Grupowanie immunomodulacji z krioablacją (LOGIC) w przypadku raka piersi (LOGIC)

CELUJE:

Głównym celem proponowanych badań jest ocena synergii krioablacji guza i inhibitora immunologicznego punktu kontrolnego w raku piersi wysokiego ryzyka u ludzi. Zostanie to osiągnięte poprzez porównanie samej krioablacji i krioablacji w połączeniu z pembrolizumabem – [inhibitorem punktu kontrolnego (przeciwciało anty-PD-1/PD-L1) obecnie zatwierdzonym przez FDA jako terapia przeciwnowotworowa] z obecnym standardem opieki, w tym resekcją chirurgiczną. Obecny standard terapii neoadiuwantowej/adjuwantowej pozostanie niezmieniony ze względów etycznych polegających na zapewnieniu wszystkim pacjentom najbardziej znanego standardu opieki.

CELE:

Proponujemy prospektywne randomizowane badanie eksploracyjne, w którym pacjentki z potrójnie ujemnym inwazyjnym rakiem piersi w stadium klinicznym I/II zostaną losowo przydzielone do jednego z trzech ramion badania:

1. Standard postępowania – leczenie neoadiuwantowe, następnie resekcja chirurgiczna, a następnie w razie potrzeby odpowiednia terapia adjuwantowa.
2. Ramię krioablacji - krioablacja, po której następuje odpowiednia terapia neoadjuwantowa, następnie resekcja chirurgiczna, a następnie odpowiednia terapia uzupełniająca w razie potrzeby.

3. Krioablacja pembrolizumabem - Pojedyncza dawka pembrolizumabu 200 mg przed (w ciągu 24-48 godzin) krioablacji, po której następuje odpowiednia terapia neoadiuwantowa, a następnie resekcja chirurgiczna, a następnie odpowiednie leczenie uzupełniające w razie potrzeby.

   Miary wyników będą obejmować analizę odpowiedzi immunologicznej krwi i guza za pomocą cytometrii przepływowej i analizy cytokin na początku badania, po interwencji i przed operacją. Tkanka z biopsji gruboigłowej na początku badania, powtórna biopsja przed chemioterapią i resekcją guza zostaną również przeanalizowane pod kątem mikrośrodowiska guza.

   WPROWADZENIE / TŁO / ZNACZENIE:

   Rak piersi wysokiego ryzyka i potrzeba nowych metod leczenia: Potrójnie ujemny rak piersi, który stanowi 15-20% wszystkich diagnoz raka piersi, jest uważany za raka wysokiego ryzyka. Podczas gdy resekcja chirurgiczna pozostaje podstawą leczenia, podstawą leczenia jest chemioterapia neoadiuwantowa i adjuwantowa. W przypadku pacjentów, u których nadal występuje znaczna choroba resztkowa nawet po resekcji chirurgicznej i zakończeniu chemioterapii, przeprowadza się dalsze agresywne terapie systemowe, takie jak kapecytabina. Podtyp potrójnie ujemny jest związany z największą liczbą mutacji w całym genomie, a choroba bez przerzutów jest związana z 17-20% niepowodzeniem miejscowym i 35-40% niepowodzeniem odległym po 5-10 latach obserwacji. Dane te sugerują, że hematogenne rozprzestrzenianie się mikroprzerzutów występuje u znacznej liczby pacjentów z operacyjnym rakiem piersi wysokiego ryzyka i wymagane są nowsze podejścia, które wzmacniają lokalną kontrolę, jednocześnie kontrolując ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się choroby.

   Zakres immunomodulacji: Immunoterapia raka odniosła niezwykły sukces w ostatnich dziesięcioleciach. Antygeny, które mogą wywoływać przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, tworzą odpowiedni cel immunoterapeutyczny. Podejście polegające na blokowaniu punktów kontrolnych limfocytów T wykazało niezwykłe odpowiedzi kliniczne w kilku typach nowotworów litych, takich jak czerniak, niedrobnokomórkowy rak płuca, rak pęcherza moczowego i raki z niedoborem naprawy niedopasowania. Uważa się, że skuteczna przeciwnowotworowa odpowiedź immunologiczna jest inicjowana przez pobieranie antygenów nowotworowych przez komórki prezentujące antygen (APC), które z kolei je prezentują i dostarczają sygnałów kostymulujących zarówno limfocytom T CD4+, jak i CD8+. Komórki APC, zwłaszcza komórki dendrytyczne, przetwarzają antygeny poprzez egzogenny szlak przetwarzania antygenu, w którym materiał komórek nowotworowych jest fagocytowany i przekształcany w peptydy wiążące HLA klasy I i klasy II, które są prezentowane odpowiednio limfocytom T CD8+ (prezentacja krzyżowa) i CD4+. Wykorzystując tę ​​​​wiedzę, ostatnie badania fazy 1 wykazały zwiększoną odpowiedź na terapię inhibitorem immunologicznego punktu kontrolnego w połączeniu z konwencjonalną chemioterapią w potrójnie ujemnym raku piersi. Z pewnością odsetek limfocytów naciekających guz (TIL) został zidentyfikowany jako ważny parametr immunologiczny, szczególnie w przypadku raka piersi wysokiego ryzyka, który koreluje z odpowiedzią na terapię systemową, co sugeruje silną rolę odpowiedzi immunologicznej gospodarza w kontroli raka, niezależnie od interwencji terapeutycznej .

   Ograniczenie modulacji immunologicznej - Limfocyty T odgrywają kluczową rolę w odporności przeciwnowotworowej i dlatego stanowią główny cel badań immunoterapeutycznych. Obecny przełom w immunoterapii nowotworów wynika z identyfikacji i ukierunkowania mechanizmu punktu kontrolnego obejmującego CTLA-4, PD-1 i PD-L1. CTLA-4 i PD-1 to receptory koinhibicyjne znajdujące się na powierzchni limfocytów T. Po związaniu się z odpowiadającymi im ligandami (odpowiednio CD 80/86 i PD-L1/L2), limfocyty T stają się anergiczne – fizjologiczny mechanizm tolerancji. W kontekście mikrośrodowiska guza, nieprawidłowa ekspresja wraz z przewlekłą ekspozycją na antygeny nowotworowe może prowadzić do niepożądanej supresji odporności limfocytów T.

   Niedawno opracowane blokery punktów kontrolnych, takie jak inhibitor PD-1/PD-L1, pembrolizumab, zapewniają nową broń w walce z rakiem, zapewniającą trwałą odpowiedź kliniczną i długoterminowe remisje. Jednak wykazano, że blokada punktów kontrolnych jest najskuteczniejsza w nowotworach z dużym obciążeniem mutacjami, zgodnie z poglądem, że rozpoznawanie neoantygenów przez limfocyty T odgrywa główną rolę w blokowaniu punktów kontrolnych. Wiele badań pokazuje, że gdy naciek limfocytów T reagujących z nowotworem jest nieobecny lub niski (niski odsetek TIL), brakuje substratu do blokady punktu kontrolnego. Dodatkowo, większość pacjentów z tak zwanymi hipermutowanymi nowotworami nie reaguje na blokadę punktu kontrolnego z powodu immuno-editingu, co upośledza zdolność limfocytów T do wypełniania ich aktywności cytotoksycznej odpowiedniego naciekania guza i rozpoznawania klasy HLA obciążonej antygenem nowotworowym I cząsteczki. Dlatego wzmocnienie prezentacji antygenu w guzie jest niezbędne, aby blokada punktów kontrolnych była skuteczna.

   Rola terapii ablacyjnych – w szczególności krioablacja: Ablacja termiczna z krioterapią, laserem, falami o częstotliwości radiowej, mikrofalami i skupionymi ultradźwiękami stanowi wyjątkową okazję do zajęcia się zarówno guzem pierwotnym, jak i mikroprzerzutami. Efekty ablacji guza są wielorakie: (1) zniszczenie masy guza, zmniejszenie masy guza i (2) uwolnienie antygenów nowotworowych, czyniąc je dostępnymi do wychwytu przez komórki prezentujące antygen (APC), a samo leczenie prowadzi do (3 ) uwolnienie wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniami (DAMP) i (4) wywołanie fizjologicznej reakcji gojenia się ran. Ablacja prowadzi do powstania depotu antygenu in situ zawierającego wszystkie rodzaje białek nowotworowych, co prowadzi do zainicjowania ogólnoustrojowej przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej, która może potencjalnie wyeliminować utajoną chorobę przerzutową. Ablacja guzów w temperaturze powyżej 65°C prowadzi do denaturacji białek. Może to wpływać na reakcje immunologiczne w przeciwny sposób, ponieważ wysokie temperatury denaturują sygnały aktywujące układ odpornościowy, takie jak sygnały zagrożenia, takie jak białka szoku cieplnego (HSP). Dlatego krioablacja jest najbardziej obiecującą techniką ablacyjną, ponieważ zapewnia minimalną inwazyjność, mniejsze uszkodzenia otaczających tkanek i lepszą ochronę antygenów nowotworowych oraz najbardziej wiarygodne dane dotyczące stymulacji immunologicznej.

   Stymulacja immunologiczna spowodowana krioablacją - Głębokie zamrażanie i rozmrażanie podczas krioablacji indukuje martwicę i regulację w górę cząsteczek DAMP, co czyni komórki nowotworowe bardziej podatnymi na APC i specyficzne dla nowotworu zabijanie za pośrednictwem komórek T. Krioablacja zwiększa poziom DAMP, takich jak HMG1, kalretikulina, S100A8/A9 i HSP70, które stymulują układ odpornościowy poprzez receptor końcowych produktów zaawansowanej glikozylacji (RAGE) i receptory toll-podobne oraz poprawiają prezentację antygenu. Ponadto środowisko cytokin strefy centralnej wynikające z krioablacji jest zazwyczaj profilem cytokin Th1 IL-2, INF-γ, TNF-α i IL-12.28 Te cytokiny i DAMP przypuszczalnie kierują cytotoksyczną odpowiedzią limfocytów T CD8+. Dowody przedkliniczne potwierdzające odpowiedź immunologiczną krioablacji: W kilku badaniach przedklinicznych dotyczących krioimmunologii zbadano, czy zamrożenie guza i pozostawienie go in situ uczyni zwierzę odpornym na ponowną prowokację. Modele zwierzęce wykorzystujące linie komórkowe raka i mięsaka u królików i myszy wykazały specyficzną dla nowotworu oporność na ponowną prowokację. Ponowna prowokacja tymi samymi liniami komórek nowotworowych wykazała oporność na wzrost u zwierząt po krioablacji w porównaniu z resekcją chirurgiczną. Podobne doświadczenia opisali Blackwood i Cooper z modelami obejmującymi szczury zaszczepione liniami komórkowymi mięśniakomięsaka i raka. Szczury z nowotworami poddanymi krioablacji były bardziej odporne na ponowną ekspozycję i wykazywały regresję guzów wtórnych w porównaniu ze szczurami leczonymi chirurgicznie. Bagley i in. porównali krioablację z operacją przy użyciu włókniakomięsaka MCA-10 u myszy C57BL/6, zbierając limfocyty śledziony w odstępach tygodniowych po leczeniu do testów cytotoksyczności. Myszy poddane krioablacji miały znacznie wyższą cytotoksyczność niż myszy leczone chirurgicznie lub nieleczone. Sabel i in. badali guzy gruczolakoraka sutka MT-901 u myszy BALB/c leczonych krioablacją lub resekcją chirurgiczną. Po ponownej prowokacji u 86% myszy poddanych zabiegowi chirurgicznemu rozwinęły się drugie guzy w porównaniu z 16% myszy poddanych krioablacji. Było to specyficzne dla guza, ponieważ krioablacja nie zapewniała ochrony przed prowokacją innymi liniami komórkowymi. Niedawno Kim i in. wykorzystując linie komórkowe raka nerki u myszy BALB/c uzyskano podobne wyniki. Niedawno w wyniku ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej odnotowano abskopalny efekt regresji guza w nieleczonych guzach w modelach zwierzęcych, w których tylko jeden z wszczepionych guzów został poddany krioablacji.

   Dowody kliniczne potwierdzające odpowiedź immunologiczną krioablacji: Chociaż kliniczne zastosowanie krioablacji w leczeniu raka ostatnio się rozszerzyło, istnieje stosunkowo niewiele badań oceniających wpływ immunologiczny u ludzi. Ravindranath i in. zmierzyli poziom gangliozydów nowotworowych w surowicy i miana ich przeciwciał u pacjentów poddawanych krioablacji, ablacji prądem o częstotliwości radiowej lub resekcji przerzutów raka jelita grubego do wątroby. Stężenia gangliozydów w surowicy były istotnie wyższe u pacjentów poddanych krioablacji w porównaniu z radiofrekwencją lub zabiegiem chirurgicznym. Pacjenci poddani krioablacji wykazywali również wyższe miana IgM przeciwko gangliozydom nowotworowym. Si i in. przebadali 20 pacjentów z rakiem gruczołu krokowego poddawanych krioablacji guza pierwotnego i stwierdzili wzrost aktywności cytolitycznej przeciwko LNCaP oraz wzrost liczby limfocytów T wytwarzających IFN-ɣ. Thakura i in. przeprowadzili pilotażowe badanie krioablacji i GM-SCF u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym z przerzutami do płuc. GM-CSF infiltrowano w pobliżu zmiany przerzutowej w płucach wybranej do krioablacji. Po zabiegu zastosowano dodatkową terapię GM-CSF. Połączenie GM-CSF i krioablacji spowodowało zwiększoną odpowiedź immunologiczną pod względem cytotoksyczności i przeciwciał w surowicy.

   Ograniczenia krioablacji: Pomimo powyższych danych odpowiedź immunologiczna na krioablację nie była jednolita. Niektóre badania przedkliniczne dotyczące mięsaków kościotwórczych i modeli raka prostaty nie wykazały żadnego wzrostu funkcji odpornościowych po krioablacji. Co ważniejsze, kilka badań wykazało supresję immunologiczną za pomocą kriochirurgii. Większość z tych badań obejmowała linie komórkowe włókniakomięsaka u szczurów i wykazała zmniejszoną oporność na ponowną prowokację po krioablacji, a także zwiększony wzrost guzów przerzutowych i guzów wtórnych. Z perspektywy raka piersi Sabel i in. donieśli, że wysoka szybkość zamrażania skutkowała zwiększeniem liczby limfocytów T specyficznych dla nowotworu w węzłach chłonnych odprowadzających guz, zmniejszeniem przerzutów do płuc i poprawą przeżywalności w porównaniu z niską szybkością zamrażania, która również miała więcej Treg (CD3, CD4, CD127-, CD25+). Dlatego wielkość efektu ogólnoustrojowego wywołanego samą krioterapią okazała się niewystarczająca lub przynosi efekt przeciwny do zamierzonego. Obecne rozumienie jest takie, że w pobliżu źródła ablacyjnego bezpośrednie uszkodzenie i śmierć komórek z martwicą uwalniają antygeny nowotworowe i (DAMP), które rekrutują i aktywują komórki dendrytyczne, które z kolei stymulują proliferację limfocytów T i składników odpornościowych. Strefa przejściowa z dala od źródła ablacyjnego powoduje pośrednie uszkodzenie komórek i apoptotyczną śmierć komórki bez uwalniania DAMP, co powoduje uwolnienie cytokin supresyjnych i klonalną delecję i anergię limfocytów T. Intuicyjnie krioablacja stymuluje odpowiedź immunologiczną, ale ostateczny efekt kliniczny jest podyktowany stosunkiem komórek efektorowych CD4+ do komórek T regulatorowych. Wyższy stosunek komórek efektorowych T do komórek regulatorowych T promuje bardziej korzystną odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T CD8. Podczas gdy komórki cytotoksyczne CD8+ eliminują pierwotnego guza i układowe mikroprzerzuty, ważne jest, aby anergia była kontrolowana, a zarówno efektorowe (CD45RO+, CCR7-), jak i centralne (CCR7+, CD45RO+) komórki T pamięci były ustanowione dla długoterminowej ochrony anty- odporność nowotworu.

   HIPOTEZA:

   „Połączenie krioablacji z pembrolizumabem w celu miejscowej kontroli potrójnie ujemnego raka piersi wysokiego ryzyka przewyższa samą resekcję chirurgiczną lub samą krioablację w generowaniu przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej”.

   METODY:

   Miejsce badania:

   Proponowana praca eksploracyjna to randomizowane badanie, które zostanie przeprowadzone w Texas Tech University Health Sciences Center-Breast Center of Excellence, UMC Cancer Center.

   Rodzaj studiów:

   Prospektywne badanie z randomizacją — oparte na hipotezach

   Eksperymentalny projekt:

   Proponujemy prospektywne, randomizowane badanie z pojedynczą ślepą próbą, w którym kobiety z potrójnie ujemnym rakiem piersi w stadium I/II zostaną włączone do jednego z trzech ramion z randomizacją w stosunku 1:1:1: (I) Ramię kontrolne z chemioterapią neoadiuwantową, po której następuje lumpektomia/ mastektomia z biopsją węzła wartowniczego +/- wycięcie pachowe; (II) Interwencja z samą krioablacją, a następnie chemioterapią neoadiuwantową, a następnie lumpektomią/mastektomią z biopsją węzła wartowniczego +/- wycięcie pachowe; (III) Interwencja z krioablacją + pembrolizumabem, a następnie chemioterapią neoadiuwantową, a następnie lumpektomią/mastektomią z biopsją węzła wartowniczego +/- wycięcie pachowe. Harmonogram leczenia ma na celu optymalizację czasu ekspozycji na antygen [Rysunek 2]. Badanie zostanie zarejestrowane w National Clinical Trials Network po uzyskaniu zgody IRB.

   Przedmioty:

   Wszyscy pacjenci w wieku 18 lat i starsi z chorobą potrójnie ujemną w stadium klinicznym I/II zostaną zaoferowani do udziału. Pacjenci ci zostaną poddani badaniu przesiewowemu podczas wizyty onkologicznej/chirurgicznej przez zespół badawczy. Skomputeryzowana lista randomizacji zostanie wykorzystana do przypisania grup terapeutycznych za pomocą strony internetowej:

   https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists

   Kryteria przyjęcia:

   • kobiety
   • Rak I/II stopnia
   • Przedział wiekowy 18 - 89 lat
   • Diagnozy: Rak inwazyjny, ER-, PR-, HER2- (potrójnie ujemny)
   • Wyniki radiologii: Choroba jednoogniskowa widoczna w badaniu ultrasonograficznym

   Kryteria wyłączenia:

   • Dodatkowy rak pierwotny
   • Zapalny rak piersi
   • Historia chorób autoimmunologicznych
   • Historia przewlekłej immunosupresji
   • Wcześniejsza immunoterapia
   • Niedawne szczepienie (w ciągu 4 tyg.)
   • Wcześniejsza radioterapia
   • Wcześniejsza terapia badanym lekiem w ciągu ostatniego roku
   • Ciąża w momencie diagnozy i/lub leczenia
   • Karmienie piersią

   Wizyty studyjne:

   Uzyskana zostanie świadoma zgoda, a następnie pacjent zostanie zrandomizowany. Wszystkie wizyty pokrywają się z wizytami standardowymi. Następnie nastąpi:

   Wizyta 1: Dzień 1:

   Podstawowe pobieranie krwi; do probówek z EDTA zostanie zebranych do 20 ml; krew zostanie odwirowana w TTUHSC. Osocze zostanie użyte do analizy cytokin i fenotypowania w laboratorium TTU. Jedna probówka z EDTA zostanie wysłana do University of Houston (przez wszystkie punkty czasowe badania). Zmierzone zostaną następujące wyniki:

   Analiza cytokin

   • Analiza seq RNA PBMC Wyjściowa tkanka z biopsji rdzeniowej (dostępna już z badań diagnostycznych) zostanie oceniona pod kątem: (2 niebarwione szkiełka zostaną przygotowane do seq RNA z utrwalonej tkanki)
   • do %
   • Tkanka nowotworowa Seq RNA

   Wizyta 2 (tylko grupa II i III) po krioablacji: dzień 3 (+/- 7 dni):

   Pobranie krwi po ablacji (Grupa II i III) – do 10ml krwi w probówce(ach) z EDTA:

   • Analiza cytokin

   Wizyta 3 (wszystkie grupy) Chemioterapia przed neoadjuwantem: Dzień 21 (+/- 14 dni):

   Pobieranie krwi w momencie zakładania portu do chemioterapii – do 20ml krwi w probówkach z EDTA:

   • Fenotypowanie odporności za pomocą cytometrii przepływowej
   • Analiza cytokin
   • Analiza sekwencji PBMC RNA
   • Biopsja guza zostanie powtórzona w celu analizy sekwencji TIL i RNA

   Wizyta 4 (wszystkie grupy): Resekcja po chemioterapii (około 6 miesięcy po pierwotnej biopsji):

   Przedoperacyjne pobranie krwi do 20 ml krwi w probówkach z EDTA (podobnie jak przed operacją):

   • Fenotypowanie odporności za pomocą cytometrii przepływowej
   • Analiza cytokin
   • Analiza seq RNA PBMC Analiza tkanki próbki chirurgicznej (2 niebarwione szkiełka z utrwalonych tkanek zostaną przygotowane do seq RNA)
   • TIL%
   • Tkanka nowotworowa seq RNA

   Wielkość próbki:

   Limfocyty naciekające guz (TIL), szczególnie w zrębie potrójnie ujemnego raka piersi, są prognostyczne i przewidujące odpowiedź na leczenie. Dlatego do obliczenia wielkości próby dla tego projektu wykorzystano zalecenia Międzynarodowej Grupy Roboczej TILs. Zakłada się, że procentowa zmiana TIL wynosi 10% dla ramienia kontrolnego i 50% dla ramienia terapeutycznego. Próbka 10 pacjentów na grupę może osiągnąć 80% mocy, aby wykryć średnią różnicę 0,4 (0,5 vs. 0,1) przy odchyleniu standardowym 0,3, przy użyciu dwustronnego testu t równej wariancji dla dwóch próbek (alfa=0,05) . Zakładając 30% wskaźnik rezygnacji, w sumie 12 pacjentów w każdym ramieniu wystarczyłoby na łącznie 36 pacjentów; dałoby to 90% mocy. Oznacza to, że co najmniej 10 pacjentów na ramię i maksymalnie 12 pacjentów na ramię doprowadzi do statystycznie istotnego badania.

   Plan statystyczny:

   Statystyki opisowe zostaną wykorzystane do obliczenia zakresów, średnich i wariancji dla zmiennych niezależnych standard care, krio, krio+pembro. Sugeruje to, że koncentracja obserwacji wokół średniej i zmienność obserwacji od średnich. Test normalności zostanie rozważony w celu sprawdzenia, czy dane mają rozkład normalny. Normalne wykresy kwantyl-kwantyl (zwane również wykresami q-q) zostaną wykorzystane do określenia, czy zestawy danych pochodzą z normalnej populacji. Aby wykryć wartości odstające (jeśli takie istnieją), zostanie wziętych pod uwagę kilka miar statystycznych. Aby sprawdzić jednorodność wariancji dla zmiennych niezależnych standard care, krio, krio+pembro, zostanie przeprowadzony test Levene'a poprzez postawienie hipotez zerowych i alternatywnych. Aby porównać różnicę istotności między średnimi zmiennych, zostanie przeprowadzona jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA). Przedstawione zostaną hipotezy zerowe i alternatywne dla średnich. W ANOVA istotność statystyczna średnich zostanie przetestowana (α = 0,05) przy użyciu statystyki testu F. Jeśli średnie zostaną stwierdzone statystycznie istotną różnicę, wówczas zostaną przeprowadzone testy wielokrotnych porównań post-hoc. Testy wielokrotnych porównań post-hoc (LSD, Bonferroni, Scheffe, Tukey, itp.) zostaną wykorzystane do wykrycia odpowiednich średnich grup znaczących. Jeśli próbki nie spełniają założeń normalności, do analiz statystycznych zostanie wziętych pod uwagę kilka testów nieparametrycznych.

   Krioablacja guza:

   Wszyscy zarejestrowani pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednej z trzech ramion badania. Pacjenci w ramieniu II i III otrzymają krioablację zgodnie z następującym protokołem (podobnym do protokołu zastosowanego w badaniu ACOSOG Z1072).

   Urządzenie do krioablacji: Krioablacja zostanie przeprowadzona przy użyciu dostępnego w handlu systemu kriochirurgicznego ProSense (IceCure Medical Ltd, Cezarea, Izrael) składającego się z konsoli, kriosondy i powiązanego ciekłego azotu (kriogenu) Case Dewars. Konsola jest samodzielnym urządzeniem wyposażonym w interfejs do sterowania i monitorowania procedury krioablacji. Działa ze standardowym zasilaniem 120 VAC (60 Hz).

   Działanie urządzenia: System kriochirurgiczny ProSense wykorzystuje zamknięty system do cyrkulacji ciekłego azotu w końcówce kriosondy, co powoduje powstawanie temperatur poniżej zera, które skutkują ablacją docelowej tkanki. Zmiana jest identyfikowana za pomocą ultradźwięków, a kriosondę umieszcza się w centrum zmiany pod kontrolą USG po odpowiednim znieczuleniu miejscowym i przeprowadza się ablację zgodnie z ustalonym wcześniej algorytmem zamrażania-rozmrażania-zamrażania. Sonda jest następnie podgrzewana przez wewnętrzny elektryczny grzejnik oporowy i usuwana z ciała pacjenta. Procedura krioablacji: Guz jest identyfikowany za pomocą głowicy ultrasonograficznej o wysokiej rozdzielczości z liniową matrycą w dwóch prostopadłych projekcjach. Najdłuższy wymiar guza jest identyfikowany dla równoległego wprowadzenia sondy. Ten wymiar jest wprowadzany do konsoli; konsola określa długość końcówki kriosondy, która ma być poza zmianą chorobową po wprowadzeniu. Po wprowadzeniu pozycja sondy jest potwierdzana w dwóch prostopadłych widokach. Krioablację przeprowadza się w cyklu zamrażania-rozmrażania-zamrażania w zależności od wielkości guza. Cała procedura jest monitorowana pod okiem, a sól fizjologiczna jest infiltrowana, aby uniknąć odmrożenia skóry poprzez hydropreparowanie skóry z dala od kuli lodowej. Rozmiar kuli lodowej jest zapisywany w wymiarach ortogonalnych. W naszym protokole, jeśli pacjent ma więcej niż jedną zmianę, tylko jedna zmiana zostanie usunięta; jednak biopsje z innych uszkodzeń będą badane pod kątem abskopalnego wpływu.

   Infuzja pembrolizumabu i dawkowanie:

   Jako pierwszy krok potwierdziliśmy bezpieczeństwo i tolerancję inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych z krioablacją guza u kobiet z nowo zdiagnozowanym rakiem piersi. Jedną z ważnych kwestii był wybór przeciwciała modulującego odporność. Pembrolizumab, zatwierdzone przez FDA przeciwciało przeciwko PD-1/PD-L1, ma dobrze ugruntowany profil bezpieczeństwa i powoduje długotrwałą remisję trwającą >10 lat u 10-20% chorych na zaawansowanego czerniaka.50 Ponadto, ponieważ limfocyty T gwałtownie zwiększają ekspresję PD-1/PD-L1 po ekspozycji na antygeny,51 co z kolei może osłabić odpowiedź cytotoksyczną, pembrolizumab idealnie nadaje się do modulacji immunologicznej w połączeniu z krioablacją. Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) opublikowało badanie pilotażowe dotyczące tej kombinacji; nie zgłoszono żadnych poważnych działań niepożądanych przypisywanych ipilimumabowi; żadna operacja nie została opóźniona. MSKCC zastosowało 10 mg/kg jako pojedynczą dawkę; jednakże, ponieważ badania wskazują na częstsze występowanie działań niepożądanych przy tej dawce, proponujemy zalecaną dawkę 200 mg dożylnie w ciągu 90 minut przed krioablacją, która jest obecnie stosowaną dawką w warunkach klinicznych dla raków potrójnie ujemnych.

   Metodologia pomiaru wyników:

   Będziemy obserwować i monitorować odpowiedź immunologiczną po zabiegach krioablacji z pembrolizumabem i bez niego. Próbki krwi będą pobierane do probówek do pobierania krwi z EDTA, a następnie dzielone na porcje do analizy fenotypowej limfocytów T i pobierania osocza na obecność cytokin/chemokin oraz do analizy sekwencji RNA we wskazanych punktach czasowych. Zostaną wykonane preparaty patologiczne do badań z próbek biopsji gruboigłowej na początku badania oraz z lumpektomii i węzłów wartowniczych w czasie operacji. Z każdej próbki zostanie wykonanych pięć szkiełek (po zakończeniu rutynowej patologii) dla H&E i immunohistochemii dla nacieków komórek odpornościowych w celu obliczenia procentu TIL. Wszyscy współpracownicy/Kluczowy personel zaangażowany w przeprowadzanie analizy miary wyników nie będą mieli dostępu do grup randomizowanych.

   Poniżej znajdują się szczegóły dotyczące analizy wyników:

   Obliczanie TIL: Wszystkie próbki tkanek, które poddawane są rutynowemu raportowaniu patologicznemu, zostaną ocenione pod kątem raportowania TIL zgodnie z wytycznymi opracowanymi przez Międzynarodową Grupę Roboczą TIL. Zmiana wyniku TIL między pierwotną tkanką z biopsji rdzeniowej a tkanką chirurgiczną będzie przedmiotem analizy w celu oceny wpływu proponowanych interwencji.

   Pomiar zmian komórek T we krwi: Podtypy komórek T można zdefiniować poprzez zróżnicowaną ekspresję markerów powierzchniowych komórek. Będziemy monitorować limfocyty T pod kątem aktywacji, zwiększonej liczby efektorowych komórek T CD8+ oraz rozwoju pamięci efektorowej i centralnej. W celu fenotypowania limfocytów T zostanie przeprowadzone barwienie krwi pełnej (100 µl/barwienie) przeciwciałami przeciwko CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RO, CD127, CD137, ICOS, CCR7 i Ki67 z odpowiednimi kontrolami izotypowymi.55 Po lizie RBC, wybarwione komórki jednojądrzaste będą analizowane na 14-kolorowym cytometrze przepływowym Attune NxT (Thermofisher, Waltham, MA) i analizowane przy użyciu oprogramowania FlowJo (Becton, Dickinson and Company). Limfocyty T (CD3+, CD4+ lub CD8+) będą analizowane pod kątem zmian w pamięci naiwnej (CD27+, CCR7+, CD45RO-), efektorowej (CCR7-, CD45RO-), efektorowej (CD27-, CCR7-, CD45RO+) i centralnej ( CD27+, CCR7+, CD45RO+) markerów fenotypowych oraz aktywacji (ICOS i CD137) i proliferacji (Ki67). Będziemy dalej analizować procent komórek T regulatorowych (CD25+, CD127-). Wykorzystamy te dane do określenia sygnatury immunologicznej komórek T w celu skorelowania skuteczności krioabalacji +/- pembrolizumabu w celu przewidywania długoterminowej odporności przeciwnowotworowej.

   Analiza cytokin/chemokin w osoczu: Nasza wstępna analiza będzie polegała na określeniu, które cytokiny/chemokiny i jakie stężenia są wykrywane we krwi po krioablacji +/- pembrolizumab i jak zmieniają się ich profile. Skupimy się na profilach zapalnych i pomocniczych cytokin komórek T oraz na tym, jak te cytokiny wpływają i kierują odpowiedzią komórek T. Dodatkowo przyjrzymy się zmianom w chemokinach. Wykazano, że ich zmieniona ekspresja w nowotworach dyktuje rekrutację i aktywację leukocytów, angiogenezę, proliferację komórek rakowych i przerzuty we wszystkich stadiach choroby.56 Na linii podstawowej, 24-48 godzin po ablacji, pomiędzy przed chemioterapią, krew będzie pobierana, a osocze izolowane przez odwirowanie 1-2 ml krwi przy 1-2000 x g przez 10 minut, a następnie rozdzielenie 120 µl do probówek mikrowirówkowych o pojemności 0,65 ml. Standardowa grupa opieki będzie miała tylko 3 punkty czasowe pobierania krwi. Próbki osocza będą analizowane za pomocą Bio-Plex 200 w Eve Technologies Corporation (Calgary, AB Kanada) przy użyciu Human High Sensitivity T-Cell Discovery Array 14-plex (HDHSTC14): GM-CSF, IFNy, IL-1B, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNF-a.

   KARTA DANYCH:

   Zobacz arkusz kalkulacyjny Excela. Sekwencja RNA zostanie zebrana jako mapy cieplne dla genów o różnej ekspresji.

   RYZYKO:

   Ryzyko pobrania krwi:

   Ryzyko związane z pobraniem krwi obejmuje: ból, dyskomfort, krwawienie, zasinienie, zaczerwienienie, infekcję w miejscu wkłucia igły w skórę; zawroty głowy, omdlenia.

   Ryzyko związane z krioablacją:

   Krioablacja była bardzo bezpieczną procedurą; PI rutynowo oferuje tę procedurę łagodnym i nowotworowym chorobom piersi; dotychczas zabiegowi poddano 18 chorych na raka i 36 zmian łagodnych. Do tej pory odnotowano następujące łagodne powikłania:

   • Zasinienie w miejscu ablacji - ustępuje samoistnie.
   • Ból - leczony lekami przeciwbólowymi OTC.
   • Martwica skóry jest jednak teoretyczną możliwością, zgodnie z protokołem zabiegu; nigdy nie mieliśmy takiej komplikacji.

   Zagrożenia związane z pembrolizumabem:

   Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad toksycznością inhibitorów immunologicznego punktu kontrolnego.57 Standardowa zalecana dawka pemrolizumabu wynosi 200 mg dożylnie na dawkę (zatwierdzona przez FDA). Przewidywane działania niepożądane obejmują:

   • Wysypka
   • Biegunka
   • Zaparcie
   • Mdłości
   • Utrata masy ciała
   • Suche oczy
   • Zmęczenie
   • Ból głowy
   • Gorączka
   • Ból stawu
   • Dysfunkcja tarczycy

   Utrata poufności:

   Wszystkie dane będą przechowywane w plikach chronionych hasłem w biurze CRI i PI. Wszystkie dane zostaną pozbawione elementów umożliwiających identyfikację w celu kompilacji i analizy. Wszystkie protokoły dotyczące zgodności z HIPAA będą przestrzegane. Jednak minimalne ryzyko naruszenia poufności jest możliwe z powodu błędu ludzkiego.

   KORZYŚCI:

   Pacjenci z ramion II i III mogą odnieść korzyści z udziału w badaniu. Jeśli nasza intuicja dotycząca modulacji immunologicznej poprzez połączenie krioterapii i leku będącego inhibitorem punktu kontrolnego faktycznie wpłynie na kontrolę guza, udział w badaniu odniesie bezpośrednie korzyści dla tych dwóch grup. Jednak ramię kontrolne I nie odniesie korzyści z badania poza dostarczeniem ramienia porównawczego do badania. Głównym celem proponowanego badania jest zidentyfikowanie nowatorskiego podejścia do leczenia niskiego ryzyka tych nowotworów wysokiego ryzyka, które ostatecznie przyniesie korzyści przyszłym pacjentom z rakiem.

   MONITOROWANIE:

   Aby zapewnić zgodność z protokołem badania, wytycznymi GCP oraz zasadami i procedurami badawczymi TTUHSC Human Research Protection Program podczas prowadzenia badania, a także danymi dotyczącymi jakości, monitor w Instytucie Badań Klinicznych będzie prowadził monitorowanie badania. Pierwsza wizyta monitorująca zostanie przeprowadzona w ciągu dwóch tygodni od włączenia pierwszego uczestnika do badania. Kolejne wizyty monitorujące będą planowane okresowo, ale nie rzadziej niż co 2 miesiące, jeśli jest aktywny uczestnik badania, w ramach czasowych wspólnie uzgodnionych przez PI i monitorującego badanie. Wszystkie zebrane dane zostaną w 100% zweryfikowane jako dokument źródłowy. Monitorujący badanie może przeglądać i przeprowadzać audyty wszystkich dokumentów badawczych, tj. formularzy zbierania danych, kwestionariuszy, odpowiedzialności za leki i dokumentacji medycznej w ramach obowiązujących przepisów dotyczących poufności.

   FINANSOWANIE:

   Złożył wniosek o grant NIH R21