Agrupamento de imunomodulação com crioablação (LOGIC) para câncer de mama (LOGIC)

MIRA:

O principal objetivo do estudo proposto é avaliar a sinergia da crioablação do tumor e do inibidor do checkpoint imunológico no câncer de mama de alto risco em humanos. Isso será alcançado comparando a crioablação sozinha e a crioablação em combinação com pembrolizumabe - um [inibidor de checkpoint (anticorpo anti PD-1/PD-L1) atualmente aprovado pela FDA como terapia de câncer] com o padrão atual de tratamento, incluindo ressecção cirúrgica. O padrão atual de terapias neoadjuvantes/adjuvantes permanecerá inalterado por razões éticas de fornecer o padrão de atendimento mais conhecido a todos os pacientes.

OBJETIVOS:

Propomos um estudo exploratório prospectivo randomizado em que pacientes com câncer de mama invasivo triplo negativo em estágio clínico I/II serão randomizados para um dos três braços do estudo:

1. Padrão de cuidado - terapia neoadjuvante seguida de ressecção cirúrgica seguida de terapia adjuvante apropriada conforme necessário.
2. Braço de crioablação - crioablação seguida de terapia neoadjuvante apropriada seguida de ressecção cirúrgica seguida de terapia adjuvante apropriada conforme necessário.

3. Crioablação com Pembrolizumab - Dose única de Pembrolizumab de 200 mg antes (dentro de 24-48 horas) da crioablação seguida de terapia neoadjuvante apropriada seguida de ressecção cirúrgica seguida de terapia adjuvante apropriada conforme necessário.

   As medidas de resultado incluirão análise de sangue e tumor da resposta imune com citometria de fluxo e análise de citocinas no início, após a intervenção e antes da cirurgia. O tecido da biópsia central na linha de base, a repetição da biópsia antes da quimioterapia e a ressecção do tumor também serão analisados ​​quanto ao microambiente do tumor.

   INTRODUÇÃO / ANTECEDENTES / SIGNIFICADO:

   Câncer de mama de alto risco e necessidade de novas abordagens de tratamento: O câncer de mama triplo negativo, que representa 15-20% de todos os diagnósticos de câncer de mama, é considerado de alto risco. Embora a ressecção cirúrgica continue sendo a base do tratamento, a espinha dorsal terapêutica inclui quimioterapia neoadjuvante e adjuvante. Para os pacientes que continuam a ter doença residual significativa mesmo após a ressecção cirúrgica e a conclusão da quimioterapia, outras terapias sistêmicas agressivas, como a capecitabina, são realizadas. O subtipo triplo negativo está associado ao maior número de mutações em todo o genoma e a doença não metastática está associada a 17-20% de falha local e 35-40% de falha distante em 5-10 anos de acompanhamento. Esses dados sugerem que a disseminação hematogênica micrometastática ocorre em um número substancial de pacientes com câncer de mama operável de alto risco e novas abordagens são necessárias para potencializar o controle local e, ao mesmo tempo, controlar a disseminação sistêmica da doença.

   Escopo da imunomodulação: A imunoterapia contra o câncer experimentou um sucesso extraordinário nas últimas décadas. Os antígenos que podem evocar respostas imunes antitumorais formam um alvo imunoterapêutico adequado. A abordagem das terapias de bloqueio de checkpoint de células T mostrou respostas clínicas notáveis ​​em vários tipos de cânceres sólidos, como melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de bexiga e cânceres com deficiência de reparo incompatível. Acredita-se que uma resposta imune antitumoral eficaz seja iniciada pela absorção de antígenos tumorais por células apresentadoras de antígenos (APCs), que por sua vez os apresentam e fornecem sinais coestimulatórios para as células T CD4+ e CD8+. APCs, particularmente células dendríticas, processam antígenos através de uma via de processamento de antígeno exógeno onde o material da célula tumoral é fagocitado e convertido em peptídeos de ligação HLA classe I e classe II que são apresentados às células CD8+ (apresentação cruzada) e CD4+ T, respectivamente. Utilizando esse conhecimento, estudos recentes de fase 1 relataram resposta aprimorada à terapia com inibidores do checkpoint imunológico em combinação com quimioterapia convencional em cânceres de mama triplo-negativos. Certamente, a porcentagem de linfócitos infiltrados no tumor (TILs) foi identificada como um importante parâmetro imunológico, particularmente para cânceres de mama de alto risco, que se correlaciona com a resposta à terapia sistêmica, sugerindo um forte papel da resposta imune do hospedeiro no controle do câncer, independentemente da intervenção terapêutica .

   Limitação da modulação imunológica - As células T são peças-chave na imunidade antitumoral e, portanto, constituem o principal alvo da pesquisa imunoterapêutica. O avanço atual na imunoterapia contra o câncer resulta da identificação e direcionamento do mecanismo de checkpoint envolvendo CTLA-4, PD-1 e PD-L1. CTLA-4 e PD-1 são receptores co-inibitórios encontrados na superfície das células T. Após a ligação aos seus ligantes correspondentes (CD 80/86 e PD-L1/L2, respectivamente), as células T tornam-se anérgicas - um mecanismo fisiológico de tolerância. No contexto do microambiente tumoral, a expressão aberrante juntamente com a exposição crônica a antígenos tumorais pode levar à supressão indesejável da imunidade das células T.

   Bloqueadores de checkpoint desenvolvidos recentemente, como o inibidor de PD-1/PD-L1, pembrolizumab, fornecem uma nova arma contra o câncer com respostas clínicas duráveis ​​e remissões de longo prazo. No entanto, o bloqueio do checkpoint tem se mostrado mais eficaz em tumores com alta carga de mutação, de acordo com a noção de que o reconhecimento de neoantígenos pelas células T desempenha um papel importante no bloqueio do checkpoint. Muitos estudos mostram que, quando o infiltrado de células T reativas ao tumor está ausente ou baixo (baixa porcentagem de TILs), falta o substrato para o bloqueio do checkpoint. Além disso, a maioria dos pacientes com os chamados tumores hipermutados não responde ao bloqueio do checkpoint devido à edição imunológica, o que compromete a capacidade das células T de cumprir sua atividade citotóxica de infiltração tumoral adequada e reconhecimento da classe HLA carregada de antígeno tumoral Eu moléculas. Portanto, aumentar a apresentação do antígeno dentro do tumor é essencial para que o bloqueio do checkpoint seja eficaz.

   Papel das terapias ablativas - particularmente a crioablação: a ablação térmica com crioterapia, laser, radiofrequência, micro-ondas e ultrassom focalizado apresenta uma oportunidade única para abordar tanto o tumor primário quanto a doença micrometastática. Os efeitos da ablação tumoral são múltiplos: (1) a destruição da massa tumoral, diminuindo a carga tumoral e (2) a liberação de antígenos tumorais, tornando-os disponíveis para captação por células apresentadoras de antígenos (APCs) e o próprio tratamento leva a (3 ) a liberação de padrões moleculares associados a danos (DAMPs) e (4) a indução de uma resposta fisiológica de cicatrização de feridas. A ablação leva à criação de um depósito de antígeno in situ contendo todos os tipos de proteínas tumorais, o que leva ao início da resposta imune antitumoral sistêmica que pode potencialmente eliminar a doença metastática oculta. A ablação de tumores em temperaturas acima de 65 °C leva à desnaturação de proteínas. Isso pode afetar as respostas imunes de maneiras opostas, pois as altas temperaturas desnaturam os sinais de ativação imune, como sinais de perigo como proteínas de choque térmico (HSPs). Portanto, a crioablação é a técnica ablativa mais promissora, pois oferece invasividade mínima, menos danos aos tecidos circundantes e melhor preservação de antígenos tumorais, além de dados mais robustos sobre estimulação imunológica.

   Estimulação Imunológica Efetuada pela Crioablação - O congelamento profundo e o descongelamento durante a crioablação induzem a necrose e a regulação positiva de moléculas DAMP que tornam as células tumorais mais suscetíveis a APCs e morte mediada por células T específicas do tumor. A crioablação regula positivamente DAMPs, como HMG1, calreticulina, S100A8/A9 e HSP70, que estimulam o sistema imunológico por meio do Receptor para Produtos Finais de Glicosilação Avançada (RAGE) e receptores semelhantes a toll e melhoram a apresentação de antígenos. Além disso, o meio de citocinas da zona central resultante da crioablação é tipicamente um perfil de citocinas Th1 de IL-2, INF-γ, TNF-α e IL-12.28 Essas citocinas e DAMPs presumivelmente conduzem a resposta das células T CD8+ citotóxicas. Evidências pré-clínicas que apoiam a resposta imune da crioablação: Vários estudos pré-clínicos sobre crioimunologia exploraram se congelar o tumor e deixá-lo in situ tornaria o animal resistente a um novo desafio. Modelos animais utilizando linhagens de células de carcinoma e sarcoma em coelhos e camundongos demonstraram resistência específica do tumor ao novo desafio. O novo desafio com as mesmas linhas de células tumorais mostrou resistência ao crescimento em animais após a crioablação em comparação com a ressecção cirúrgica. Experiência semelhante foi relatada por Blackwood e Cooper com modelos envolvendo ratos inoculados com linhagens celulares de miossarcoma e carcinossarcoma. Ratos com tumores crioablados tiveram maior probabilidade de resistir ao novo desafio e demonstraram regressão de tumores secundários em comparação com ratos tratados cirurgicamente. Bagley et ai. compararam a crioablação com a cirurgia usando fibrossarcoma MCA-10 em camundongos C57BL/6, coletando linfócitos esplênicos em intervalos semanais após o tratamento para ensaios de citotoxicidade. Camundongos submetidos à crioablação apresentaram citotoxicidade significativamente maior do que camundongos tratados cirurgicamente ou não tratados. Sabel et ai. estudaram tumores de adenocarcinoma mamário MT-901 em camundongos BALB/c tratados com crioablação ou ressecção cirúrgica. Após o novo desafio, 86% dos camundongos tratados com cirurgia desenvolveram segundos tumores em comparação com 16% dos camundongos tratados com crioablação. Isso foi específico do tumor, pois a crioablação não ofereceu proteção contra o desafio com outras linhagens de células. Mais recentemente, Kim et al. utilizando linhagens celulares de carcinoma de células renais em camundongos BALB/c relataram resultados semelhantes. Mais recentemente, o efeito abscopal da regressão do tumor em tumores não tratados em modelos animais, onde apenas um dos tumores implantados foi crioablado, foi relatado como resultado da resposta imune sistêmica.

   Evidências clínicas que apoiam a resposta imune da crioablação: Embora o uso clínico da crioablação para o câncer tenha se expandido recentemente, há relativamente poucos estudos que examinam o impacto imunológico em humanos. Ravindranath et ai. mediram o nível de gangliosídeos tumorais séricos e seus títulos de anticorpos em pacientes recebendo crioablação, ablação por radiofrequência ou ressecção de metástase hepática de câncer colorretal. Os níveis séricos de gangliosídeos foram significativamente maiores em pacientes crioablados em comparação com radiofrequência ou cirurgia. Os pacientes submetidos à crioablação também demonstraram títulos mais elevados de IgM contra gangliosídeos tumorais. Si et al. estudaram 20 pacientes com câncer de próstata submetidos à crioablação do tumor primário e relataram um aumento na atividade citolítica contra LNCaP e um aumento no número de células T produtoras de IFN-ɣ. Thakur et al. conduziram um estudo piloto de crioablação e GM-SCF para pacientes com carcinoma de células renais metastático para o pulmão. GM-CSF foi infiltrado perto de uma lesão metastática pulmonar selecionada para crioablação. Terapia GM-CSF adicional foi usada após o procedimento. A combinação de GM-CSF e crioablação produziu uma resposta imune melhorada em termos de citotoxicidade e anticorpos séricos.

   Limitação da crioablação: Apesar dos dados revisados ​​acima, a resposta imune à crioablação não foi uniforme. Alguns estudos pré-clínicos sobre sarcoma osteogênico e modelos de câncer de próstata falharam em mostrar qualquer aumento na função imunológica após a crioablação. Mais importante, vários estudos relataram supressão imunológica com criocirurgia. A maioria desses estudos envolveu linhagens de células de fibrossarcoma em ratos e mostrou diminuição da resistência ao novo desafio após a crioablação, bem como aumento do crescimento de tumores metastáticos e tumores secundários. Do ponto de vista do câncer de mama, Sabel et al. relataram que uma alta taxa de congelamento resultou em aumento de células T específicas do tumor nos gânglios linfáticos de drenagem do tumor, redução na metástase pulmonar e melhora da sobrevida em comparação com baixas taxas de congelamento que também tinham mais Tregs (CD3,CD4,CD127-,CD25+). Portanto, a magnitude do efeito sistêmico induzido apenas pela crioterapia provou ser insuficiente ou contraproducente. O entendimento atual é que perto da fonte ablativa, a lesão direta e a morte celular com necrose liberam antígenos tumorais e (DAMPs) que recrutam e ativam células dendríticas que, por sua vez, estimulam a proliferação de células T e componentes imunológicos. A zona de transição longe da fonte ablativa causa lesão celular indireta e morte celular apoptótica sem liberação de DAMPs, o que causa liberação de citocinas supressivas e deleção e anergia clonal de células T. Intuitivamente, a crioablação estimula uma resposta imune, mas o impacto clínico final é ditado pela proporção de células T efetoras CD4+ para células T reguladoras. A maior proporção de células T efetoras para T reguladoras promove a resposta mais favorável das células T citotóxicas CD8. Embora as células citotóxicas CD8+ eliminem o tumor primário e as micrometástases sistêmicas, é importante que a anergia seja mantida sob controle e as células T de memória efetora (CD45RO+, CCR7-) e central (CCR7+, CD45RO+) sejam estabelecidas para proteção anti- imunidade tumoral.

   HIPÓTESE:

   "A combinação de crioablação com Pembrolizumabe para controle local em câncer de mama triplo negativo de alto risco é superior à ressecção cirúrgica isolada ou crioablação isolada na geração de resposta imune antitumoral".

   MÉTODOS:

   Local de estudo:

   O trabalho exploratório proposto é um estudo randomizado que será conduzido no Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center.

   Tipo de estudo:

   Ensaio Prospectivo Randomizado - conduzido por hipótese

   Design experimental:

   Propomos um único estudo randomizado prospectivo cego, onde as mulheres com câncer de mama triplo negativo Estágio I/II serão incluídas em um dos três braços de forma randomizada 1:1:1: (I) braço de controle com quimioterapia neoadjuvante seguida de tumorectomia/ mastectomia com biópsia de linfonodo sentinela +/- dissecção axilar; (II) Intervenção com crioablação isolada seguida de quimioterapia neoadjuvante seguida de lumpectomia/mastectomia com biópsia de linfonodo sentinela +/- dissecção axilar; (III) Intervenção com crioablação + Pembrolizumab seguida de quimioterapia neoadjuvante seguida de lumpectomia/mastectomia com biopsia de gânglio sentinela +/- dissecção axilar. O cronograma de tratamento é projetado para otimizar o tempo de exposição ao antígeno [Figura-2]. O estudo será registrado na Rede Nacional de Ensaios Clínicos assim que a aprovação do IRB for obtida.

   Assuntos:

   Todos os pacientes com 18 anos ou mais com doença triplamente negativa em estágio clínico I/II serão convidados a participar. Esses pacientes serão triados durante uma consulta de oncologia/cirurgia pela equipe do estudo. Uma lista de randomização computadorizada será usada para atribuição de braço de tratamento usando o site:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Critério de inclusão:

   • fêmeas
   • Câncer Estágio I/II
   • Faixa etária de 18 a 89 anos
   • Diagnósticos: Carcinoma invasivo, ER -, PR-, HER2- (triplo negativo)
   • Achados radiológicos: Doença unifocal visível no ultrassom

   Critério de exclusão:

   • Câncer primário adicional
   • Câncer de mama inflamatório
   • Histórico de doença autoimune
   • História de imunossupressão crônica
   • imunoterapia prévia
   • Vacinação recente (dentro de 4 semanas).
   • Radioterapia prévia
   • Terapia prévia com agente em investigação no último 1 ano
   • Gravidez no momento do diagnóstico e/ou tratamento
   • Amamentação

   Visitas de estudo:

   O consentimento informado será obtido e o paciente será randomizado. Todas as visitas coincidirão com as visitas padrão de atendimento. Em seguida, ocorrerá o seguinte:

   Visita 1: Dia 1:

   Coleta de sangue de linha de base; até 20ml serão coletados em tubos de EDTA; o sangue será centrifugado no TTUHSC. O plasma será utilizado para análise de citocinas e fenotipagem no laboratório TTU. Um tubo de EDTA será enviado para a Universidade de Houston (ao longo dos pontos de tempo do estudo). Os seguintes resultados serão medidos:

   Análise de citocinas

   • Análise de RNA seq PBMC O tecido de biópsia central de linha de base (já disponível na investigação diagnóstica) será avaliado para: (2 lâminas não coradas serão preparadas para seq de RNA de tecido fixo)
   • AT %
   • Tecido tumoral de RNA Seq

   Visita 2 (Apenas Grupo II e III) Após a Crioablação: Dia 3 (+/- 7 dias):

   Coleta de sangue pós-ablação (Grupo II e III) - até 10 ml de sangue em tubo(s) de EDTA:

   • Análise de citocinas

   Visita 3 (todos os grupos) Quimioterapia pré-neoadjuvante: Dia 21 (+/- 14 dias):

   Coleta de sangue no momento da inserção da porta para quimioterapia - até 20ml de sangue em tubos de EDTA:

   • Fenotipagem imune por citometria de fluxo
   • Análise de citocinas
   • Análise de PBMC de sequência de RNA
   • A biópsia do tumor será repetida para análise de TIL e RNA seq

   Visita 4 (todos os grupos): Ressecção pós-quimioterapia (aproximadamente 6 meses após a biópsia original):

   Coleta de sangue pré-operatória para 20ml de sangue em tubos EDTA (semelhante à linha de base):

   • Fenotipagem imune por citometria de fluxo
   • Análise de citocinas
   • Análise de RNA seq PBMC Análise de tecido de espécime cirúrgico (2 lâminas não coradas de tecidos fixados serão preparadas para RNA seq)
   • TIL%
   • Tecido tumoral sequencial de RNA

   Tamanho da amostra:

   Os linfócitos infiltrantes tumorais (TILs), particularmente no estroma do câncer de mama triplo negativo, são prognósticos e preditivos da resposta à terapia. Portanto, as recomendações do International TILs Working Group foram usadas para calcular o tamanho da amostra para este projeto. Assume-se que a variação percentual de TILs seja de 10% para o braço de controle e 50% para o braço de tratamento. Uma amostra de 10 pacientes por grupo pode atingir 80% de poder para detectar uma diferença média de 0,4 (0,5 vs. 0,1) com um desvio padrão de 0,3, usando um teste t de variância igual bilateral de duas amostras (alfa = 0,05) . Assumindo uma taxa de abandono de 30%, um total de 12 pacientes em cada braço seria suficiente para um total de 36 pacientes; isso atingiria um poder de 90%. Isso significa que um mínimo de 10 pacientes por braço e um máximo de 12 pacientes por braço levará a um estudo estatisticamente significativo.

   Plano Estatístico:

   Estatísticas descritivas serão usadas para calcular os intervalos, médias e variações para as variáveis ​​independentes cuidado padrão, crio, crio+pembro. Isso sugerirá que a concentração das observações em torno da média e variação das observações das médias. O teste de normalidade será considerado para verificar se os dados seguem ou não a distribuição normal. Os gráficos quantil-quantil normais (também chamados gráficos q-q) serão utilizados para determinar se os conjuntos de dados vêm de uma população normal. Para detectar os outliers (se houver) várias medidas estatísticas serão levadas em consideração. Para verificar a homogeneidade das variâncias das variáveis ​​independentes standard care, cryo, cryo+pembro, será realizado o teste de Levene, estabelecendo hipóteses nula e alternativa. Para comparar a diferença de significância entre as médias das variáveis, será realizada uma análise de variância (ANOVA) one-way. Serão introduzidas as hipóteses nula e alternativa para as médias. Na ANOVA, será testada a significância estatística das médias (α = 0,05) por meio da estatística F-test. Se as médias forem encontradas diferença estatisticamente significativa, então os testes de comparações múltiplas post-hoc serão realizados. Testes post-hoc de comparações múltiplas (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey, etc.) serão utilizados para detectar as médias dos grupos significativos apropriados. Se as amostras não atenderem aos pressupostos de normalidade, vários testes não paramétricos serão considerados para as análises estatísticas.

   Crioablação de Tumores:

   Todos os pacientes registrados serão randomizados para um dos três braços do estudo. Os pacientes nos braços II e III receberão crioablação de acordo com o seguinte protocolo (semelhante ao protocolo usado no estudo ACOSOG Z1072).

   Dispositivo de crioablação: A crioablação será realizada usando o Sistema Criocirúrgico ProSense disponível comercialmente (IceCure Medical Ltd, Caesarea, Israel) que consiste em um console, criossonda e nitrogênio líquido associado (criogênio) Case Dewars. O console é uma unidade autônoma que possui uma interface para controlar e monitorar o procedimento de crioablação. Ele opera com alimentação padrão de 120 VAC (60 Hz).

   Operação do dispositivo: O sistema criocirúrgico ProSense usa um sistema fechado para circular nitrogênio líquido dentro da ponta da criossonda, criando temperaturas abaixo do congelamento que resultam na ablação do tecido-alvo. A lesão é identificada com ultrassom e a criossonda é colocada no centro da lesão guiada por ultrassom após anestesia local adequada, e a ablação é realizada de acordo com o algoritmo predeterminado de congelamento-descongelamento-congelamento. A sonda é então aquecida por um aquecedor de resistência elétrica interna e removida do paciente. Procedimento de crioablação: O tumor é identificado usando uma sonda de ultrassom linear de alta resolução em duas visualizações ortogonais. A dimensão mais longa do tumor é identificada para inserção paralela da sonda. Essa dimensão é inserida no console; o console fornece o comprimento da ponta da criossonda para passar pela lesão após a inserção. Após a inserção, a posição da sonda é confirmada em duas vistas ortogonais. A crioablação é feita usando o ciclo congelamento-descongelamento-congelamento de acordo com o tamanho do tumor. Todo o procedimento é monitorado sob visão e solução salina é infiltrada para evitar congelamento da pele por hidrodissecação da pele para longe da bola de gelo. O tamanho da bola de gelo é registrado em dimensões ortogonais. Em nosso protocolo, se um paciente apresentar mais de uma lesão, apenas uma lesão será ablacionada; no entanto, biópsias de outras lesões serão estudadas quanto ao efeito abscopal.

   Infusão de Pembrolizumabe e Posologia:

   Como passo inicial, confirmamos a segurança e a tolerabilidade dos inibidores do checkpoint imunológico com a crioablação do tumor em mulheres com câncer de mama recém-diagnosticado. Uma consideração importante foi a seleção de um anticorpo imunomodulador. Pembrolizumab, um anticorpo aprovado pela FDA contra PD-1/PD-L1, tem um perfil de segurança bem estabelecido e induz remissões de longo prazo com duração >10 anos em 10-20% dos pacientes com melanoma avançado.50 Além disso, como as células T regulam positivamente a expressão de PD-1/PD-L1 após serem expostas a antígenos,51 que por sua vez podem atenuar a resposta citotóxica, o pembrolizumabe é ideal para modulação imune em combinação com crioablação. Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) publicou um estudo piloto sobre esta combinação; nenhum efeito colateral grave atribuível ao ipilimumabe foi relatado; nenhuma cirurgia foi adiada. MSKCC usou 10 mg/Kg em dose única; no entanto, uma vez que os estudos relatam eventos adversos maiores nessa dose, propomos a dose recomendada de 200 mg para IV em 90 minutos antes da crioablação, que é a dose atualmente utilizada no cenário clínico para cânceres triplo negativos.

   Metodologia para Medidas de Resultados:

   Iremos observar e monitorar a(s) resposta(s) imune(s) após os procedimentos de crioablação com e sem o pembrolizumab. Amostras de sangue serão coletadas em tubos de coleta de sangue com EDTA e então aliquotadas para análise fenotípica de células T e coleta de plasma para citocina/quimiocina e para análise de seq de RNA, nos pontos de tempo indicados. Lâminas de patologia serão feitas para pesquisa de amostras de biópsia central na linha de base e de tumorectomia e linfonodos sentinela no momento da cirurgia. Cinco lâminas serão feitas por espécime (após a conclusão da patologia de rotina) para H&E e imuno-histoquímica para infiltrados de células imunes para calcular a porcentagem de TILs. Todos os colaboradores/pessoal-chave envolvidos na realização da análise de medida de resultado serão cegos para os grupos de randomização.

   A seguir estão os detalhes para análise de resultados:

   Cálculo de TIL: Todas as amostras de tecido submetidas a relatórios patológicos de rotina serão avaliadas para relatórios de TIL de acordo com as diretrizes apresentadas pelo Grupo de Trabalho Internacional de TILs. A mudança na pontuação TIL entre o tecido original da biópsia central e o tecido cirúrgico será o foco da análise para avaliar o impacto das intervenções propostas.

   Medição de Alterações de Células T no Sangue: Os subtipos de células T podem ser definidos pela expressão diferencial de marcadores de superfície celular. Vamos monitorar células T para ativação, aumento de células T efetoras CD8+ e desenvolvimento de memória central e efetora. Para fenotipagem de células T, a coloração de sangue total (100 µl/mancha) será realizada com anticorpos para CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 e Ki67 com controles isotípicos apropriados.55 Após a lise de RBC, as células mononucleares coradas serão processadas em um citômetro de fluxo Attune NxT de 14 cores (Thermofisher, Waltham, MA) e analisadas usando o software FlowJo (Becton, Dickinson and Company). As células T (CD3+, CD4+ ou CD8+) serão analisadas quanto a alterações na memória ingênua (CD27+, CCR7+, CD45RO-), efetora (CCR7-, CD45RO-), memória efetora (CD27-, CCR7-,CD45RO+) e central ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) marcadores fenotípicos, bem como para ativação (ICOS e CD137) e proliferação (Ki67). Analisaremos ainda as porcentagens de células T-reguladoras (CD25+, CD127-). Usaremos esses dados para determinar uma assinatura imune de células T para correlacionar a eficácia da crioabalação +/- Pembrolizumab para prever a imunidade antitumoral a longo prazo.

   Análise plasmática de citocinas/quimiocinas: Nossa análise inicial será determinar quais citocinas/quimiocinas e quais concentrações são detectadas no sangue após crioablação +/- pembrolizumabe e como seus perfis são alterados. Vamos nos concentrar nos perfis de citocinas inflamatórias e auxiliares das células T e como essas citocinas influenciam e direcionam a resposta das células T. Além disso, veremos as mudanças nas quimiocinas. Foi demonstrado que sua expressão alterada em malignidades dita o recrutamento e ativação de leucócitos, angiogênese, proliferação de células cancerígenas e metástase em todos os estágios da doença.56 Na linha de base, 24-48 horas após a ablação, entre a pré-quimioterapia, o sangue será coletado e o plasma isolado por centrifugação de 1-2 ml de sangue a 1-2000 x g por 10 minutos e, em seguida, alíquota de 120 µl em tubos de microcentrífuga de 0,65 mL. O grupo de tratamento padrão terá apenas 3 pontos de tempo de amostra de sangue. As amostras de plasma serão analisadas com um Bio-Plex 200 na Eve Technologies Corporation (Calgary, AB Canada) usando o Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   FICHA DE DADOS:

   Veja planilha Excel. A sequência de RNA será coletada como mapas de calor para genes expressos diferencialmente.

   RISCOS:

   Riscos de coleta de sangue:

   Os riscos de uma coleta de sangue incluem: dor, desconforto, sangramento, hematomas, vermelhidão, infecção onde a agulha penetra na pele; sensação de tontura, desmaio.

   Riscos relacionados à crioablação:

   A crioablação tem sido um procedimento muito seguro; PI tem oferecido rotineiramente este procedimento para doenças benignas e cancerígenas na mama; até agora, 18 pacientes com câncer e 36 lesões benignas foram submetidos ao procedimento. As seguintes complicações leves foram relatadas até agora:

   • Hematoma no local da ablação - autolimitado.
   • Dor - controlada com analgésicos OTC.
   • A necrose da pele é uma possibilidade teórica, porém, seguindo o protocolo do procedimento; nunca tivemos essa complicação.

   Riscos relacionados ao pembrolizumabe:

   Houve estudos extensos sobre a toxicidade dos inibidores do checkpoint imunológico.57 A dose padrão recomendada para Pemrolizumabe é de 200 mg IV por dose (aprovada pelo FDA). Os efeitos adversos previstos incluem:

   • Irritação na pele
   • Diarréia
   • Constipação
   • Náusea
   • Perda de peso
   • Olhos secos
   • Fadiga
   • Dor de cabeça
   • Febre
   • dor nas articulações
   • disfunção da tireóide

   Perda de Confidencialidade:

   Todos os dados serão mantidos em arquivos protegidos por senha no escritório do CRI e do PI. Todos os dados serão desidentificados para compilação e análise. Todos os protocolos de conformidade HIPAA serão seguidos. No entanto, o risco mínimo de quebra de confidencialidade é possível devido a erro humano.

   BENEFÍCIOS:

   Os pacientes nos braços II e III podem se beneficiar da participação no estudo. Se nossa intuição de modulação imunológica por meio da combinação de crioterapia e drogas inibidoras de checkpoint realmente afetar o controle do tumor, esses dois grupos se beneficiarão diretamente da participação. No entanto, o braço de controle I não vai se beneficiar do estudo além de fornecer um braço de comparação para o estudo. O principal objetivo do estudo proposto é identificar uma nova abordagem de tratamento de baixo risco para esses cânceres de alto risco, que acabará por beneficiar os futuros pacientes com câncer.

   MONITORAMENTO:

   Para garantir a conformidade com o protocolo do estudo, as diretrizes do GCP e as políticas e procedimentos de pesquisa do Programa de Proteção em Pesquisa Humana TTUHSC durante a condução do estudo, bem como dados de qualidade, um monitor no Instituto de Pesquisa Clínica conduzirá o monitoramento do estudo. A primeira visita de monitoramento será realizada dentro de duas semanas após o primeiro sujeito ter sido incluído no estudo. As visitas de monitoramento subsequentes serão agendadas periodicamente, mas não menos que a cada 2 meses quando houver um participante ativo do estudo, em um prazo mutuamente acordado pelo PI e pelo monitor do estudo. Todos os dados coletados serão 100% verificados no documento de origem. O monitor do estudo pode inspecionar e auditar todos os documentos do estudo, ou seja, formulários de coleta de dados, questionários, contabilidade de medicamentos e registros médicos dentro dos regulamentos de confidencialidade aplicáveis.

   FINANCIAMENTO:

   Inscreveu-se para o subsídio R21 do NIH