Immuunimodulaation ryhmittely kryoablaatiolla (LOGIC) rintasyöville (LOGIC)

TAVOITTEET:

Ehdotetun tutkimuksen päätavoitteena on arvioida kasvaimen kryoablaation ja immuunitarkastuspisteen estäjän synergiaa korkean riskin rintasyövässä ihmisillä. Tämä saavutetaan vertaamalla kryoablaatiota yksinään ja kryoablaatiota yhdessä pembrolitsumabin kanssa - [tarkistuspisteen estäjä (anti-PD-1/PD-L1-vasta-aine), joka on tällä hetkellä FDA:n hyväksymä syövän hoitoon] nykyiseen hoitostandardiin, mukaan lukien kirurginen resektio. Nykyinen neoadjuvantti-/adjuvanttihoitojen standardi säilyy ennallaan eettisistä syistä tarjota tunnetuin hoitotaso kaikille potilaille.

TAVOITTEET:

Ehdotamme prospektiivista satunnaistettua tutkivaa tutkimusta, jossa potilaat, joilla on kliinisen vaiheen I/II, kolminkertaisesti negatiivinen invasiivinen rintasyöpä, satunnaistetaan johonkin tutkimuksen kolmesta haarasta:

1. Hoitostandardi - neoadjuvanttihoito, jota seuraa kirurginen resektio ja asianmukainen adjuvanttihoito tarvittaessa.
2. Kryoablaatiokäsivarsi - kryoablaatio, jota seuraa asianmukainen neoadjuvanttihoito, jota seuraa kirurginen resektio ja asianmukainen adjuvanttihoito tarvittaessa.

3. Kryoablaatio pembrolitsumabilla – 200 mg:n pembrolitsumabin kerta-annos ennen (24–48 tunnin sisällä) kryoablaatiota, jota seuraa sopiva neoadjuvanttihoito, jonka jälkeen kirurginen resektio ja sopiva adjuvanttihoito tarvittaessa.

   Tulostoimenpiteisiin kuuluu immuunivasteen veri- ja kasvainanalyysi virtaussytometrialla ja sytokiinianalyysi lähtötilanteessa, toimenpiteen jälkeen ja ennen leikkausta. Kudokset ydinbiopsiasta lähtötilanteessa, toista biopsia ennen kemoterapiaa ja kasvaimen resektio analysoidaan myös kasvaimen mikroympäristön suhteen.

   JOHDANTO / TAUSTA / MERKITYS:

   Korkean riskin rintasyöpä ja uusien hoitomenetelmien tarve: Kolminkertaisesti negatiivinen rintasyöpä, joka edustaa 15-20 % kaikista rintasyöpädiagnooseista, katsotaan korkean riskin riskiksi. Vaikka kirurginen resektio on edelleen hoidon peruspilari, terapeuttinen runko sisältää neoadjuvantti- ja adjuvanttikemoterapian. Potilaille, joilla on edelleen merkittävä jäännössairaus jopa kirurgisen resektion ja kemoterapian päätyttyä, suoritetaan muita aggressiivisia systeemisiä hoitoja, kuten kapesitabiinia. Kolminkertaisesti negatiiviseen alatyyppiin liittyy suurin määrä mutaatioita koko genomissa, ja ei-metastaattinen sairaus liittyy 17-20 % paikalliseen epäonnistumiseen ja 35-40 % etäiseen epäonnistumiseen 5-10 vuoden seurannassa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että mikrometastaattinen hematogeeninen leviäminen tapahtuu huomattavalla määrällä potilaita, joilla on operoitavissa oleva korkean riskin rintasyöpä, ja tarvitaan uudempia lähestymistapoja, jotka tehostavat paikallista kontrollia ja samalla kontrolloivat taudin systeemistä leviämistä.

   Immuunimodulaation laajuus: Syövän immunoterapia on kokenut poikkeuksellista menestystä viime vuosikymmeninä. Antigeenit, jotka voivat herättää kasvainten vastaisia ​​immuunivasteita, muodostavat sopivan immunoterapeuttisen kohteen. T-solujen tarkistuspisteen salpaushoitojen lähestymistapa on osoittanut merkittäviä kliinisiä vasteita useiden kiinteiden syöpien tyypeissä, kuten melanoomassa, ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä, virtsarakon syövissä ja epäsopivuuskorjauspuutteellisissa syövissä. Tehokkaan kasvainten vastaisen immuunivasteen uskotaan alkavan ottamalla tuumoriantigeenejä antigeenia esitteleviin soluihin (APC), jotka puolestaan ​​esittelevät niitä ja tarjoavat yhteisstimulatorisia signaaleja sekä CD4+- että CD8+-T-soluille. APC:t, erityisesti dendriittisolut, prosessoivat antigeenejä eksogeenisen antigeenin prosessointireitin kautta, jossa kasvainsolumateriaali fagosytooituu ja muunnetaan HLA:n luokan I ja luokan II sitoviksi peptideiksi, jotka esitetään CD8+ (ristiesitys) ja CD4+ T-soluille, vastaavasti. Hyödyntämällä tätä tietoa, viimeaikaiset vaiheen 1 tutkimukset ovat raportoineet tehostuneen vasteen immuunitarkistuspisteen estäjähoitoon yhdistettynä tavanomaiseen kemoterapiaan kolminegatiivisissa rintasyövissä. Varmasti kasvaimeen infiltroivien lymfosyyttien (TIL) prosenttiosuus on tunnistettu tärkeäksi immunologiseksi parametriksi erityisesti korkean riskin rintasyöpien kohdalla, joka korreloi systeemiseen hoitoon kohdistuvan vasteen kanssa, mikä viittaa isännän immuunivasteen vahvaan rooliin syövän hallinnassa terapeuttisesta interventiosta riippumatta. .

   Immuunimodulaation rajoitus - T-solut ovat avaintoimijoita kasvainten vastaisessa immuniteetissa ja muodostavat siksi immunoterapeuttisen tutkimuksen pääkohteen. Nykyinen läpimurto syövän immunoterapiassa johtuu CTLA-4:n, PD-1:n ja PD-L1:n tarkistuspistemekanismin tunnistamisesta ja kohdistamisesta. CTLA-4 ja PD-1 ovat samanaikaisesti estäviä reseptoreita, joita löytyy T-solujen pinnasta. Sitoutuessaan vastaaviin ligandeihinsa (CD 80/86 ja PD-L1/L2, vastaavasti), T-soluista tulee anergisiä - fysiologinen toleranssimekanismi. Kasvainmikroympäristön yhteydessä poikkeava ilmentyminen yhdessä kroonisen altistumisen kanssa kasvainantigeeneille voi johtaa ei-toivottuun T-soluimmuniteetin suppressioon.

   Äskettäin kehitetyt tarkistuspisteiden salpaajat, kuten PD-1/PD-L1-estäjä pembrolitsumabi, ovat tarjonneet uuden aseen syöpää vastaan, jolla on kestävät kliiniset vasteet ja pitkäkestoiset remissiot. Tarkistuspisteiden salpauksen on kuitenkin osoitettu olevan tehokkain kasvaimissa, joissa on suuri mutaatiotaakka, sen käsityksen mukaisesti, että neoantigeenien T-solujen tunnistamisella on tärkeä rooli tarkistuspisteen salpauksessa. Monet tutkimukset osoittavat, että kun kasvaimeen reaktiivinen T-soluinfiltraatti puuttuu tai sitä on vähän (pieni TIL:ien prosenttiosuus), substraatti tarkistuspisteen salpaukselle puuttuu. Lisäksi suurin osa potilaista, joilla on ns. hypermutatoituneita kasvaimia, ei reagoi tarkistuspisteen estoon immuunijärjestelmän muokkauksen vuoksi, mikä heikentää T-solujen kykyä täyttää sytotoksista aktiivisuuttaan eli riittävää kasvaimen infiltraatiota ja kasvainantigeenilla kuormitetun HLA-luokan tunnistamista. I-molekyylejä. Siksi antigeenin esittelyn tehostaminen kasvaimessa on välttämätöntä, jotta tarkistuspisteen salpaus olisi tehokasta.

   Ablatiivisten hoitojen rooli – erityisesti kryoablaatio: Lämpöablaatio kryoterapian, laserin, radiotaajuuden, mikroaaltouunin ja fokusoidun ultraäänen avulla tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden käsitellä sekä primaarista kasvainta että mikrometastaattista sairautta. Kasvaimen ablaation vaikutukset ovat moninkertaiset: (1) kasvainmassan tuhoutuminen, kasvainkuormituksen aleneminen ja (2) kasvainantigeenien vapautuminen, jolloin ne saadaan antigeenia esittelevien solujen (APC) otettaviksi, ja itse hoito johtaa (3) ) vaurioon liittyvien molekyylimallien (DAMP) vapautuminen ja (4) fysiologisen haavan paranemisvasteen induktio. Ablaatio johtaa in situ -antigeenivaraston luomiseen, joka sisältää kaikentyyppisiä kasvainproteiineja, mikä johtaa systeemisen kasvainten vastaisen immuunivasteen alkamiseen, joka voi mahdollisesti eliminoida piilevän metastaattisen taudin. Kasvainten ablaatio yli 65 °C:n lämpötiloissa johtaa proteiinien denaturoitumiseen. Tämä voi vaikuttaa immuunivasteisiin vastakkaisilla tavoilla, koska korkeat lämpötilat denaturoivat immuunijärjestelmää aktivoivia signaaleja, kuten vaarasignaaleja, kuten lämpösokkiproteiineja (HSP). Siksi kryoablaatio on lupaavin ablaatiotekniikka, koska se tarjoaa minimaalisen invasiivisuuden, vähemmän vaurioita ympäröiville kudoksille ja paremman tuumoriantigeenien säilymisen ja vankimmat tiedot immuuni stimulaatiosta.

   Kryoablaation aikaansaama immuunistimulaatio - Jäädytys ja sulatus kryoablaation aikana indusoi nekroosia ja DAMP-molekyylien lisääntymistä, mikä tekee kasvainsoluista herkempiä APC:ille ja kasvainspesifiselle T-soluvälitteiselle tappamiselle. Kryoablaatio lisää DAMP-säätelyä, kuten HMG1, kalretikuliini, S100A8/A9 ja HSP70, jotka stimuloivat immuunijärjestelmää Receptor for Advanced Glycosylation End-products (RAGE) -reseptorin ja maksun kaltaisten reseptorien kautta ja tehostavat antigeenin esitystä. Lisäksi kryoablaatiosta johtuva keskusvyöhykkeen sytokiinimiljöö on tyypillisesti IL-2:n, INF-y:n, TNF-a:n ja IL-12.28:n Th1-sytokiiniprofiili. Nämä sytokiinit ja DAMP:t oletettavasti ohjaavat sytotoksista CD8+ T-soluvastetta. Kryoablaation immuunivastetta tukevat prekliiniset todisteet: Useat prekliiniset kryoimmunologiatutkimukset selvittivät, tekisivätkö kasvaimen jäädyttäminen ja sen jättäminen paikalleen eläimen vastustuskykyiseksi uudelleenaltistusta vastaan. Eläinmallit, joissa käytettiin karsinooma- ja sarkoomasolulinjoja kaneissa ja hiirissä, osoittivat kasvainspesifistä vastustuskykyä uudelleenaltistusta vastaan. Uudelleenaltistus samoilla kasvainsolulinjoilla osoitti vastustuskykyä kasvulle eläimissä kryoablaation jälkeen verrattuna kirurgiseen resektioon. Blackwood ja Cooper raportoivat samanlaisen kokemuksen malleista, joissa rottia oli rokotettu myosarkooma- ja karsinosarkoomasolulinjoilla. Rotat, joilla oli kryoabloituneita kasvaimia, vastustivat todennäköisemmin uudelleenaltistusta ja osoittivat sekundaaristen kasvainten regressiota verrattuna kirurgisesti käsiteltyihin rottiin. Bagley et ai. verrattiin kryoablaatiota leikkaukseen käyttämällä MCA-10-fibrosarkoomaa C57BL/6-hiirillä, keräten pernan lymfosyyttejä viikoittain hoidon jälkeen sytotoksisuusmäärityksiä varten. Hiirillä, joille tehtiin kryoablaatio, oli merkittävästi korkeampi sytotoksisuus kuin kirurgisesti käsitellyillä tai hoitamattomilla hiirillä. Sabel et ai. tutki MT-901 rintarauhasen adenokarsinoomakasvaimia BALB/c-hiirillä, joita hoidettiin kryoablaatiolla tai kirurgisella resektiolla. Uudelleen altistuksen jälkeen 86 %:lle leikkauksella hoidetuista hiiristä kehittyi toisia kasvaimia verrattuna 16 %:iin kryoablaatiolla hoidetuista hiiristä. Tämä oli kasvainspesifistä, koska kryoablaatio ei tarjonnut suojaa muita solulinjoja vastaan. Viime aikoina Kim et ai. käyttämällä munuaissolukarsinoomasolulinjoja BALB/c-hiirissä raportoivat samanlaisia ​​tuloksia. Viime aikoina kasvaimen regression abskopaalinen vaikutus hoitamattomissa kasvaimissa eläinmalleissa, joissa vain yksi istutetuista kasvaimista oli kryoabloitunut, on raportoitu systeemisen immuunivasteen seurauksena.

   Kliininen näyttö, joka tukee kryoablaation immuunivastetta: Vaikka kryoablaation kliininen käyttö syövän hoidossa on viime aikoina laajentunut, on olemassa suhteellisen vähän tutkimuksia, joissa tutkitaan immunologista vaikutusta ihmisiin. Ravindranath et ai. mittasi seerumin kasvaimen gangliosidien tasoa ja niiden vasta-ainetiittereitä potilailla, jotka saivat kryoablaatiota, radiotaajuista ablaatiota tai maksametastaasin resektiota paksusuolen syövästä. Seerumin gangliosiditasot olivat merkitsevästi korkeammat kryoabloiduilla potilailla verrattuna radiotaajuiseen tai leikkaushoitoon. Kryoabloidut potilaat osoittivat myös korkeampia IgM-tiittereitä kasvaingangliosideja vastaan. Si et ai. tutki 20 eturauhassyöpäpotilasta, joille tehtiin primaarisen kasvaimen kryoablaatio, ja raportoi sytolyyttisen aktiivisuuden lisääntymisestä LNCaP:tä vastaan ​​ja IFN:ää tuottavien T-solujen määrän lisääntymisestä. Thakur et ai. suoritti pilottitutkimuksen kryoablaatiosta ja GM-SCF:stä potilaille, joilla oli keuhkoihin metastaattista munuaissolukarsinoomaa. GM-CSF infiltroitiin lähelle kryoablaatiota varten valittua keuhkojen metastaattista vauriota. Toimenpiteen jälkeen käytettiin lisää GM-CSF-hoitoa. GM-CSF:n ja kryoablaation yhdistelmä tuotti tehostetun immuunivasteen sytotoksisuuden ja seerumin vasta-aineiden suhteen.

   Kryoablaation rajoitus: Huolimatta yllä tarkastetuista tiedoista immuunivaste kryoablatiolle ei ole ollut tasainen. Jotkut prekliiniset tutkimukset osteogeenisestä sarkoomasta ja eturauhassyöpämalleista eivät osoittaneet immuunitoiminnan lisääntymistä kryoablaation jälkeen. Vielä tärkeämpää on, että useat tutkimukset ovat raportoineet immuunivasteen heikkenemisestä kryokirurgian avulla. Suurin osa näistä tutkimuksista koski fibrosarkoomasolulinjoja rotilla ja osoitti heikentynyttä vastustuskykyä uudelleenaltistusta vastaan ​​kryoablaation jälkeen sekä metastaattisten kasvainten ja sekundaaristen kasvainten lisääntyneen kasvun. Rintasyövän näkökulmasta Sabel et ai. raportoi, että korkea jäätymisnopeus johti kasvainspesifisten T-solujen lisääntymiseen kasvaimen tyhjentävissä imusolmukkeissa, keuhkojen etäpesäkkeiden vähenemiseen ja parantuneeseen eloonjäämiseen verrattuna alhaisiin jäätymisnopeuksiin, joissa oli myös enemmän Tregejä (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Siksi pelkän kryoterapian aiheuttaman systeemisen vaikutuksen suuruus on osoittautunut joko riittämättömäksi tai kielteiseksi. Nykyinen ymmärrys on, että lähellä ablatiivista lähdettä, suora vaurio ja solukuolema nekroosin kanssa vapauttavat kasvainantigeenejä ja (DAMP:ita), jotka värväävät ja aktivoivat dendriittisoluja, jotka puolestaan ​​stimuloivat T-solujen ja immuunikomponenttien lisääntymistä. Siirtymävyöhyke pois ablatiivisesta lähteestä aiheuttaa epäsuoran soluvaurion ja apoptoottisen solukuoleman ilman DAMP:ien vapautumista, mikä aiheuttaa suppressiivisten sytokiinien vapautumista ja T-solujen klonaalisten deleetioiden ja anergian. Intuitiivisesti kryoablaatio stimuloi immuunivastetta, mutta lopullisen kliinisen vaikutuksen määrää CD4+ T-efektorisolujen suhde T-säätelysoluihin. Korkeampi T-efektorin ja T-säätelysolujen suhde edistää suotuisampaa CD8 sytotoksista T-soluvastetta. Vaikka CD8+ sytotoksiset solut eliminoivat primaarisen kasvaimen ja systeemisen mikrometastaasin, on tärkeää, että anergia pidetään kurissa ja sekä efektori- (CD45RO+, CCR7-) että keskusmuisti-T-solut (CCR7+, CD45RO+) muodostuvat pitkäaikaista suojaavaa anti- kasvain immuniteetti.

   HYPOTEESI:

   "Kryoablaation yhdistelmä pembrolitsumabin kanssa paikalliseen kontrollointiin korkean riskin kolminkertaisesti negatiivisessa rintasyövässä on parempi kuin pelkkä kirurginen resektio tai pelkkä kryoablaatio kasvainten vastaisen immuunivasteen aikaansaamisessa."

   MENETELMÄT:

   Tutkimuspaikka:

   Ehdotettu tutkimustyö on satunnaistettu tutkimus, joka suoritetaan Texas Tech Universityn terveystieteiden keskus-Breast Center of Excellence -keskuksessa, UMC Cancer Centerissä.

   Opintotyyppi:

   Tuleva satunnaistutkimus - hypoteesilähtöinen

   Kokeellinen suunnittelu:

   Ehdotamme yhtä sokkoutettua prospektiivista satunnaistettua tutkimusta, jossa naiset, joilla on vaiheen I/II kolminkertaisesti negatiivinen rintasyöpä, otetaan mukaan johonkin kolmesta haarasta 1:1:1 satunnaistetulla tavalla: (I) Kontrolliryhmä, jossa on neoadjuvanttikemoterapia ja sen jälkeen lumpektomia/ mastektomia vartiosolmukkeen biopsialla +/- kainaloiden dissektio; (II) Interventio pelkällä kryoablaatiolla, jota seuraa neoadjuvanttikemoterapia, jota seuraa lumpektomia/mastektomia ja sentinelsolmukkeen biopsia +/- kainaloiden dissektio; (III) Interventio kryoablaatiolla + pembrolitsumabilla, jota seuraa neoadjuvanttikemoterapia, jota seuraa lumpektomia/mastektomia ja sentinellisolmukkeen biopsia +/- kainaloiden dissektio. Hoitoaikataulu on suunniteltu optimoimaan antigeenialtistusaika [Kuva-2]. Tutkimus rekisteröidään National Clinical Trials Networkissa, kun IRB-hyväksyntä on saatu.

   Aiheet:

   Kaikille 18-vuotiaille ja sitä vanhemmille potilaille, joilla on kliinisen vaiheen I/II kolminkertaisesti negatiivinen sairaus, tarjotaan osallistumista. Tutkimusryhmä seuloa nämä potilaat onkologian/leikkauksen ajan. Tietokoneistettua satunnaisluetteloa käytetään hoitoryhmien määrittämiseen verkkosivustolla:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Sisällyttämiskriteerit:

   • Naaraat
   • Vaiheen I/II syöpä
   • Ikähaitari 18-89 vuotta
   • Diagnoosit: Invasiivinen karsinooma, ER -, PR-, HER2- (kolminkertainen negatiivinen)
   • Radiologiset löydökset: Ultraäänellä näkyvä unifokaalinen sairaus

   Poissulkemiskriteerit:

   • Ylimääräinen primaarinen syöpä
   • Tulehduksellinen rintasyöpä
   • Autoimmuunisairauden historia
   • Krooninen immunosuppressio historiassa
   • Aikaisempi immunoterapia
   • Viimeaikainen rokotus (4 viikon sisällä)
   • Aikaisempi sädehoito
   • Aikaisempi tutkimusainehoito viimeisen vuoden aikana
   • Raskaus diagnoosin ja/tai hoidon aikana
   • Imetys

   Opintovierailut:

   Tietoinen suostumus hankitaan ja potilas satunnaistetaan. Kaikki käynnit osuvat normaaliin hoitokäyntiin. Seuraavaksi tapahtuu seuraavaa:

   Vierailu 1: Päivä 1:

   Lähtötilanne Verenotto; enintään 20 ml kerätään EDTA-putkiin; veri sentrifugoidaan TTUHSC:ssä. Plasmaa käytetään sytokiinianalyysiin ja fenotyypitykseen TTU:n laboratoriossa. Yksi EDTA-putki lähetetään Houstonin yliopistoon (koko tutkimuksen ajankohtien ajan). Seuraavat tulokset mitataan:

   Sytokiinianalyysi

   • RNA-seq PBMC-analyysi Perustason biopsiakudosta (jo saatavilla diagnostisesta työstä) arvioidaan: (2 värjäämätöntä objektilasia valmistetaan RNA-sekvenssiä varten kiinteästä kudoksesta)
   • TIL %
   • RNA Seq kasvainkudos

   Käynti 2 (vain ryhmät II ja III) kryoablaation jälkeen: Päivä 3 (+/- 7 päivää):

   Postablaation verenotto (ryhmät II ja III) - enintään 10 ml verta EDTA-putkissa:

   • Sytokiinianalyysi

   Vierailu 3 (kaikki ryhmät) Pre Neoadjuvanttikemoterapia: Päivä 21 (+/- 14 päivää):

   Verenotto portin asettamisen yhteydessä kemoterapiaa varten – enintään 20 ml verta EDTA-putkissa:

   • Immuunifenotyypitys virtaussytometrialla
   • Sytokiinianalyysi
   • RNA-seq PBMC-analyysi
   • Kasvainbiopsia toistetaan TIL- ja RNA-sekvenssianalyysiä varten

   Käynti 4 (kaikki ryhmät): Kemoterapian jälkeinen resektio (noin 6 kuukautta alkuperäisen biopsian jälkeen):

   Preoperatiivinen verenotto 20 ml:aan verta EDTA-putkiin (samanlainen kuin lähtötilanteessa):

   • Immuunifenotyypitys virtaussytometrialla
   • Sytokiinianalyysi
   • RNA-seq PBMC-analyysi Kirurginen näytekudosanalyysi (2 värjäämätöntä objektilasia kiinteästä kudoksesta valmistetaan RNA-sekvenssiä varten)
   • TIL %
   • RNA-seq kasvainkudos

   Otoskoko:

   Kasvaimeen infiltroivat lymfosyytit (TIL:t), erityisesti kolminkertaisesti negatiivisen rintasyövän stroomassa, ovat prognostisia ja ennustavat vastetta hoitoon. Siksi tämän projektin otoskoon laskennassa käytettiin kansainvälisen TILs-työryhmän suosituksia. TIL:ien prosentuaalisen muutoksen oletetaan olevan 10 % kontrollihaarassa ja 50 % hoitohaarassa. Otos, jossa on 10 potilasta ryhmää kohden, voi saavuttaa 80 %:n tehon havaitakseen keskimääräisen eron 0,4 (0,5 vs. 0,1) standardipoikkeaman ollessa 0,3, käyttämällä kaksipuolista kaksinkertaista kahden näytteen tasavarianssin t-testiä (alfa = 0,05) . Olettaen, että keskeyttämisaste on 30 %, yhteensä 12 potilasta kussakin haarassa riittäisi yhteensä 36 potilaalle; tällä saavutetaan 90 % teho. Tämä tarkoittaa, että vähintään 10 potilasta käsissä ja enintään 12 potilasta käsissä johtaa tilastollisesti merkitykselliseen tutkimukseen.

   Tilastosuunnitelma:

   Kuvaavia tilastoja käytetään riippumattomien muuttujien standardihoito, cryo, cryo+pembro vaihteluvälien, keskiarvojen ja varianssien laskemiseen. Tämä viittaa siihen, että havaintojen keskittyminen keskiarvon ympärille ja havaintojen vaihtelu keskiarvoista. Normaalisuustestiä tarkastellaan sen tarkistamiseksi, noudattavatko tiedot normaalijakaumaa vai eivät. Normaalia kvantiili-kvantiilikuvaajia (kutsutaan myös q-q-kuvaajiksi) käytetään määrittämään, ovatko tietojoukot peräisin normaalista populaatiosta. Poikkeamien havaitsemiseksi (jos sellaisia ​​on) otetaan huomioon useita tilastollisia mittareita. Varianssien homogeenisuuden tarkistamiseksi riippumattomille muuttujille vakiohoito, kryo, kryo+pembro, suoritetaan Levenen testi asettamalla nolla- ja vaihtoehtoisia hypoteeseja. Muuttujien keskiarvojen merkitsevyyden eron vertaamiseksi suoritetaan yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA). Nolla- ja vaihtoehtoiset hypoteesit keskiarvoille esitellään. ANOVAssa keskiarvojen tilastollinen merkitsevyys testataan (α = 0,05) käyttämällä F-testitilastoa. Jos keskiarvoissa havaitaan tilastollisesti merkitsevä ero, suoritetaan post hoc -monivertailutestit. Post-hoc-monivertailutestejä (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey jne.) käytetään sopivien merkittävien ryhmien keskiarvojen havaitsemiseen. Jos näytteet eivät täytä normaalisuusoletuksia, tilastollisissa analyyseissä otetaan huomioon useita ei-parametrisia testejä.

   Kasvaimen kryoablaatio:

   Kaikki rekisteröidyt potilaat satunnaistetaan johonkin tutkimuksen kolmesta haarasta. Haarojen II ja III potilaat saavat kryoablaatiota seuraavan protokollan mukaisesti (samanlainen kuin ACOSOG Z1072 -tutkimuksessa käytetty protokolla).

   Kryoablaatiolaite: Kryoablaatio suoritetaan käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa ProSense Cryosurgical System -järjestelmää (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israel), joka koostuu konsolista, kryokoettimesta ja siihen liittyvästä nestetypestä (kryogeenistä) Case Dewars. Konsoli on itsenäinen yksikkö, jossa on käyttöliittymä kryoablaatioprosessin ohjaamiseen ja seurantaan. Se toimii tavallisella 120 VAC (60 Hz) teholla.

   Laitteen toiminta: ProSense Cryosurgical System käyttää suljettua järjestelmää nestemäisen typen kierrättämiseen kryokoettimen kärjessä luoden jäätymisen alapuolella olevia lämpötiloja, jotka johtavat kohdekudoksen ablaatioon. Leesio tunnistetaan ultraäänellä ja kylmäkoetin asetetaan leesion keskelle ultraääniohjauksessa riittävän paikallispuudutuksen jälkeen, ja ablaatio suoritetaan ennalta määrätyn jäädytys-sulatus-jäädytys-algoritmin mukaisesti. Sen jälkeen anturi lämmitetään sisäisellä sähkövastuslämmittimellä ja poistetaan potilaasta. Kryoablaatiomenettely: Kasvain tunnistetaan käyttämällä korkearesoluutioista lineaarisen ryhmän ultraääni-anturia kahdessa ortogonaalisessa kuvassa. Kasvaimen pisin ulottuvuus tunnistetaan koettimen rinnakkaiseen asettamiseen. Tämä mitta syötetään konsoliin; konsoli tarjoaa kryokoettimen kärjen pituuden, joka on leesion ohi työnnettäessä. Lisäämisen jälkeen koettimen sijainti vahvistetaan kahdessa ortogonaalisessa kuvassa. Kryoablaatio tehdään käyttämällä jäädyttämis-sulatus-pakastussykliä kasvaimen koon mukaan. Koko toimenpidettä seurataan näön alla ja suolaliuosta tunkeutuu ihon paleltumien välttämiseksi hydrodissekoimalla iho pois jääpallosta. Jääpallon koko kirjataan ortogonaalisiin mittoihin. Protokollamme mukaan, jos potilaalla on useampi kuin yksi leesio, vain yksi leesio poistetaan; kuitenkin muista vaurioista otettuja biopsioita tutkitaan abskopaalisen vaikutuksen varalta.

   Pembrolitsumabin infuusio ja annostelu:

   Ensimmäisenä askeleena vahvistimme immuunijärjestelmän tarkistuspisteestäjien turvallisuuden ja siedettävyyden kasvaimen kryoablaatiolla naisilla, joilla on äskettäin diagnosoitu rintasyöpä. Yksi tärkeä näkökohta oli immuunijärjestelmää moduloivan vasta-aineen valinta. Pembrolitsumabilla, FDA:n hyväksymällä vasta-aineella PD-1/PD-L1:tä vastaan, on vakiintunut turvallisuusprofiili, ja se aiheuttaa pitkäaikaisia ​​remissioita, jotka kestävät yli 10 vuotta 10–20 %:lla edenneistä melanoomapotilaista. Lisäksi, koska T-solut säätelevät akuutisti PD-1/PD-L1:n ilmentymistä antigeeneille altistumisen jälkeen,51 mikä puolestaan ​​voi vaimentaa sytotoksista vastetta, pembrolitsumabi sopii ihanteellisesti immuunimodulaatioon yhdessä kryoablaation kanssa. Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) julkaisi pilottitutkimuksen tästä yhdistelmästä; ipilimumabista johtuvia vakavia sivuvaikutuksia ei raportoitu; mikään leikkaus ei viivästynyt. MSKCC käytti 10 mg/kg kerta-annoksena; Koska tutkimukset raportoivat kuitenkin korkeampia haittavaikutuksia tällä annoksella, ehdotamme suositeltua 200 mg:aa IV 90 minuutin aikana ennen kryoablaatiota, joka on tällä hetkellä kliinisissä olosuhteissa käytetty annos kolminkertaisesti negatiivisissa syövissä.

   Menetelmät tulosmittauksille:

   Tarkkailemme ja seuraamme immuunivastetta/vasteita kryoablaatiotoimenpiteiden jälkeen pembrolitsumabin kanssa ja ilman. Verinäytteet kerätään EDTA-verenkeräysputkiin ja jaetaan sitten eriin T-solujen fenotyyppianalyysiä ja plasman keräämistä sytokiini/kemokiinia ja RNA-sekvenssianalyysiä varten ilmoitettuina ajankohtina. Patologiadiat tehdään tutkimusta varten ydinbiopsianäytteistä lähtötilanteessa ja lumpektomiasta ja vartiosolmukkeista leikkauksen aikana. Näytettä kohden tehdään viisi objektilasia (rutiinipatologian päätyttyä) H&E:tä ja immuunisolujen infiltraatioiden immunohistokemiaa varten TIL-prosentin laskemiseksi. Kaikki tulosmittausanalyysin suorittamiseen osallistuvat yhteistyökumppanit/avainhenkilöt sokkoutuvat satunnaistusryhmiin.

   Seuraavat tiedot tulosanalyysiä varten:

   TIL-laskenta: Kaikki kudosnäytteet, jotka läpikäyvät rutiininomaisen patologiaraportoinnin, arvioidaan TIL-raportointia varten kansainvälisen TIL-työryhmän ohjeiden mukaisesti. Alkuperäisen biopsiakudoksen ja kirurgisen kudoksen välinen TIL-pistemäärän muutos on analyysin painopiste ehdotettujen interventioiden vaikutuksen arvioimiseksi.

   T-solumuutosten mittaaminen veressä: T-solujen alatyypit voidaan määrittää solun pintamarkkerien erilaisella ilmentymisellä. Tarkkailemme T-solujen aktivaatiota, CD8+ efektori-T-solujen lisääntymistä sekä efektori- ja keskusmuistin kehittymistä. T-solufenotyypitystä varten suoritetaan kokoveren värjäys (100 µl/värjäys) vasta-aineilla CD3:lle, CD4:lle, CD8:lle, CD25:lle, CD27:lle, CD45RO:lle, CD127:lle, CD137:lle, ICOS:lle, CCR7:lle ja Ki67:lle sopivilla isotyyppikontrollilla.55 Punasolujen hajoamisen jälkeen värjätyt yksitumaiset solut ajetaan Attune NxT 14-värivirtaussytometrillä (Thermofisher, Waltham, MA) ja analysoidaan käyttämällä FlowJo-ohjelmistoa (Becton, Dickinson and Company). T-soluista (CD3+, CD4+ tai CD8+) analysoidaan muutokset naiivissa (CD27+, CCR7+, CD45RO-), efektorimuistissa (CCR7-, CD45RO-), efektorimuistissa (CD27-, CCR7-, CD45RO+) ja keskusmuistissa ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) fenotyyppimarkkerit sekä aktivaatioon (ICOS ja CD137) ja proliferaatioon (Ki67). Analysoimme edelleen T-säätelysolujen (CD25+, CD127-) prosenttiosuuksia. Käytämme näitä tietoja määrittämään T-solun immuuniallekirjoituksen kryoabalaation+/- pembrolitsumabin tehokkuuden korreloimiseksi pitkän aikavälin kasvainten vastaisen immuniteetin ennustamiseksi.

   Plasmasytokiini-/kemokiinianalyysi: Alkuanalyysimme on määrittää, mitkä sytokiinit/kemokiinit ja mitkä pitoisuudet havaitaan veressä kryoablaation +/- pembrolitsumabin jälkeen ja kuinka niiden profiilit ovat muuttuneet. Keskitymme tulehduksellisiin ja auttaja-T-solujen sytokiiniprofiileihin ja siihen, kuinka nämä sytokiinit vaikuttavat ja ohjaavat T-soluvastetta. Lisäksi tarkastelemme kemokiinien muutoksia. Niiden muuttuneen ilmentymisen pahanlaatuisissa kasvaimissa on osoitettu sanelevan leukosyyttien kerääntymisen ja aktivoitumisen, angiogeneesin, syöpäsolujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden muodostumisen kaikissa taudin vaiheissa.56 Lähtötilanteessa, 24-48 tuntia ablaation jälkeen, ennen kemoterapiaa, veri kerätään ja plasma eristetään sentrifugoimalla 1-2 ml verta 1-2000 x g 10 minuutin ajan ja jakamalla sitten 120 µl eriin 0,65 ml:n mikrosentrifugiputkiin. Vakiohoitoryhmässä on vain 3 verinäyteaikapistettä. Plasmanäytteet analysoidaan Bio-Plex 200 -laitteella Eve Technologies Corporationissa (Calgary, AB, Kanada) käyttämällä Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   TUOTESELOSTE:

   Katso Excel-laskentataulukko. RNA-sekvenssi kerätään lämpökarttoina differentiaalisesti ilmennetyille geeneille.

   RISKIT:

   Verenoton riskit:

   Verenoton riskejä ovat: kipu, epämukavuus, verenvuoto, mustelmat, punoitus, infektio, kun neula osuu ihoon; huimaus, pyörtyminen.

   Kryoablaatioon liittyvät riskit:

   Kryoablaatio on ollut erittäin turvallinen toimenpide; PI on rutiininomaisesti tarjonnut tätä menettelyä hyvänlaatuisille ja syöpäsairauksille rintakehässä; Toistaiseksi toimenpiteen kohteena on 18 syöpäpotilasta ja 36 hyvänlaatuista vauriota. Seuraavia lieviä komplikaatioita on raportoitu tähän mennessä:

   • Mustelmat ablaatiokohdassa - itsestään rajoittuva.
   • Kipu - hoidettu OTC-kipulääkkeillä.
   • Ihonekroosi on kuitenkin teoreettinen mahdollisuus menettelyohjetta noudattaen; meillä ei ole koskaan ollut tätä komplikaatiota.

   Pembrolitsumabiin liittyvät riskit:

   Immuunitarkistuspisteen estäjien toksisuudesta on tehty laajoja tutkimuksia.57 Pemrolitsumabin standardisuositusannos on 200 mg IV annosta kohden (FDA:n hyväksymä). Odotettuja haittavaikutuksia ovat:

   • Ihottuma
   • Ripuli
   • Ummetus
   • Pahoinvointi
   • Painonpudotus
   • Kuivat silmät
   • Väsymys
   • Päänsärky
   • Kuume
   • Nivelkipu
   • Kilpirauhasen toimintahäiriö

   Luottamuksellisuuden menettäminen:

   Kaikki tiedot säilytetään salasanalla suojatuissa tiedostoissa CRI:n ja PI:n toimistossa. Kaikki tiedot poistetaan identifioinnista kokoamista ja analysointia varten. Kaikkia HIPAA-yhteensopivuuden protokollia noudatetaan. Kuitenkin minimaalinen riski luottamuksellisuuden loukkaamisesta on mahdollinen inhimillisen erehdyksen vuoksi.

   EDUT:

   Haavojen II ja III potilaat voivat hyötyä tutkimukseen osallistumisesta. Jos intuitiomme immuunimodulaatiosta kryoterapian ja tarkistuspisteen estäjälääkkeen yhdistelmällä todella vaikuttaa kasvaimen hallintaan, nämä kaksi ryhmää hyötyvät suoraan osallistumisesta. Kontrolliryhmä I ei kuitenkaan hyödy tutkimuksesta sen lisäksi, että se tarjoaa vertailuryhmän tutkimukselle. Ehdotetun tutkimuksen päätavoitteena on tunnistaa uusi matalariskinen hoitomenetelmä näihin korkean riskin syöpiin, mikä hyödyttää viime kädessä tulevia syöpäpotilaita.

   SEURANTA:

   Tutkimusprotokollan, GCP-ohjeistuksen ja TTUHSC:n Human Research Protection Program -tutkimuspolitiikan ja -menettelyjen sekä laadukkaan tiedon noudattamisen varmistamiseksi tutkimuksen aikana Kliinisen tutkimuslaitoksen monitori suorittaa tutkimuksen seurannan. Ensimmäinen seurantakäynti tehdään kahden viikon kuluessa siitä, kun ensimmäinen koehenkilö on ilmoittautunut tutkimukseen. Seuraavat seurantakäynnit ajoitetaan määräajoin, mutta vähintään 2 kuukauden välein aktiivisen tutkimukseen osallistujan ollessa paikalla, PI:n ja tutkimusmonitorin yhteisesti sovittuna aikana. Kaikki kerätyt tiedot ovat 100-prosenttisesti varmennettuja lähdeasiakirjoja. Tutkimusmonitori voi tarkastaa ja tarkastaa kaikki tutkimusasiakirjat, eli tiedonkeruulomakkeet, kyselylomakkeet, lääkevastuu ja lääketieteelliset tiedot sovellettavien luottamuksellisuusmääräysten mukaisesti.

   RAHOITUS:

   Haki NIH-apurahaa R21