Raggruppamento dell'immunomodulazione con crioablazione (LOGIC) per i tumori al seno (LOGIC)

OBIETTIVI:

L'obiettivo principale dello studio proposto è valutare la sinergia della crioablazione del tumore e dell'inibitore del checkpoint immunitario nel carcinoma mammario ad alto rischio nell'uomo. Ciò sarà ottenuto confrontando la crioablazione da sola e la crioablazione in combinazione con pembrolizumab - un [inibitore del checkpoint (anticorpo anti PD-1/PD-L1) attualmente approvato dalla FDA come terapia del cancro] con l'attuale standard di cura, inclusa la resezione chirurgica. L'attuale standard delle terapie neoadiuvanti/adiuvanti rimarrà invariato per motivi etici di fornire lo standard di cura più noto a tutti i pazienti.

OBIETTIVI:

Proponiamo uno studio esplorativo prospettico randomizzato in cui i pazienti con carcinoma mammario invasivo triplo negativo in stadio clinico I/II saranno randomizzati a uno dei tre bracci dello studio:

1. Standard di cura - terapia neoadiuvante seguita da resezione chirurgica seguita da un'appropriata terapia adiuvante secondo necessità.
2. Braccio di crioablazione - crioablazione seguita da un'appropriata terapia neoadiuvante seguita da resezione chirurgica seguita da un'appropriata terapia adiuvante secondo necessità.

3. Crioablazione con Pembrolizumab - Dose singola di Pembrolizumab da 200 mg prima (entro 24-48 ore) della crioablazione seguita da un'appropriata terapia neoadiuvante seguita da resezione chirurgica seguita da un'appropriata terapia adiuvante secondo necessità.

   Le misure di esito includeranno l'analisi del sangue e del tumore della risposta immunitaria con citometria a flusso e analisi delle citochine al basale, dopo l'intervento e prima dell'intervento chirurgico. Verranno analizzati anche il tessuto della biopsia del nucleo al basale, la biopsia ripetuta prima della chemioterapia e la resezione del tumore per il microambiente tumorale.

   INTRODUZIONE / BACKGROUND / SIGNIFICATO:

   Cancro al seno ad alto rischio e necessità di nuovi approcci terapeutici: il cancro al seno triplo negativo, che rappresenta il 15-20% di tutte le diagnosi di cancro al seno, è considerato ad alto rischio. Mentre la resezione chirurgica rimane il cardine del trattamento, la spina dorsale terapeutica comprende la chemioterapia neoadiuvante e adiuvante. Per i pazienti che continuano ad avere una malattia residua significativa anche dopo la resezione chirurgica e il completamento della chemioterapia, vengono eseguite ulteriori terapie sistemiche aggressive come la capecitabina. Il sottotipo triplo negativo è associato al maggior numero di mutazioni nel genoma e la malattia non metastatica è associata al 17-20% di fallimento locale e al 35-40% di fallimento a distanza a 5-10 anni di follow-up. Questi dati suggeriscono che la diffusione ematogena micrometastatica si verifica in un numero considerevole di pazienti con carcinoma mammario ad alto rischio operabile e sono necessari approcci più recenti che potenziano il controllo locale controllando contemporaneamente la diffusione sistemica della malattia.

   Ambito dell'immunomodulazione: l'immunoterapia contro il cancro ha registrato un successo straordinario negli ultimi decenni. Gli antigeni che possono evocare risposte immunitarie antitumorali formano un bersaglio immunoterapeutico adatto. L'approccio delle terapie di blocco del checkpoint delle cellule T ha mostrato notevoli risposte cliniche in diversi tipi di tumori solidi come il melanoma, il carcinoma polmonare non a piccole cellule, il carcinoma della vescica e i tumori con deficit di riparazione del mismatch. Si ritiene che un'efficace risposta immunitaria antitumorale sia avviata dall'assorbimento di antigeni tumorali da parte delle cellule presentanti l'antigene (APC), che a loro volta li presentano, e forniscono segnali di co-stimolazione sia alle cellule T CD4+ che CD8+. Le APC, in particolare le cellule dendritiche, elaborano gli antigeni attraverso un percorso di elaborazione dell'antigene esogeno in cui il materiale delle cellule tumorali viene fagocitato e convertito in peptidi leganti HLA di classe I e classe II che vengono presentati rispettivamente alle cellule T CD8+ (presentazione incrociata) e CD4+. Utilizzando questa conoscenza, recenti studi di fase 1 hanno riportato una risposta migliorata alla terapia con inibitori del checkpoint immunitario in combinazione con la chemioterapia convenzionale nei tumori al seno triplo negativo. Certamente, la percentuale di linfociti infiltranti il ​​​​tumore (TIL) è stata identificata come un importante parametro immunologico, in particolare per i tumori al seno ad alto rischio, che correla con la risposta alla terapia sistemica, suggerendo un forte ruolo della risposta immunitaria dell'ospite nel controllo del cancro indipendentemente dall'intervento terapeutico .

   Limitazione dell'immunomodulazione - Le cellule T sono attori chiave nell'immunità antitumorale e quindi costituiscono l'obiettivo principale per la ricerca immunoterapeutica. L'attuale svolta nell'immunoterapia del cancro deriva dall'identificazione e dal targeting del meccanismo del checkpoint che coinvolge CTLA-4, PD-1 e PD-L1. CTLA-4 e PD-1 sono recettori co-inibitori presenti sulla superficie delle cellule T. Dopo essersi legati ai ligandi corrispondenti (rispettivamente CD 80/86 e PD-L1/L2), le cellule T diventano anergiche, un meccanismo fisiologico di tolleranza. Nel contesto del microambiente tumorale, l'espressione aberrante insieme all'esposizione cronica agli antigeni tumorali può portare a una soppressione indesiderata dell'immunità delle cellule T.

   I bloccanti del checkpoint sviluppati di recente, come l'inibitore PD-1/PD-L1, pembrolizumab, hanno fornito una nuova arma contro il cancro con risposte cliniche durature e remissioni a lungo termine. Tuttavia, il blocco del checkpoint ha dimostrato di essere più efficace nei tumori con un elevato carico di mutazioni, in linea con l'idea che il riconoscimento delle cellule T dei neo-antigeni svolga un ruolo importante nel blocco del checkpoint. Molti studi dimostrano che quando l'infiltrato di cellule T reattive al tumore è assente o basso (bassa percentuale di TIL), manca il substrato per il blocco del checkpoint. Inoltre, la maggior parte dei pazienti con i cosiddetti tumori ipermutati non risponde al blocco del checkpoint a causa dell'immuno-editing, che compromette la capacità delle cellule T di svolgere la loro attività citotossica di un'adeguata infiltrazione tumorale e il riconoscimento della classe HLA caricata con l'antigene tumorale io molecole. Pertanto migliorare la presentazione dell'antigene all'interno del tumore è essenziale affinché il blocco del checkpoint sia efficace.

   Ruolo delle terapie ablative - in particolare la crioablazione: l'ablazione termica con crioterapia, laser, radiofrequenza, microonde e ultrasuoni focalizzati rappresenta un'opportunità unica per affrontare sia il tumore primario che la malattia micrometastatica. Gli effetti dell'ablazione del tumore sono molteplici: (1) la distruzione della massa tumorale, la riduzione del carico tumorale e (2) il rilascio di antigeni tumorali, rendendoli disponibili per l'assorbimento da parte delle cellule presentanti l'antigene (APC) e il trattamento stesso porta a (3 ) il rilascio di modelli molecolari associati al danno (DAMP) e (4) l'induzione di una risposta fisiologica di guarigione della ferita. L'ablazione porta alla creazione di un deposito antigenico in situ contenente tutti i tipi di proteine ​​tumorali, che porta all'inizio della risposta immunitaria antitumorale sistemica che può potenzialmente eliminare la malattia metastatica occulta. L'ablazione dei tumori a temperature superiori a 65 °C porta alla denaturazione delle proteine. Ciò può influenzare le risposte immunitarie in modi opposti poiché le alte temperature denaturano i segnali di attivazione immunitaria, come i segnali di pericolo come le proteine ​​da shock termico (HSP). Pertanto la crioablazione è la tecnica ablativa più promettente, in quanto offre un'invasività minima, meno danni ai tessuti circostanti, una migliore conservazione degli antigeni tumorali e dati più affidabili sulla stimolazione immunitaria.

   Stimolazione immunitaria effettuata mediante crioablazione - Il congelamento e lo scongelamento durante la crioablazione induce la necrosi e l'up-regulation delle molecole DAMP che rendono le cellule tumorali più suscettibili agli APC e all'uccisione mediata da cellule T specifiche del tumore. La crioablazione sovraregola i DAMP, come HMG1, calreticulina, S100A8/A9 e HSP70, che stimolano il sistema immunitario attraverso il recettore per i prodotti finali della glicosilazione avanzata (RAGE) e i recettori toll-like e migliorano la presentazione dell'antigene. Inoltre, l'ambiente citochinico della zona centrale risultante dalla crioablazione è tipicamente un profilo citochinico Th1 di IL-2, INF-γ, TNF-α e IL-12.28 Queste citochine e DAMP guidano presumibilmente la risposta citotossica delle cellule T CD8+. Prove precliniche a sostegno della risposta immunitaria della crioablazione: diversi studi preclinici sulla crioimmunologia hanno esplorato se il congelamento del tumore e il suo abbandono in situ renderebbero l'animale resistente a un nuovo trattamento. I modelli animali che utilizzano linee cellulari di carcinoma e sarcoma in conigli e topi hanno dimostrato una resistenza specifica del tumore al re-challenge. Il re-challenge con le stesse linee cellulari tumorali ha mostrato resistenza alla crescita negli animali dopo la crioablazione rispetto alla resezione chirurgica. Un'esperienza simile è stata riportata da Blackwood e Cooper con modelli che coinvolgono ratti inoculati con linee cellulari di miosarcoma e carcinosarcoma. I ratti con tumori crioablati avevano maggiori probabilità di resistere alla nuova sfida e hanno dimostrato la regressione dei tumori secondari rispetto ai ratti trattati chirurgicamente. Bagley et al. ha confrontato la crioablazione con la chirurgia nell'utilizzo del fibrosarcoma MCA-10 nei topi C57BL/6, raccogliendo linfociti splenici a intervalli settimanali dopo il trattamento per i test di citotossicità. I topi sottoposti a crioablazione presentavano una citotossicità significativamente più elevata rispetto ai topi trattati chirurgicamente o non trattati. Sabel et al. ha studiato i tumori dell'adenocarcinoma mammario MT-901 nei topi BALB/c trattati con crioablazione o resezione chirurgica. Dopo il re-challenge, l'86% dei topi trattati con intervento chirurgico ha sviluppato un secondo tumore rispetto al 16% dei topi trattati con crioablazione. Questo era specifico del tumore, poiché la crioablazione non offriva alcuna protezione contro la sfida con altre linee cellulari. Più recentemente, Kim et al. utilizzando linee cellulari di carcinoma a cellule renali nei topi BALB/c hanno riportato risultati simili. Più recentemente, l'effetto abscopale della regressione del tumore nei tumori non trattati in modelli animali in cui solo uno dei tumori impiantati è stato crioablato, è stato riportato come risultato della risposta immunitaria sistemica.

   Prove cliniche a sostegno della risposta immunitaria della crioablazione: sebbene l'uso clinico della crioablazione per il cancro si sia recentemente ampliato, ci sono relativamente pochi studi che esaminano l'impatto immunologico negli esseri umani. Ravindranath et al. ha misurato il livello dei gangliosidi tumorali sierici e i loro titoli anticorpali in pazienti sottoposti a crioablazione, ablazione con radiofrequenza o resezione di metastasi epatiche da cancro del colon-retto. I livelli sierici di gangliosidi erano significativamente più alti nei pazienti crioablati rispetto alla radiofrequenza o alla chirurgia. I pazienti crioablati hanno anche dimostrato titoli più elevati di IgM contro i gangliosidi tumorali. Si et al. ha studiato 20 pazienti con carcinoma prostatico sottoposti a crioablazione del tumore primario e ha riportato un aumento dell'attività citolitica contro LNCaP e un aumento del numero di cellule T che producono IFN-ɣ. Takur et al. ha condotto uno studio pilota di crioablazione e GM-SCF per pazienti con carcinoma a cellule renali metastatico al polmone. GM-CSF è stato infiltrato vicino a una lesione metastatica polmonare selezionata per la crioablazione. Dopo la procedura è stata utilizzata una terapia aggiuntiva con GM-CSF. La combinazione di GM-CSF e crioablazione ha prodotto una risposta immunitaria potenziata in termini di citotossicità e anticorpi sierici.

   Limitazione della crioablazione: nonostante i dati esaminati sopra, la risposta immunitaria alla crioablazione non è stata uniforme. Alcuni studi preclinici sul sarcoma osteogenico e sui modelli di cancro alla prostata non sono riusciti a mostrare alcun aumento della funzione immunitaria dopo la crioablazione. Ancora più importante, diversi studi hanno riportato la soppressione immunitaria con la criochirurgia. La maggior parte di questi studi ha coinvolto linee cellulari di fibrosarcoma nei ratti e ha mostrato una ridotta resistenza al re-challenge dopo la crioablazione, nonché una maggiore crescita di tumori metastatici e tumori secondari. Dal punto di vista del cancro al seno, Sabel et al. riferito che un alto tasso di congelamento ha provocato un aumento delle cellule T specifiche del tumore nei linfonodi drenanti del tumore, riduzione delle metastasi polmonari e miglioramento della sopravvivenza rispetto ai bassi tassi di congelamento che avevano anche più Treg (CD3, CD4, CD127-, CD25 +). Pertanto, l'entità dell'effetto sistemico indotto dalla sola crioterapia si è dimostrata insufficiente o controproducente. L'attuale comprensione è che vicino alla fonte ablativa, la lesione diretta e la morte cellulare con necrosi rilasciano antigeni tumorali e (DAMP) che reclutano e attivano le cellule dendritiche che a loro volta stimolano la proliferazione delle cellule T e dei componenti immunitari. La zona di transizione lontana dalla fonte ablativa provoca lesioni cellulari indirette e morte cellulare per apoptosi senza rilascio di DAMP, che provoca il rilascio di citochine soppressive e delezione e anergia clonale delle cellule T. Intuitivamente, la crioablazione stimola una risposta immunitaria, ma l'impatto clinico finale è dettato dal rapporto tra cellule T effettrici CD4+ e cellule T regolatrici. Un più alto rapporto tra cellule T-effettrici e cellule T-regolatorie promuove la risposta più favorevole delle cellule T citotossiche CD8. Mentre le cellule citotossiche CD8+ eliminano il tumore primario e le micrometastasi sistemiche, è importante che l'anergia sia tenuta sotto controllo e che le cellule T di memoria sia effettrici (CD45RO+, CCR7-) che centrali (CCR7+, CD45RO+) siano stabilite per la protezione a lungo termine anti- immunità tumorale.

   IPOTESI:

   "La combinazione di crioablazione con Pembrolizumab per il controllo locale nel carcinoma mammario triplo negativo ad alto rischio è superiore alla sola resezione chirurgica o alla sola crioablazione nel generare una risposta immunitaria antitumorale".

   METODI:

   Sede di studio:

   Il lavoro esplorativo proposto è uno studio randomizzato che sarà condotto presso il Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center.

   Tipo di studio:

   Studio prospettico randomizzato - guidato da ipotesi

   Design sperimentale:

   Proponiamo uno studio randomizzato prospettico in singolo cieco, in cui le donne con carcinoma mammario triplo negativo in stadio I/II saranno arruolate in uno dei tre bracci in modo randomizzato 1:1:1: (I) braccio di controllo con chemioterapia neoadiuvante seguita da lumpectomia/ mastectomia con biopsia del linfonodo sentinella +/- dissezione ascellare; (II) Intervento con sola crioablazione seguita da chemioterapia neoadiuvante seguita da lumpectomia/mastectomia con biopsia del linfonodo sentinella +/- dissezione ascellare; (III) Intervento con crioablazione + Pembrolizumab seguito da chemioterapia neoadiuvante seguita da lumpectomia/mastectomia con biopsia del linfonodo sentinella +/- dissezione ascellare. Il programma di trattamento è progettato per ottimizzare il tempo di esposizione all'antigene [Figura-2]. La sperimentazione sarà registrata presso il National Clinical Trials Network una volta ottenuta l'approvazione dell'IRB.

   Soggetti:

   Tutti i pazienti di età pari o superiore a 18 anni con malattia tripla negativa in stadio clinico I/II potranno partecipare. Questi pazienti saranno sottoposti a screening durante un appuntamento oncologico/chirurgico dal team dello studio. Verrà utilizzato un elenco di randomizzazione computerizzato per l'assegnazione del braccio di trattamento utilizzando il sito web:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Criterio di inclusione:

   • Femmine
   • Cancro allo stadio I/II
   • Fascia d'età 18 - 89 anni
   • Diagnosi: carcinoma invasivo, ER -, PR-, HER2- (triplo negativo)
   • Reperti radiologici: malattia unifocale visibile agli ultrasuoni

   Criteri di esclusione:

   • Cancro primario aggiuntivo
   • Carcinoma mammario infiammatorio
   • Storia della malattia autoimmune
   • Storia di immunosoppressione cronica
   • Immunoterapia precedente
   • Vaccinazione recente (entro 4 sett.)
   • Precedente radioterapia
   • Precedente terapia con agenti sperimentali nell'ultimo anno
   • Gravidanza al momento della diagnosi e/o del trattamento
   • Allattamento al seno

   Visite studio:

   Verrà ottenuto il consenso informato, quindi il paziente verrà randomizzato. Tutte le visite coincideranno con le visite standard di cura. Successivamente, si verificherà quanto segue:

   Visita 1: Giorno 1:

   Prelievo di sangue di base; fino a 20ml saranno raccolti in provette EDTA; il sangue sarà centrifugato al TTUHSC. Il plasma sarà utilizzato per l'analisi delle citochine e la fenotipizzazione presso il laboratorio TTU. Un tubo EDTA verrà inviato all'Università di Houston (durante i punti temporali dello studio). Verranno misurati i seguenti risultati:

   Analisi delle citochine

   • Analisi PBMC di RNA seq Il tessuto bioptico del core al basale (già disponibile dal workup diagnostico) sarà valutato per: (2 vetrini non colorati saranno preparati per RNA seq da tessuto fissato)
   • FINO %
   • Tessuto tumorale RNA Seq

   Visita 2 (solo gruppo II e III) dopo la crioablazione: giorno 3 (+/- 7 giorni):

   Prelievo di sangue post-ablazione (Gruppo II e III) - fino a 10 ml di sangue in provette EDTA:

   • Analisi delle citochine

   Visita 3 (tutti i gruppi) Pre chemioterapia neoadiuvante: Giorno 21 (+/- 14 giorni):

   Prelievo di sangue al momento dell'inserimento della porta per la chemioterapia - fino a 20 ml di sangue in provette EDTA:

   • Fenotipizzazione immunitaria mediante citometria a flusso
   • Analisi delle citochine
   • Analisi RNA seq PBMC
   • La biopsia del tumore verrà ripetuta per l'analisi TIL e RNA seq

   Visita 4 (tutti i gruppi): resezione post-chemioterapia (circa 6 mesi dopo la biopsia originale):

   Prelievo di sangue preoperatorio fino a 20 ml di sangue in provette con EDTA (simile al basale):

   • Fenotipizzazione immunitaria mediante citometria a flusso
   • Analisi delle citochine
   • Analisi RNA seq PBMC Analisi del tessuto del campione chirurgico (2 vetrini non colorati da tessuti fissati saranno preparati per RNA seq)
   • FINO%
   • Tessuto tumorale RNA seq

   Misura di prova:

   I linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL), in particolare nello stroma del carcinoma mammario triplo negativo, sono prognostici e predittivi della risposta alla terapia. Pertanto, le raccomandazioni dell'International TILs Working Group sono state utilizzate per calcolare la dimensione del campione per questo progetto. Si presume che la variazione percentuale dei TIL sia del 10% per il braccio di controllo e del 50% per il braccio di trattamento. Un campione di 10 pazienti per gruppo può raggiungere l'80% di potenza per rilevare una differenza media di 0,4 (0,5 vs. 0,1) con una deviazione standard di 0,3, utilizzando un t-test di varianza uguale a due campioni a due code (alfa=0,05) . Supponendo un tasso di abbandono del 30%, un totale di 12 pazienti in ciascun braccio sarebbe sufficiente per un totale di 36 pazienti; questo raggiungerebbe una potenza del 90%. Ciò significa che un minimo di 10 pazienti per braccio e un massimo di 12 pazienti per braccio porteranno a uno studio statisticamente significativo.

   Piano statistico:

   Le statistiche descrittive saranno utilizzate per calcolare gli intervalli, le medie e le varianze per le variabili indipendenti standard care, cryo, cryo+pembro. Ciò suggerirà che la concentrazione delle osservazioni attorno alla media e la variazione delle osservazioni rispetto alle medie. Verrà preso in considerazione il test di normalità per verificare se i dati seguono o meno la distribuzione normale. Verranno utilizzati grafici quantile-quantile normali (chiamati anche grafici q-q) per determinare se i set di dati provengono da una popolazione normale. Per rilevare i valori anomali (se presenti) verranno prese in considerazione diverse misure statistiche. Per verificare l'omogeneità delle varianze per le variabili indipendenti standard care, cryo, cryo+pembro, verrà eseguito il test di Levene ponendo ipotesi nulle e alternative. Per confrontare la differenza di significatività tra le medie delle variabili, verrà eseguita un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Verranno introdotte le ipotesi nulle e alternative per i mezzi. In ANOVA, la significatività statistica delle medie sarà testata (α = 0,05) utilizzando la statistica F-test. Se le medie vengono rilevate differenze statisticamente significative, verranno eseguiti i test di confronto multiplo post-hoc. Verranno utilizzati post-hoc test di comparazione multipla (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey, ecc.) per rilevare le medie di gruppo significative appropriate. Se i campioni non soddisfano le ipotesi di normalità, verranno presi in considerazione diversi test non parametrici per le analisi statistiche.

   Crioablazione tumorale:

   Tutti i pazienti registrati saranno randomizzati a uno dei tre bracci dello studio. I pazienti nel braccio II e III riceveranno la crioablazione secondo il seguente protocollo (simile al protocollo utilizzato nello studio ACOSOG Z1072).

   Dispositivo di crioablazione: la crioablazione verrà eseguita utilizzando il sistema criosurgico ProSense disponibile in commercio (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israele) costituito da una console, criosonda e azoto liquido associato (criogeno) Case Dewars. La console è un'unità autonoma dotata di un'interfaccia per il controllo e il monitoraggio della procedura di crioablazione. Funziona con alimentazione standard da 120 VAC (60Hz).

   Funzionamento del dispositivo: il sistema criochirurgico ProSense utilizza un sistema chiuso per far circolare l'azoto liquido all'interno della punta della criosonda creando temperature sotto lo zero che determinano l'ablazione del tessuto bersaglio. La lesione viene identificata con gli ultrasuoni e la criosonda viene posizionata al centro della lesione sotto guida ecografica dopo un'adeguata anestesia locale e l'ablazione viene eseguita secondo un algoritmo di congelamento-scongelamento predeterminato. La sonda viene quindi riscaldata da un riscaldatore a resistenza elettrica interna e rimossa dal paziente. Procedura di crioablazione: il tumore viene identificato utilizzando una sonda ecografica lineare ad alta risoluzione in due viste ortogonali. La dimensione più lunga del tumore viene identificata per l'inserimento parallelo della sonda. Questa dimensione viene inserita nella console; la console fornisce la lunghezza della punta della criosonda oltre la lesione al momento dell'inserimento. Dopo l'inserimento, la posizione della sonda viene confermata in due viste ortogonali. La crioablazione viene eseguita utilizzando il ciclo di congelamento-scongelamento in base alle dimensioni del tumore. L'intera procedura viene monitorata sotto visione e la soluzione salina viene infiltrata per evitare il congelamento della pelle mediante idrodissezione della pelle lontano dalla palla di ghiaccio. La dimensione della palla di ghiaccio è registrata in dimensioni ortogonali. Nel nostro protocollo, se un paziente ha più di una lesione, verrà ablata solo una lesione; tuttavia le biopsie di altre lesioni saranno studiate per l'affetto abscopale.

   Infusione di Pembrolizumab e dosaggio:

   Come primo passo, abbiamo confermato la sicurezza e la tollerabilità degli inibitori del checkpoint immunitario con la crioablazione del tumore nelle donne con carcinoma mammario di nuova diagnosi. Una considerazione importante è stata la selezione di un anticorpo immunomodulante. Pembrolizumab, un anticorpo approvato dalla FDA contro PD-1/PD-L1, ha un profilo di sicurezza consolidato e induce remissioni a lungo termine che durano >10 anni nel 10-20% dei pazienti con melanoma avanzato.50 Inoltre, poiché le cellule T sovraregolano in modo acuto l'espressione di PD-1/PD-L1 dopo essere state esposte agli antigeni,51 che a loro volta possono attenuare la risposta citotossica, il pembrolizumab è ideale per la modulazione immunitaria in combinazione con la crioablazione. Il Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) ha pubblicato uno studio pilota su questa combinazione; non sono stati segnalati effetti collaterali gravi attribuibili a ipilimumab; nessun intervento chirurgico è stato ritardato. MSKCC ha utilizzato 10 mg/Kg in dose singola; tuttavia, poiché gli studi riportano eventi avversi più elevati a quella dose, proponiamo la dose raccomandata di 200 mg per IV in 90 minuti prima della crioablazione, che è la dose attualmente utilizzata in ambito clinico per i tumori tripli negativi.

   Metodologia per le misure di esito:

   Osserveremo e monitoreremo la/le risposta/i immunitaria/i seguendo le procedure di crioablazione con e senza il pembrolizumab. I campioni di sangue saranno raccolti in provette per la raccolta del sangue con EDTA e quindi aliquotati per l'analisi fenotipica delle cellule T e la raccolta del plasma per citochine/chemochine e per l'analisi del sequenziamento dell'RNA, nei punti temporali indicati. Verranno realizzati vetrini patologici per la ricerca da campioni di biopsia centrale al basale e da lumpectomia e linfonodi sentinella al momento dell'intervento chirurgico. Verranno realizzati cinque vetrini per campione (dopo il completamento della patologia di routine) per H&E e immunoistochimica per infiltrati di cellule immunitarie per calcolare la percentuale di TIL. Tutti i collaboratori/personale chiave coinvolti nell'esecuzione dell'analisi della misura dei risultati saranno ciechi rispetto ai gruppi di randomizzazione.

   Di seguito sono riportati i dettagli per l'analisi dei risultati:

   Calcolo TIL: tutti i campioni di tessuto sottoposti a refertazione patologica di routine saranno valutati per la refertazione TIL secondo le linee guida stabilite dall'International TILs Working Group. Il cambiamento nel punteggio TIL tra il tessuto bioptico del nucleo originale e il tessuto chirurgico sarà al centro dell'analisi per valutare l'impatto degli interventi proposti.

   Misurazione dei cambiamenti delle cellule T nel sangue: i sottotipi delle cellule T possono essere definiti dall'espressione differenziale dei marcatori di superficie cellulare. Monitoreremo l'attivazione delle cellule T, l'aumento delle cellule T effettrici CD8+ e lo sviluppo della memoria centrale ed effettrice. Per la fenotipizzazione delle cellule T, verrà eseguita la colorazione del sangue intero (100 µl/colorazione) con anticorpi contro CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 e Ki67 con controlli isotipici appropriati.55 Dopo la lisi dei globuli rossi, le cellule mononucleari colorate verranno analizzate su un citometro a flusso a 14 colori Attune NxT (Thermofisher, Waltham, MA) e analizzate utilizzando il software FlowJo (Becton, Dickinson and Company). Le cellule T (CD3+, CD4+ o CD8+) saranno analizzate per i cambiamenti nella memoria naïve (CD27+, CCR7+, CD45RO-), effettrice (CCR7-, CD45RO-), effettrice (CD27-, CCR7-, CD45RO+) e centrale ( marcatori fenotipici CD27+, CCR7+, CD45RO+), nonché per l'attivazione (ICOS e CD137) e la proliferazione (Ki67). Analizzeremo ulteriormente le percentuali di cellule T regolatorie (CD25+, CD127-). Utilizzeremo questi dati per determinare una firma immunitaria delle cellule T per correlare l'efficacia della crioablazione+/- Pembrolizumab per prevedere l'immunità antitumorale a lungo termine.

   Analisi delle citochine/chemochine plasmatiche: la nostra analisi iniziale sarà determinare quali citochine/chemochine e quali concentrazioni vengono rilevate nel sangue dopo la crioablazione +/- pembrolizumab e in che modo i loro profili vengono alterati. Ci concentreremo sui profili delle citochine infiammatorie e delle cellule T helper e su come queste citochine influenzano e dirigono la risposta delle cellule T. Inoltre, esamineremo i cambiamenti nelle chemochine. È stato dimostrato che la loro espressione alterata nei tumori maligni determina il reclutamento e l'attivazione dei leucociti, l'angiogenesi, la proliferazione delle cellule tumorali e le metastasi in tutti gli stadi della malattia.56 Al basale, 24-48 ore dopo l'ablazione, prima della chemioterapia, il sangue sarà raccolto e il plasma isolato mediante centrifugazione di 1-2 ml di sangue a 1-2000 x g per 10 minuti e quindi aliquotando 120 µl in provette da microcentrifuga da 0,65 mL. Il gruppo standard di cura avrà solo 3 punti temporali per il prelievo di sangue. I campioni di plasma saranno analizzati con un Bio-Plex 200 presso Eve Technologies Corporation (Calgary, AB Canada) utilizzando il Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   SCHEDA DATI:

   Vedere Foglio di calcolo Excel. Gli RNA seq saranno raccolti come mappe di calore per geni differenzialmente espressi.

   RISCHI:

   Rischi di prelievo di sangue:

   I rischi di un prelievo di sangue includono: dolore, disagio, sanguinamento, lividi, arrossamento, infezione nel punto in cui l'ago penetra nella pelle; sensazione di stordimento, svenimento.

   Rischi correlati alla crioablazione:

   La crioablazione è stata una procedura molto sicura; PI ha offerto di routine questa procedura a malattie benigne e tumorali al seno; finora sono stati sottoposti alla procedura 18 pazienti oncologici e 36 lesioni benigne. Finora sono state riportate le seguenti complicanze lievi:

   • Lividi nel sito di ablazione - autolimitati.
   • Dolore - gestito con analgesici OTC.
   • La necrosi cutanea è tuttavia una possibilità teorica, seguendo il protocollo della procedura; non abbiamo mai avuto questa complicazione.

   Rischi correlati a pembrolizumab:

   Sono stati condotti studi approfonditi sulla tossicità degli inibitori del checkpoint immunitario.57 La dose standard raccomandata per Pemrolizumab è di 200 mg EV per dose (approvata dalla FDA). Gli effetti avversi previsti includono:

   • Eruzione cutanea
   • Diarrea
   • Stipsi
   • Nausea
   • Perdita di peso
   • Occhi asciutti
   • Fatica
   • Mal di testa
   • Febbre
   • Dolori articolari
   • Disfunzione tiroidea

   Perdita di riservatezza:

   Tutti i dati saranno conservati in file protetti da password all'interno dell'ufficio di CRI e PI. Tutti i dati saranno resi anonimi per la compilazione e l'analisi. Saranno seguiti tutti i protocolli per la conformità HIPAA. Tuttavia, un rischio minimo di violazione della riservatezza è possibile a causa di un errore umano.

   BENEFICI:

   I pazienti del braccio II e III possono beneficiare della partecipazione allo studio. Se la nostra intuizione della modulazione immunitaria attraverso la combinazione di crioterapia e farmaco inibitore del checkpoint influisce effettivamente sul controllo del tumore, questi due gruppi beneficeranno direttamente della partecipazione. Tuttavia, il braccio di controllo I non beneficerà della sperimentazione oltre a fornire un braccio di confronto per lo studio. L'obiettivo principale dello studio proposto è identificare un nuovo approccio terapeutico a basso rischio per questi tumori ad alto rischio, che alla fine andrà a beneficio dei futuri malati di cancro.

   MONITORAGGIO:

   Per garantire la conformità con il protocollo dello studio, le linee guida GCP e le politiche e le procedure di ricerca del Programma di protezione della ricerca umana TTUHSC durante lo svolgimento dello studio, nonché dati di qualità, un monitor presso l'Istituto di ricerca clinica condurrà il monitoraggio dello studio. La prima visita di monitoraggio sarà condotta entro due settimane dall'arruolamento del primo soggetto nello studio. Le successive visite di monitoraggio saranno programmate periodicamente, ma non meno di ogni 2 mesi quando c'è un partecipante attivo allo studio, in un lasso di tempo reciprocamente concordato dal PI e dal monitor dello studio. Tutti i dati raccolti saranno verificati al 100% dal documento di origine. Il monitor dello studio può ispezionare e controllare tutti i documenti dello studio, vale a dire i moduli per la raccolta dei dati, i questionari, la responsabilità del farmaco e le cartelle cliniche nel rispetto delle normative sulla riservatezza applicabili.

   FINANZIAMENTO:

   Domanda per la sovvenzione NIH R21