Az immunmoduláció csoportosítása krioablációval (LOGIC) emlőrák esetén (LOGIC)

CÉLOK:

A javasolt vizsgálat fő célja a tumor krioabláció és az immunkontroll-gátló szinergiájának felmérése magas kockázatú emlőrákban emberekben. Ezt úgy érik el, hogy összehasonlítják a krioablációt önmagában és a pembrolizumabbal kombinált krioablációt – egy [ellenőrzőpont-gátló (anti PD-1/PD-L1 antitest), amelyet jelenleg az FDA rákterápiaként hagyott jóvá]] az ellátás jelenlegi standardjával, beleértve a sebészeti reszekciót is. A neoadjuváns/adjuváns terápiák jelenlegi színvonala változatlan marad etikai okokból, hogy minden beteg számára a legismertebb színvonalú ellátást biztosítsák.

CÉLKITŰZÉSEK:

Prospektív randomizált feltáró vizsgálatot javasolunk, ahol a klinikai I/II. stádiumú, hármas negatív invazív emlőrákos betegeket a vizsgálat három ágának egyikébe randomizálják:

1. Az ellátás standardja – neoadjuváns terápia, majd sebészi reszekció, majd szükség szerint megfelelő adjuváns terápia.
2. Krioablációs kar - krioabláció, majd megfelelő neoadjuváns terápia, majd műtéti reszekció, majd szükség szerint megfelelő adjuváns terápia.

3. Krioabláció pembrolizumabbal - Egyszeri 200 mg-os pembrolizumab adag a krioabláció előtt (24-48 órán belül), majd megfelelő neoadjuváns kezelés, majd műtéti reszekció, majd szükség szerint megfelelő adjuváns kezelés.

   Az eredményre vonatkozó intézkedések magukban foglalják az immunválasz vér- és tumorelemzését áramlási citometriával és citokinanalízissel a kiinduláskor, a beavatkozás után és a műtét előtt. A kiindulási core biopsziából, a kemoterápia előtti ismételt biopsziából és a tumor reszekcióból származó szöveteket szintén elemzik a tumor mikrokörnyezete szempontjából.

   BEVEZETÉS / HÁTTÉR / JELENTŐSÉG:

   Magas kockázatú emlőrák és újabb kezelési módok szükségessége: A hármas negatív emlőrák, amely az összes mellrák diagnózisának 15-20%-át teszi ki, magas kockázatúnak számít. Míg a sebészi reszekció továbbra is a kezelés alappillére, a terápiás gerinc a neoadjuváns és az adjuváns kemoterápia. Azoknál a betegeknél, akiknél még a műtéti reszekció és a kemoterápia befejezése után is jelentős maradványbetegségük van, további agresszív szisztémás terápiákat, például kapecitabint kell alkalmazni. A hármas negatív altípushoz kapcsolódik a legtöbb mutáció a genomban, a nem áttétet okozó betegség pedig 17-20%-os lokális és 35-40%-os távoli kudarchoz kapcsolódik 5-10 éves követés után. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a mikrometasztatikus hematogén terjedés jelentős számú operálható, nagy kockázatú emlőrákban szenvedő betegben fordul elő, és újabb megközelítésekre van szükség, amelyek a helyi kontrollt potencírozzák, miközben a betegség szisztémás terjedését is szabályozzák.

   Az immunmoduláció hatóköre: A rák immunterápiája az elmúlt évtizedekben rendkívüli sikereket ért el. Azok az antigének, amelyek tumorellenes immunválaszt válthatnak ki, megfelelő immunterápiás célpontot képeznek. A T-sejt-ellenőrzőpont-blokkoló terápiák megközelítése figyelemre méltó klinikai válaszokat mutatott számos szilárd ráktípus esetében, mint például a melanoma, a nem-kissejtes tüdőrák, a hólyagrák és az eltérés-javítási hiányos rákok. A hatékony daganatellenes immunválaszt úgy gondolják, hogy az antigénprezentáló sejtek (APC) felveszik a tumorantigéneket, amelyek viszont jelen vannak, és társstimuláló jeleket adnak mind a CD4+, mind a CD8+ T-sejteknek. Az APC-k, különösen a dendritikus sejtek, az antigéneket egy exogén antigén-feldolgozó útvonalon dolgozzák fel, ahol a tumorsejtek anyaga fagocitizálódik, és HLA I. és II. osztályú kötőpeptidekké alakul, amelyek CD8+ (keresztprezentáció) és CD4+ T-sejtek számára kerülnek bemutatásra. Ezeket az ismereteket felhasználva a közelmúltban végzett 1. fázisú vizsgálatok megerősítették az immunkontrollpont-gátló terápiára adott válaszreakciót a hagyományos kemoterápiával kombinálva hármas negatív emlőrák esetén. Minden bizonnyal a tumorba infiltráló limfociták (TIL-ek) százalékos arányát fontos immunológiai paraméterként azonosították, különösen a magas kockázatú emlőrákok esetében, amely összefüggésben áll a szisztémás terápiára adott válasszal, ami arra utal, hogy a gazdaszervezet immunválaszának erős szerepe van a rákkontrollban, függetlenül a terápiás beavatkozástól. .

   Az immunmoduláció korlátozása – A T-sejtek a daganatellenes immunitás kulcsszereplői, ezért az immunterápiás kutatások fő célpontját képezik. A jelenlegi áttörés a rák immunterápiájában a CTLA-4, PD-1 és PD-L1 ellenőrzőpont-mechanizmusának azonosításán és célzásán alapul. A CTLA-4 és a PD-1 a T-sejtek felszínén található társgátló receptorok. A megfelelő ligandumaikhoz (CD 80/86 és PD-L1/L2) való kötődéskor a T-sejtek anergiássá válnak – ez a tolerancia fiziológiai mechanizmusa. A tumor mikrokörnyezetével összefüggésben az aberráns expresszió és a tumorantigéneknek való krónikus expozíció a T-sejtes immunitás nemkívánatos elnyomásához vezethet.

   A közelmúltban kifejlesztett ellenőrzőpont-blokkolók, mint például a PD-1/PD-L1 inhibitor, a pembrolizumab, új fegyvert jelentenek a rák ellen, tartós klinikai válaszokkal és hosszú távú remissziókkal. Az ellenőrzőpontok blokkolása azonban a nagy mutációs terhelésű daganatokban a leghatékonyabbnak bizonyult, összhangban azzal az elképzeléssel, hogy a neo-antigének T-sejt-felismerése nagy szerepet játszik az ellenőrzőpont blokádban. Számos tanulmány azt mutatja, hogy ha a tumor-reaktív T-sejt-infiltrátum hiányzik vagy alacsony (a TIL-ek alacsony százaléka), akkor hiányzik az ellenőrzőpont blokád szubsztrátja. Ezenkívül az úgynevezett hipermutált daganatokban szenvedő betegek többsége nem reagál az ellenőrzőpont blokádra az immunrendszer szerkesztése miatt, ami veszélyezteti a T-sejtek azon képességét, hogy teljesítsék citotoxikus aktivitásukat a megfelelő tumorinfiltráció és a tumorantigénnel terhelt HLA osztály felismerése érdekében. I molekulák. Ezért az antigén-prezentáció fokozása a daganaton belül elengedhetetlen ahhoz, hogy az ellenőrzőpontok blokkolása hatékony legyen.

   Az ablatív terápiák szerepe – különösen a krioabláció: A krioterápiával, lézerrel, rádiófrekvenciás, mikrohullámú és fókuszált ultrahanggal végzett hőabláció egyedülálló lehetőséget kínál mind az elsődleges daganat, mind a mikrometasztatikus betegség kezelésére. A tumor abláció hatásai sokrétűek: (1) a tumor tömegének elpusztítása, a tumorterhelés csökkentése és (2) a tumorantigének felszabadulása, amelyek elérhetővé teszik azokat az antigénprezentáló sejtek (APC) számára, és maga a kezelés (3) ) a károsodással összefüggő molekuláris mintázatok (DAMP) felszabadítása és (4) fiziológiás sebgyógyulási válasz kiváltása. Az abláció egy in situ antigéndepó létrehozásához vezet, amely minden típusú tumorfehérjét tartalmaz, ami szisztémás tumorellenes immunválasz megindításához vezet, amely potenciálisan kiküszöbölheti az okkult metasztatikus betegségeket. A daganatok ablációja 65 °C feletti hőmérsékleten a fehérjék denaturálódásához vezet. Ez ellentétes módon befolyásolhatja az immunválaszokat, mivel a magas hőmérséklet denaturálja az immunaktiváló jeleket, például a veszélyjelzéseket, például a hősokk-fehérjéket (HSP). Ezért a krioabláció a legígéretesebb ablatív technika, mivel minimális invazivitást, kevesebb károsodást tesz lehetővé a környező szövetekben, jobb megőrzést biztosít a tumorantigénekben, és a legmegbízhatóbb adatokat az immunstimulációról.

   Krioabláció által kiváltott immunstimuláció - A mélyfagyasztás és felolvasztás a krioabláció során nekrózist és a DAMP-molekulák felpörgetését idézi elő, ami a tumorsejteket fogékonyabbá teszi az APC-kre és a tumorspecifikus T-sejt által közvetített pusztulásra. A krioabláció fokozza a DAMP-okat, például a HMG1-et, a kalretikulint, az S100A8/A9-et és a HSP70-et, amelyek stimulálják az immunrendszert a Receptor for Advanced Glycosylation End-products (RAGE) és az útdíjszerű receptorokon keresztül, és fokozzák az antigénprezentációt. Ezenkívül a krioabláció eredményeként létrejövő központi zóna citokin miliő jellemzően az IL-2, az INF-γ, a TNF-α és az IL-12.28 Th1 citokin profilja. Ezek a citokinek és DAMP-ok feltehetően irányítják a citotoxikus CD8+ T-sejt választ. A krioabláció immunválaszát alátámasztó preklinikai bizonyítékok: Számos krioimmunológiai preklinikai vizsgálat azt vizsgálta, hogy a daganat lefagyasztása és in situ hagyása ellenállóvá teszi-e az állatot az újbóli fertőzéssel szemben. A karcinóma és szarkóma sejtvonalakat használó állatmodellek nyulakban és egerekben tumorspecifikus rezisztenciát mutattak ki az újbóli fertőzéssel szemben. Az azonos tumorsejtvonalakkal végzett ismételt fertőzés rezisztenciát mutatott a növekedéssel szemben az állatokban a krioabláció után a műtéti reszekcióhoz képest. Hasonló tapasztalatokról számolt be Blackwood és Cooper myosarcoma és carcinosarcoma sejtvonalakkal beoltott patkányok modelljeivel kapcsolatban. A krioablált daganatos patkányok nagyobb valószínűséggel ellenálltak az újbóli fertőzésnek, és a másodlagos daganatok visszafejlődését mutatták ki, mint a műtétileg kezelt patkányok. Bagley et al. összehasonlította a krioablációt a műtéttel MCA-10 fibroszarkómával C57BL/6 egerekben, a lép limfocitákat heti időközönként begyűjtve a kezelést követően citotoxicitási vizsgálatok céljából. A krioabláción átesett egerek citotoxicitása szignifikánsan magasabb volt, mint a műtétileg kezelt vagy kezeletlen egerek. Sabel et al. MT-901 emlő adenokarcinóma daganatokat vizsgáltak krioablációval vagy sebészi reszekcióval kezelt BALB/c egereken. Az újbóli fertőzés után a műtéttel kezelt egerek 86%-ánál alakult ki második daganat, szemben a krioablációval kezelt egerek 16%-ával. Ez tumorspecifikus volt, mivel a krioabláció nem nyújtott védelmet más sejtvonalakkal szemben. Újabban Kim et al. vesesejtes karcinóma sejtvonalakat használva BALB/c egerekben hasonló eredményekről számoltak be. Újabban szisztémás immunválasz eredményeként számoltak be a tumor regressziójának abszkopális hatásáról kezeletlen daganatokban olyan állatmodellekben, ahol a beültetett daganatok közül csak az egyik volt krioablált.

   Klinikai bizonyítékok, amelyek alátámasztják a krioabláció immunválaszát: Bár a krioabláció rák elleni klinikai alkalmazása a közelmúltban bővült, viszonylag kevés tanulmány foglalkozik az immunológiai hatásokkal emberekben. Ravindranath et al. mérte a szérum tumor gangliozidok szintjét és antitest titereiket olyan betegeknél, akik krioablációt, rádiófrekvenciás ablációt vagy vastagbélrákból származó májmetasztázis reszekciót kaptak. A szérum gangliozid szintje szignifikánsan magasabb volt a krioablált betegekben, mint a rádiófrekvenciás vagy műtéti kezelésnél. A krioablált betegek magasabb IgM-titereket mutattak a tumor gangliozidokkal szemben. Si et al. 20 prosztatarákos beteget vizsgáltak, akiknél az elsődleges daganat krioablációja esett át, és az LNCaP elleni citolitikus aktivitás növekedéséről, valamint az IFN-t termelő T-sejtek számának növekedéséről számoltak be. Thakur et al. krioabláció és GM-SCF kísérleti vizsgálatot végzett olyan betegeknél, akiknél a tüdőben áttétes vesesejtes karcinóma volt. A GM-CSF-et a krioablációra kiválasztott tüdőmetasztatikus lézió közelében infiltráltuk. A beavatkozás után további GM-CSF terápiát alkalmaztak. A GM-CSF és a krioabláció kombinációja fokozott immunválaszt eredményezett a citotoxicitás és a szérum antitestek tekintetében.

   A krioabláció korlátozása: A fent áttekintett adatok ellenére a krioablációra adott immunválasz nem volt egységes. Az oszteogén szarkómával és a prosztatarák modelljeivel kapcsolatos egyes preklinikai vizsgálatok nem mutatták ki az immunfunkció növekedését a krioabláció után. Ennél is fontosabb, hogy számos tanulmány számolt be a kriosebészeti beavatkozással járó immunszuppresszióról. E vizsgálatok többsége fibroszarkóma sejtvonalakat vont be patkányokon, és csökkent rezisztenciát mutatott a krioabláció utáni újrafertőzéssel szemben, valamint megnövekedett a metasztatikus daganatok és a másodlagos daganatok növekedése. Mellrák szempontjából Sabel és mtsai. beszámolt arról, hogy a magas lefagyási sebesség megnövekedett tumorspecifikus T-sejteket eredményezett a daganatelvezető nyirokcsomókban, csökkentette a tüdőmetasztázisokat és javította a túlélést az alacsony lefagyási arányokhoz képest, amelyekben több Treg is volt (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Ezért a krioterápia önmagában kiváltott szisztémás hatás nagysága vagy elégtelennek vagy kontraproduktívnak bizonyult. Jelenlegi ismereteink szerint az ablatív forrás közelében a közvetlen sérülés és a nekrózissal járó sejthalál tumorantigéneket és (DAMP) szabadít fel, amelyek dendritikus sejteket toboroznak és aktiválnak, ami viszont serkenti a T-sejtek és az immunkomponensek proliferációját. Az ablatív forrástól távol eső átmeneti zóna közvetett sejtsérülést és apoptotikus sejthalált okoz DAMP-ok felszabadulása nélkül, ami szuppresszív citokinek felszabadulását és T-sejt klonális deléciót és anergiát okoz. Intuitív módon a krioabláció stimulálja az immunválaszt, de a végső klinikai hatást a CD4+ T-effektor sejtek és a T-szabályozó sejtek aránya határozza meg. A magasabb T-effektor-T-szabályozó sejt arány elősegíti a kedvezőbb CD8 citotoxikus T-sejt-választ. Míg a CD8+ citotoxikus sejtek megszüntetik az elsődleges daganatot és a szisztémás mikrometasztázist, fontos, hogy az anergia kordában legyen, és mind az effektor (CD45RO+, CCR7-), mind a központi (CCR7+, CD45RO+) memória T-sejtek létrejöjjenek a hosszú távú védő anti- tumor immunitás.

   HIPOTÉZIS:

   "A nagy kockázatú hármas negatív emlőrák helyi kontrollja érdekében a krioabláció és a pembrolizumab kombinációja tumorellenes immunválasz kiváltásában jobb, mint az önmagában végzett sebészeti reszekció vagy a krioabláció önmagában."

   MÓD:

   A tanulmány helyszíne:

   A javasolt feltáró munka egy randomizált vizsgálat, amelyet a Texasi Műszaki Egyetem Egészségtudományi Központ-Breast Kiválósági Központjában, az UMC Cancer Centerben fognak lefolytatni.

   Tanulmány típusa:

   Leendő véletlenszerű vizsgálat – hipotézisvezérelt

   Kísérleti terv:

   Egyetlen vak prospektív randomizált vizsgálatot javasolunk, amelyben az I/II. stádiumú, hármas negatív emlőrákban szenvedő nőket a három kar egyikébe vonják be 1:1:1 arányban randomizált módon: (I) Kontroll kar neoadjuváns kemoterápiával, majd lumpectomiával/ mastectomia őrcsomó biopsziával +/- hónalj disszekció; (II) Intervenció egyedül krioablációval, majd neoadjuváns kemoterápiával, majd lumpectomiával/masztektómiával őrcsomó-biopsziával +/- hónalj disszekció; (III) Beavatkozás krioablációval + pembrolizumab, majd neoadjuváns kemoterápia, majd lumpectomia/mastectomia őrcsomó-biopsziával +/- hónalj disszekció. A kezelési ütemtervet úgy alakították ki, hogy optimalizálja az antigén expozíciós idejét [2. ábra]. Az IRB jóváhagyását követően a vizsgálatot a National Clinical Trials Network nyilvántartásba veszi.

   Tárgyak:

   Minden 18. életévüket betöltött, hármas negatív klinikai stádiumú betegnek felajánljuk a részvételt. Ezeket a betegeket a vizsgálati csoport onkológiai/sebészeti találkozója során szűri. Számítógépes randomizációs lista kerül felhasználásra a kezelési ág kiosztásához a következő webhely segítségével:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Bevételi kritériumok:

   • Nőstények
   • I/II. stádiumú rák
   • Korhatár 18-89 év
   • Diagnózisok: Invazív carcinoma, ER -, PR-, HER2- (hármas negatív)
   • Radiológiai leletek: Ultrahangon látható unifokális betegség

   Kizárási kritériumok:

   • További primer rák
   • Gyulladásos mellrák
   • Autoimmun betegségek története
   • Krónikus immunszuppresszió anamnézisében
   • Előzetes immunterápia
   • Legutóbbi oltás (4 héten belül)
   • Előzetes sugárterápia
   • Korábbi vizsgálati szer terápia az elmúlt 1 évben
   • Terhesség a diagnózis és/vagy a kezelés idején
   • Szoptatás

   Tanulmányi látogatások:

   Tájékozott beleegyezést kell szerezni, majd a beteget véletlenszerűen besorolják. Minden látogatás egybeesik a szokásos gondozási látogatásokkal. Ezután a következő történik:

   1. látogatás: 1. nap:

   Kiindulási vérvétel; legfeljebb 20 ml-t gyűjtenek az EDTA-csövekbe; a vért a TTUHSC-ben centrifugálják. A plazmát a citokinanalízishez és a fenotipizáláshoz használják a TTU laboratóriumában. Egy EDTA csövet küldenek a Houstoni Egyetemre (a vizsgálat időtartama alatt). A következő eredményeket mérik:

   Citokin elemzés

   • RNS szekvencia PBMC analízis A kiindulási mag biopsziás szövetet (amely már elérhető a diagnosztikai feldolgozásból) a következők szempontjából értékeljük: (2 festetlen tárgylemez készül a rögzített szövetből származó RNS szekvencia meghatározására)
   • TIL %
   • RNS Seq tumorszövet

   2. vizit (csak II. és III. csoport) Krioabláció után: 3. nap (+/- 7 nap):

   Az abláció utáni vérvétel (II és III csoport) – legfeljebb 10 ml vér EDTA cső(k)ben:

   • Citokin elemzés

   3. látogatás (minden csoport) Pre-neoadjuváns kemoterápia: 21. nap (+/- 14 nap):

   Vérvétel a kemoterápiás port behelyezésekor – legfeljebb 20 ml vér EDTA-csövekben:

   • Immunfenotipizálás áramlási citometriával
   • Citokin elemzés
   • RNS-seq PBMC analízis
   • A tumorbiopsziát meg kell ismételni a TIL és az RNS szekvencia elemzéséhez

   4. látogatás (minden csoport): Kemoterápia utáni reszekció (kb. 6 hónappal az eredeti biopszia után):

   Preoperatív vérvétel 20 ml vér EDTA-csövekbe (hasonlóan az alapvonalhoz):

   • Immunfenotipizálás áramlási citometriával
   • Citokin elemzés
   • RNS szekvencia PBMC analízis Sebészeti minta szövetanalízis (2 festetlen tárgylemez készül rögzített szövetekből az RNS szekvenciához)
   • TIL%
   • RNS-seq tumorszövet

   Minta nagysága:

   A tumor-infiltráló limfociták (TIL-ek), különösen a hármas negatív emlőrák stromájában, prognosztikailag és előrejelzik a terápiára adott választ. Ezért a Nemzetközi TIL-munkacsoport ajánlásait használták a projekt mintanagyságának kiszámításához. Feltételezzük, hogy a TIL-ek százalékos változása 10% a kontroll karon és 50% a kezelési karon. Egy csoportonként 10 betegből álló minta 80%-os teljesítményt ér el a 0,4-es (0,5 vs. 0,1) átlagos eltérés kimutatására 0,3-as szórással, kétoldalas, kétmintás egyenlő variancia t-teszttel (alfa=0,05) . 30%-os lemorzsolódási arányt feltételezve, mindkét karban összesen 12 beteg lenne elegendő összesen 36 beteg számára; ezzel 90%-os teljesítmény érhető el. Ez azt jelenti, hogy karonként legalább 10 beteg és karonként legfeljebb 12 beteg statisztikailag értelmes vizsgálathoz vezet.

   Statisztikai terv:

   Leíró statisztikákat használunk a standard ellátás, cryo, cryo+pembro független változók tartományainak, átlagainak és eltéréseinek kiszámításához. Ez arra utal, hogy a megfigyelések koncentrációja az átlag körül, és a megfigyelések eltérése az átlagoktól. A normalitástesztet figyelembe kell venni annak ellenőrzésére, hogy az adatok normális eloszlást követnek-e vagy sem. Normál kvantilis-kvantilis diagramokat (más néven q-q diagramokat) használunk annak meghatározására, hogy az adatkészletek normál sokaságból származnak-e. A kiugró értékek kimutatásához (ha vannak ilyenek) több statisztikai intézkedést is figyelembe kell venni. A standard ellátás, cryo, cryo+pembro független változók varianciáinak homogenitásának ellenőrzésére Levene tesztet végeznek null és alternatív hipotézisek felállításával. A változók átlagai közötti szignifikancia-különbség összehasonlítására egytényezős varianciaanalízist (ANOVA) kell végezni. Bemutatjuk az átlag null- és alternatív hipotézisét. Az ANOVA-ban az átlagok statisztikai szignifikanciáját (α = 0,05) teszteljük az F-teszt statisztika használatával. Ha az átlagok statisztikailag szignifikáns különbséget találnak, akkor a post-hoc többszörös összehasonlító teszteket kell elvégezni. Post-hoc többszörös összehasonlító teszteket (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey stb.) alkalmazunk a megfelelő szignifikáns csoportátlagok kimutatására. Ha a minták nem felelnek meg a normalitási feltételezéseknek, akkor több nem paraméteres tesztet is figyelembe kell venni a statisztikai elemzésekhez.

   Tumor krioabláció:

   Minden regisztrált beteget véletlenszerűen besorolnak a vizsgálat három ága egyikébe. A II. és III. karba tartozó betegek krioablációt kapnak a következő protokoll szerint (hasonlóan az ACOSOG Z1072 vizsgálatban használt protokollhoz).

   Krioablációs eszköz: A krioablációt a kereskedelemben kapható ProSense Cryosurgical System (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Izrael) segítségével hajtják végre, amely egy konzolból, krio-szondából és a kapcsolódó folyékony nitrogénből (kriogénből) áll, Dewars eset. A konzol egy önálló egység, amely interfésszel rendelkezik a krioablációs eljárás vezérléséhez és felügyeletéhez. Normál 120 VAC (60 Hz) tápfeszültséggel működik.

   A készülék működése: A ProSense Cryosurgical System zárt rendszert használ a folyékony nitrogén keringetésére a krio-szonda hegyén belül, így fagypont alatti hőmérsékletet hoz létre, ami a célszövet ablációját eredményezi. Az elváltozást ultrahanggal azonosítják, és megfelelő helyi érzéstelenítés után ultrahangos irányítás mellett a krio-szondát a lézió közepére helyezik, és az ablációt előre meghatározott fagyasztás-olvadás-fagyasztás algoritmus szerint végezzük. Ezután a szondát egy belső elektromos ellenállásfűtő melegíti fel, és eltávolítja a páciensből. Krioablációs eljárás: A daganat azonosítása nagy felbontású lineáris elrendezésű ultrahang szondával két merőleges nézetben történik. A tumor leghosszabb dimenzióját a szonda párhuzamos behelyezésekor azonosítják. Ez a méret bekerül a konzolba; a konzol biztosítja a krio-szonda csúcsának azt a hosszát, hogy a behelyezéskor túl legyen a sérülésen. A beillesztés után a szonda helyzetét két merőleges nézetben erősítjük meg. A krioablációt a fagyasztás-olvadás-fagyasztás ciklussal végezzük a daganat méretének megfelelően. A teljes eljárást látás alatt figyelik, és sóoldatot szivárogtatnak be, hogy elkerüljék a bőr fagyását azáltal, hogy a bőrt leválasztják a jéggolyóról. A jéggolyó méretét ortogonális méretekben rögzítjük. Protokollunkban, ha egy betegnek egynél több elváltozása van, csak egy léziót távolítanak el; azonban az egyéb léziókból származó biopsziákat abscopalis hatás szempontjából vizsgálják.

   A pembrolizumab infúziója és adagolása:

   Első lépésként megerősítettük az immunkontrollpont-gátlók biztonságosságát és tolerálhatóságát daganatos krioablációval újonnan diagnosztizált emlőrákban szenvedő nőknél. Az egyik fontos szempont az immunmoduláló antitest kiválasztása volt. A pembrolizumab, az FDA által jóváhagyott PD-1/PD-L1 elleni antitest, jól megalapozott biztonsági profillal rendelkezik, és az előrehaladott melanómás betegek 10-20%-ában hosszú távú, több mint 10 évig tartó remissziót vált ki. Továbbá, mivel a T-sejtek antigénekkel való érintkezést követően akutan felszabályozzák a PD-1/PD-L1 expresszióját,51 ami viszont tompíthatja a citotoxikus választ, a pembrolizumab ideálisan alkalmas immunmodulációra krioablációval kombinálva. A Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) kísérleti tanulmányt tett közzé erről a kombinációról; nem számoltak be az ipilimumabnak tulajdonítható súlyos mellékhatásokról; egyetlen műtét sem késett. Az MSKCC 10 mg/kg-ot alkalmazott egyszeri adagként; mivel azonban a vizsgálatok ennél a dózisnál magasabb nemkívánatos eseményekről számolnak be, javasoljuk a javasolt 200 mg-os intravénás adagot 90 percen keresztül a krioabláció előtt, ami jelenleg a klinikai körülmények között alkalmazott dózis a tripla negatív rák esetében.

   Az eredménymérések módszertana:

   Megfigyeljük és monitorozzuk az immunválasz(oka)t a pembrolizumabbal és anélkül végzett krioablációs eljárásokat követően. A vérmintákat EDTA-vérvételi csövekbe gyűjtik, majd aliquot részekre osztják a T-sejt fenotípusos elemzéshez, valamint a plazmagyűjtéshez a citokin/kemokin és az RNS szekvencia elemzéshez a megadott időpontokban. Patológiai tárgylemezeket készítenek a kutatáshoz a magbiopsziás mintákból a kiinduláskor, valamint a lumpectomiás és az őrszemcsomókból a műtét idején. Mintánként öt tárgylemez készül (a rutin patológia befejezése után) a H&E és az immunhisztokémia vizsgálatára az immunsejt-infiltrátumok esetében a TIL-ek százalékos kiszámításához. Az eredménymérési elemzés elvégzésében részt vevő összes együttműködő/kulcsfontosságú személyzet vakon kerül a randomizációs csoportokra.

   Az alábbi részletek az eredményelemzéshez:

   TIL-számítás: Minden olyan szövetmintát, amelyen rutin patológiai jelentés készül, a TIL-jelentés szempontjából értékelni kell a Nemzetközi TIL-munkacsoport által kiadott irányelvek szerint. A javasolt beavatkozások hatásának felmérése érdekében az elemzés középpontjában az eredeti magbiopsziás szövet és a műtéti szövet közötti TIL-pontszám változása áll.

   T-sejt változások mérése a vérben: A T-sejt altípusokat sejtfelszíni markerek differenciális expressziójával határozhatjuk meg. Figyelni fogjuk a T-sejtek aktiválódását, a megnövekedett CD8+ effektor T-sejteket, valamint az effektor és a központi memória fejlődését. A T-sejt fenotipizáláshoz teljes vérfestést (100 µl/festés) kell elvégezni CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 és Ki67 elleni antitestekkel, megfelelő izotípus kontrollokkal.55 A vörösvértestek lízisét követően a megfestett mononukleáris sejteket Attune NxT 14 színű áramlási citométeren (Thermofisher, Waltham, MA) futtatjuk, és FlowJo szoftverrel (Becton, Dickinson and Company) elemezzük. A T-sejteket (CD3+, CD4+ vagy CD8+) elemezni fogják a naiv (CD27+, CCR7+, CD45RO-), az effektormemóriában (CCR7-, CD45RO-), az effektor memóriában (CD27-, CCR7-, CD45RO+) és a központi memóriában ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) fenotípusos markerek, valamint aktiválás (ICOS és CD137) és proliferáció (Ki67). Tovább elemezzük a T-szabályozó sejtek (CD25+, CD127-) százalékos arányát. Ezeket az adatokat arra fogjuk használni, hogy meghatározzuk a T-sejtes immunrendszer aláírását, hogy korreláljuk a krioabaláció+/- pembrolizumab hatékonyságát a hosszú távú daganatellenes immunitás előrejelzésére.

   Plazma citokin/kemokin analízis: Kezdeti elemzésünk az lesz, hogy meghatározzuk, mely citokinek/kemokinek és milyen koncentrációban mutathatók ki a vérben a krioabláció +/- pembrolizumab után, és hogyan módosul a profiljuk. A gyulladásos és helper T-sejtek citokinprofiljaira fogunk összpontosítani, valamint arra, hogy ezek a citokinek hogyan befolyásolják és irányítják a T-sejtes választ. Ezenkívül megvizsgáljuk a kemokinek változásait. Kimutatták, hogy rosszindulatú daganatokban megváltozott expressziójuk a leukociták felszaporodását és aktiválását, az angiogenezist, a rákos sejtek proliferációját és a metasztázisokat diktálja a betegség minden szakaszában.56 Kiinduláskor, 24-48 órával az abláció után, a kemoterápia előtti időszak között, vért vesznek, és plazmát izolálnak úgy, hogy 1-2 ml vért 1-2000 x g-vel 10 percig centrifugálnak, majd 120 µl-t osztanak szét 0,65 ml-es mikrocentrifugacsövekbe. A standard ellátási csoportnak csak 3 vérvételi időpontja lesz. A plazmamintákat Bio-Plex 200 készülékkel elemzik az Eve Technologies Corporation (Calgary, AB, Kanada) a Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14) segítségével: GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   ADATLAP:

   Lásd az Excel táblázatot. Az RNS-szekvenciát hőtérképként gyűjtjük össze a differenciálisan expresszált génekhez.

   KOCKÁZATOK:

   A vérvétel kockázatai:

   A vérvétel kockázatai a következők: fájdalom, kellemetlen érzés, vérzés, véraláfutás, bőrpír, fertőzés, ahol a tű bejut a bőrbe; szédülés, ájulás.

   A krioablációval kapcsolatos kockázatok:

   A krioabláció nagyon biztonságos eljárás volt; A PI rendszeresen kínálja ezt az eljárást jóindulatú és rákbetegségek kezelésére az emlőben; eddig 18 daganatos beteget és 36 jóindulatú elváltozást vetettek alá az eljárásnak. Eddig a következő enyhe szövődményekről számoltak be:

   • Zúzódások az abláció helyén - önkorlátozó.
   • Fájdalom – OTC fájdalomcsillapítókkal kezelve.
   • A bőrelhalás azonban elméleti lehetőség az eljárási protokollt követve; nálunk soha nem volt ilyen komplikáció.

   A pembrolizumabbal kapcsolatos kockázatok:

   Az immunellenőrzési pont gátlók toxicitásáról kiterjedt tanulmányok folytak.57 A Pemrolizumab szokásos ajánlott adagja adagonként 200 mg IV (az FDA jóváhagyta). A várható káros hatások a következők:

   • Kiütés
   • Hasmenés
   • Székrekedés
   • Hányinger
   • Fogyás
   • Száraz szemek
   • Fáradtság
   • Fejfájás
   • Láz
   • Ízületi fájdalom
   • Pajzsmirigy diszfunkció

   Titoktartás elvesztése:

   Minden adatot jelszóval védett fájlokban tárolunk a CRI és a PI irodájában. Összeállítás és elemzés céljából minden adatot azonosítunk. A HIPAA megfelelőségre vonatkozó összes protokollt be kell tartani. A titoktartás megsértésének minimális kockázata azonban emberi mulasztás miatt lehetséges.

   ELŐNYÖK:

   A II. és III. karba tartozó betegek előnyösek lehetnek a vizsgálatban való részvételből. Ha a krioterápia és az ellenőrzőpont-inhibitor kombinációján keresztüli immunmodulációval kapcsolatos intuíciónk ténylegesen befolyásolja a tumor kontrollját, akkor ez a két csoport közvetlenül részesül a részvételből. Az I. kontrollcsoport azonban nem fog hasznot húzni a vizsgálatból azon túl, hogy összehasonlító kart biztosít a vizsgálathoz. A javasolt tanulmány fő célja egy új, alacsony kockázatú kezelési megközelítés meghatározása ezekre a magas kockázatú rákos megbetegedésekre, amely végső soron a jövő rákos betegek javára válik.

   MONITORING:

   A vizsgálat lefolytatása során a vizsgálati protokollnak, a GCP-irányelveknek és a TTUHSC Humán Kutatásvédelmi Program kutatási szabályzatának és eljárásainak, valamint a minőségi adatoknak való megfelelés érdekében a Klinikai Kutatóintézetben egy monitor végzi a vizsgálat monitorozását. Az első ellenőrző látogatásra az első alany vizsgálatba vétele után két héten belül kerül sor. A következő megfigyelési látogatásokat rendszeres időközönként, de legalább 2 havonta ütemezi, ha aktív vizsgálati résztvevő is van, a PI és a vizsgálati monitor közösen megállapított időkeretében. Minden összegyűjtött adat 100%-ban hitelesített forrásdokumentum. A vizsgálati monitor minden vizsgálati dokumentumot, azaz adatgyűjtési űrlapokat, kérdőíveket, kábítószer-felelősséget és orvosi feljegyzéseket ellenőrizhet és auditálhat a vonatkozó titoktartási előírásoknak megfelelően.

   FINANSZÍROZÁS:

   Az NIH R21 támogatásra pályázott