden verwendet, um zu bestimmen, ob Datensätze aus einer normalen Grundgesamtheit stammen. Um die Ausreißer (sofern vorhanden) zu erkennen, werden mehrere statistische Maßnahmen berücksichtigt. Zur Überprüfung der Varianzhomogenität für die unabhängigen Variablen Standardversorgung, Kryo, Kryo+Pembro wird der Levene-Test durchgeführt, indem Null- und Alternativhypothesen aufgestellt werden. Um den Signifikanzunterschied zwischen den Mittelwerten der Variablen zu vergleichen, wird eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Die Null- und Alternativhypothesen für die Mittel werden eingeführt. Bei der ANOVA wird die statistische Signifikanz der Mittelwerte (α = 0,05) unter Verwendung der F-Test-Statistik getestet. Wenn die Mittelwerte einen statistisch signifikanten Unterschied aufweisen, werden die Post-hoc-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Post-hoc-Mehrfachvergleichstests (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey usw.) werden verwendet, um die geeigneten signifikanten Gruppenmittelwerte zu ermitteln. Wenn die Proben die Normalitätsannahmen nicht erfüllen, werden mehrere nichtparametrische Tests für die statistischen Analysen in Betracht gezogen.

   Tumor-Kryoablation:

   Alle registrierten Patienten werden randomisiert einem der drei Arme der Studie zugeteilt. Patienten in den Armen II und III erhalten eine Kryoablation gemäß dem folgenden Protokoll (ähnlich dem in der ACOSOG Z1072-Studie verwendeten Protokoll).

   Kryoablationsgerät: Die Kryoablation wird mit dem im Handel erhältlichen kryochirurgischen ProSense-System (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israel) durchgeführt, das aus einer Konsole, einer Kryosonde und zugehörigen Behälterdewargefäßen mit flüssigem Stickstoff (Kryogen) besteht. Die Konsole ist eine eigenständige Einheit mit einer Schnittstelle zur Steuerung und Überwachung des Kryoablationsverfahrens. Es wird mit einer Standardspannung von 120 VAC (60 Hz) betrieben.

   Gerätebetrieb: Das Kryochirurgiesystem ProSense verwendet ein geschlossenes System, um flüssigen Stickstoff innerhalb der Kryosondenspitze zu zirkulieren, wodurch Temperaturen unter dem Gefrierpunkt erzeugt werden, die zur Ablation des Zielgewebes führen. Die Läsion wird mit Ultraschall identifiziert und die Kryosonde wird unter Ultraschallführung nach angemessener örtlicher Betäubung im Zentrum der Läsion platziert und die Ablation wird gemäß einem vorbestimmten Gefrier-Tau-Gefrier-Algorithmus durchgeführt. Die Sonde wird dann durch eine interne elektrische Widerstandsheizung erwärmt und aus dem Patienten entfernt. Kryoablationsverfahren: Der Tumor wird unter Verwendung einer hochauflösenden Linear-Array-Ultraschallsonde in zwei orthogonalen Ansichten identifiziert. Die längste Ausdehnung des Tumors wird zum parallelen Einführen der Sonde identifiziert. Diese Dimension wird in die Konsole eingegeben; Die Konsole gibt die Länge der Kryosondenspitze an, die beim Einführen über die Läsion hinausragt. Nach dem Einführen wird die Sondenposition in zwei orthogonalen Ansichten bestätigt. Die Kryoablation wird entsprechend der Tumorgröße im Gefrier-Tau-Gefrier-Zyklus durchgeführt. Das gesamte Verfahren wird unter Sicht überwacht und Kochsalzlösung wird infiltriert, um Hauterfrierungen zu vermeiden, indem die Haut von der Eiskugel weg hydrodisseziert wird. Die Größe des Eisballs wird in orthogonalen Dimensionen aufgezeichnet. Wenn ein Patient mehr als eine Läsion hat, wird in unserem Protokoll nur eine Läsion abgetragen; Biopsien von anderen Läsionen werden jedoch auf abskopale Auswirkungen untersucht.

   Infusion von Pembrolizumab und Dosierung:

   In einem ersten Schritt haben wir die Sicherheit und Verträglichkeit von Immun-Checkpoint-Inhibitoren mit Tumor-Kryoablation bei Frauen mit neu diagnostiziertem Brustkrebs bestätigt. Eine wichtige Überlegung war die Auswahl eines immunmodulierenden Antikörpers. Pembrolizumab, ein von der FDA zugelassener Antikörper gegen PD-1/PD-L1, hat ein gut etabliertes Sicherheitsprofil und induziert bei 10-20 % der Patienten mit fortgeschrittenem Melanom langfristige Remissionen von > 10 Jahren.50 Da T-Zellen die Expression von PD-1/PD-L1 akut hochregulieren, nachdem sie Antigenen ausgesetzt wurden,51 was wiederum die zytotoxische Reaktion abschwächen kann, ist Pembrolizumab ideal für die Immunmodulation in Kombination mit Kryoablation geeignet. Das Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) veröffentlichte eine Pilotstudie zu dieser Kombination; es wurden keine auf Ipilimumab zurückzuführenden schwerwiegenden Nebenwirkungen berichtet; keine Operation wurde verzögert. MSKCC verwendete 10 mg/kg als Einzeldosis; Da die Studien jedoch bei dieser Dosis über höhere unerwünschte Ereignisse berichten, schlagen wir die empfohlene Dosis von 200 mg für eine IV über 90 Minuten vor der Kryoablation vor, die derzeit im klinischen Umfeld für dreifach negative Krebsarten verwendet wird.

   Methodik für Ergebnismessungen:

   Wir werden die Immunantwort(en) nach den Kryoablationsverfahren mit und ohne Pembrolizumab beobachten und überwachen. Blutproben werden in EDTA-Blutentnahmeröhrchen entnommen und dann zu den angegebenen Zeitpunkten für die phänotypische T-Zell-Analyse und die Plasmaentnahme für Zytokin/Chemokin und für die RNA-Seq-Analyse aliquotiert. Pathologische Objektträger werden zu Forschungszwecken aus Kernbiopsieproben zu Studienbeginn und aus Lumpektomie und Wächterknoten zum Zeitpunkt der Operation angefertigt. Pro Probe (nach Abschluss der Routinepathologie) werden fünf Objektträger für H&E und Immunhistochemie für Immunzellinfiltrate angefertigt, um den TIL-Prozentsatz zu berechnen. Alle Mitarbeiter/Personal in Schlüsselpositionen, die an der Durchführung der Analyse der Ergebnismessung beteiligt sind, werden gegenüber den Randomisierungsgruppen verblindet.

   Im Folgenden finden Sie die Details für die Ergebnisanalyse:

   TIL-Berechnung: Alle Gewebeproben, die einer routinemäßigen pathologischen Berichterstattung unterzogen werden, werden für die TIL-Berichterstattung gemäß den Richtlinien der International TILs Working Group bewertet. Die Änderung des TIL-Scores zwischen dem ursprünglichen Kernbiopsiegewebe und dem chirurgischen Gewebe wird im Mittelpunkt der Analyse stehen, um die Auswirkungen der vorgeschlagenen Interventionen zu bewerten.

   Messung von T-Zell-Veränderungen im Blut: T-Zell-Subtypen können durch differentielle Expression von Zelloberflächenmarkern definiert werden. Wir werden T-Zellen auf Aktivierung, erhöhte CD8+-Effektor-T-Zellen und die Entwicklung von Effektor und zentralem Gedächtnis überwachen. Für die T-Zell-Phänotypisierung wird eine Vollblutfärbung (100 µl/Färbung) mit Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 und Ki67 mit geeigneten Isotypkontrollen durchgeführt.55 Nach der RBC-Lyse werden die gefärbten mononukleären Zellen auf einem Attune NxT 14-Farben-Durchflusszytometer (Thermofisher, Waltham, MA) laufen gelassen und unter Verwendung der FlowJo-Software (Becton, Dickinson and Company) analysiert. T-Zellen (CD3+, CD4+ oder CD8+) werden auf Veränderungen im naiven (CD27+, CCR7+, CD45RO-), Effektor- (CCR7-, CD45RO-), Effektor-Gedächtnis (CD27-, CCR7-, CD45RO+) und zentralen Gedächtnis ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) phänotypische Marker sowie für Aktivierung (ICOS und CD137) und Proliferation (Ki67). Wir werden die Prozentsätze der T-regulatorischen Zellen (CD25+, CD127-) weiter analysieren. Wir werden diese Daten verwenden, um eine T-Zell-Immunsignatur zu bestimmen, um die Wirksamkeit der Kryoablation +/- Pembrolizumab zu korrelieren, um die langfristige Anti-Tumor-Immunität vorherzusagen.

   Plasma-Zytokin-/Chemokin-Analyse: Unsere anfängliche Analyse besteht darin, zu bestimmen, welche Zytokine/Chemokine und welche Konzentrationen nach der Kryoablation +/- Pembrolizumab im Blut nachgewiesen werden und wie sich ihre Profile verändern. Wir werden uns auf die entzündlichen und Helfer-T-Zell-Zytokinprofile konzentrieren und wie diese Zytokine die T-Zell-Antwort beeinflussen und lenken. Darüber hinaus werden wir uns mit Veränderungen in Chemokinen befassen. Es wurde gezeigt, dass ihre veränderte Expression bei Malignomen die Rekrutierung und Aktivierung von Leukozyten, die Angiogenese, die Proliferation von Krebszellen und die Metastasierung in allen Stadien der Krankheit diktiert.56 Zu Studienbeginn, 24–48 Stunden nach der Ablation, zwischen der Prächemotherapie, wird Blut gesammelt und Plasma isoliert, indem 1–2 ml Blut bei 1–2000 x g für 10 Minuten zentrifugiert werden und dann 120 μl in 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert werden. Die Standard-of-Care-Gruppe hat nur 3 Blutentnahmezeitpunkte. Plasmaproben werden mit einem Bio-Plex 200 bei Eve Technologies Corporation (Calgary, AB, Kanada) unter Verwendung des Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14) analysiert: GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   DATENBLATT:

   Siehe Excel-Tabelle. Die RNA-Seq wird als Heatmaps für differentiell exprimierte Gene gesammelt.

   RISIKEN:

   Risiken der Blutentnahme:

   Zu den Risiken einer Blutabnahme gehören: Schmerzen, Beschwerden, Blutungen, Blutergüsse, Rötungen, Infektionen an der Stelle, an der die Nadel in die Haut eindringt; Schwindelgefühl, Ohnmacht.

   Kryoablationsbedingte Risiken:

   Die Kryoablation ist ein sehr sicheres Verfahren; PI hat dieses Verfahren routinemäßig für gutartige und Krebserkrankungen in der Brust angeboten; Bisher wurden 18 Krebspatienten und 36 gutartige Läsionen dem Verfahren unterzogen. Die folgenden leichten Komplikationen wurden bisher berichtet:

   • Blutergüsse an der Ablationsstelle - selbstlimitierend.
   • Schmerzen – behandelt mit OTC-Analgetika.
   • Hautnekrose ist jedoch eine theoretische Möglichkeit, wenn man das Verfahrensprotokoll befolgt; Wir hatten diese Komplikation noch nie.

   Risiken im Zusammenhang mit Pembrolizumab:

   Es wurden umfangreiche Studien zur Toxizität von Immun-Checkpoint-Inhibitoren durchgeführt.57 Die empfohlene Standarddosis für Pemrolizumab beträgt 200 mg i.v. pro Dosis (von der FDA zugelassen). Zu den erwarteten Nebenwirkungen gehören:

   • Ausschlag
   • Durchfall
   • Verstopfung
   • Brechreiz
   • Gewichtsverlust
   • Trockene Augen
   • Ermüdung
   • Kopfschmerzen
   • Fieber
   • Gelenkschmerzen
   • Schilddrüsenfunktionsstörung

   Verlust der Vertraulichkeit:

   Alle Daten werden in passwortgeschützten Dateien im Büro von CRI und PI aufbewahrt. Alle Daten werden für die Zusammenstellung und Analyse anonymisiert. Alle Protokolle zur HIPAA-Konformität werden befolgt. Aufgrund menschlicher Fehler ist jedoch ein minimales Risiko einer Verletzung der Vertraulichkeit möglich.

   VORTEILE:

   Die Patienten in Arm II und III können von der Teilnahme an der Studie profitieren. Wenn unsere Intuition der Immunmodulation durch Kombination von Kryotherapie und Checkpoint-Inhibitor-Medikament tatsächlich die Tumorkontrolle beeinflusst, werden diese beiden Gruppen direkt von der Teilnahme profitieren. Der Kontrollarm I wird jedoch nicht über die Bereitstellung eines Vergleichsarms für die Studie hinaus von der Studie profitieren. Das Hauptziel der vorgeschlagenen Studie ist die Identifizierung eines neuartigen risikoarmen Behandlungsansatzes für diese Hochrisikokrebsarten, der letztendlich den zukünftigen Krebspatienten zugute kommen wird.

   ÜBERWACHUNG:

   Um die Einhaltung des Studienprotokolls, der GCP-Richtlinien und der Forschungsrichtlinien und -verfahren des TTUHSC Human Research Protection Program während der Durchführung der Studie sowie der Qualitätsdaten sicherzustellen, wird ein Monitor im Clinical Research Institute die Überwachung der Studie durchführen. Der erste Überwachungsbesuch wird innerhalb von zwei Wochen nach Aufnahme des ersten Probanden in die Studie durchgeführt. Die nachfolgenden Überwachungsbesuche werden regelmäßig geplant, jedoch mindestens alle 2 Monate, wenn es einen aktiven Studienteilnehmer gibt, zu einem vom PI und dem Studienmonitor einvernehmlich vereinbarten Zeitrahmen. Alle gesammelten Daten werden zu 100 % auf das Quelldokument überprüft. Der Studienmonitor darf alle Studienunterlagen, d. h. Datenerhebungsbögen, Fragebögen, Arzneimittelverantwortung und Krankenakten im Rahmen der geltenden Vertraulichkeitsbestimmungen einsehen und prüfen.

   FINANZIERUNG:

   Beantragt für NIH-Stipendium R21