LINC01844 jako diagnostický biomarker pro POCD u starších pacientů

Design studie Tato jednocentrová observační studie bude provedena během elektivní bederní dekomprese a fúze na Zhongshan Hospital Fudan University, Šanghaj, Čína. Od všech účastníků je získán písemný informovaný souhlas. Do 21. února 2024 byla studie schválena pro nemocnici Zhongshan, Univerzita Fudan (Čína) se schvalovacím číslem B2024-063R.

Anestezie Po vstupu pacientů na operační sál jsou sledovány vitální funkce, pacientům je podávána inhalace kyslíku (> 8L/min). Celková anestezie je vyvolána sufentanilem (0,2 ug/kg), propofolem [cílová řízená infuze (TCI) v plazmatické koncentraci 3 ug/ml), remifentanilem (TCI v plazmatické koncentraci 3 ng/ml) a rokuroniem (0,6 mg/kg) . Při operaci se používají omamné a vazoaktivní léky podle hloubky anestezie, krevního tlaku a respiračních parametrů. Po operaci je připojena pacientem řízená pumpa pro intravenózní analgezii (PCIA) (sufentanil 250 ug a ramosetron 0,6 mg).

Detekce a příprava LINC01844 Total RNA se extrahuje ze vzorků periferní krve pomocí TRIzol LS (Invitrogen, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, po homogenizaci vzorku krve (250 μl) regentem TRIzol LS (750 μl) se přidá chloroform (200 μl) pro další analýzu. Vzorek se odstřeďuje při 12 000 x g, 4 °C po dobu 15 minut, poté se vodná fáze obsahující RNA přenese do nové zkumavky a přidá se isopropanol (0,5 ml) pro vysrážení RNA. Peleta RNA se promyje 75% ethanolem (1 ml) a nakonec se resuspenduje ve vodě bez RNázy (10-20 μl), kvalita RNA se stanoví pomocí NanoDrop2000. Poměr optické hustoty 260/280 >1,80 je známkou toho, že vzorek by mohl být použit v následujících experimentech. Dále použijeme M-MLV reverzní transkriptázu (Promega, USA) pro syntézu cDNA. Pro konečnou analýzu byla použita kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR) podle pokynů ze sady SYBR Green PCR Master Mix Kit (Qiagen). Parametry PCR: 95˚C po dobu 10 minut; 45 cyklů při 95˚C po dobu 15 s, 60˚C po dobu 30 s a 72˚C 30 s. GAPDH je vybrán jako referenční gen, násobná změna (2-44Ct) se používá k analýze relativních hladin LINC01844.

Vyhodnocení neuropsychologického testu a vyhodnocení POCD Jeden den před operací bude u pacientů hodnocena deprese pomocí dotazníku o zdraví pacienta-9 (PHQ-9), zatímco pacienti s předchozí těžkou kognitivní poruchou jsou vyloučeni pomocí mini vyšetření duševního stavu (MMSE) (MMSE skóre < 24). Baterie neuropsychologických testů bude provedena 1 den před operací a 1., 3. a 5. den po operaci k hodnocení kognitivních funkcí pacientů, včetně Hopkinsova testu sluchového učení revidovaného (HALT-R), krátkého revidovaného testu visuospatial paměti (BVMT -R), test vytváření stopy (TMT), test rozsahu číslic (DST), test substituce digitálních symbolů (DSST) a test vybavování sloves a grafů. Všechna tato vyšetření provádí v klidném prostředí vyškolený lékař, který je nevidomý k chirurgickému výkonu a odběru krve. Zároveň bude jako kontrolní skupina přijato 20 zdravých dobrovolníků bez chirurgického zákroku se shodnými roky věku, pohlaví a vzdělání. Neuropsychologický test bude proveden v kontrolní skupině ke stanovení normální referenční hodnoty kognitivních funkcí se stejným intervalem. Výchozí skóre a výsledky učení byly odečteny od každého skóre neuropsychologického testu podle mezinárodních směrnic pro studium pooperačních kognitivních poruch a vyděleny směrodatnou odchylkou výchozího skóre v kontrolní skupině. Výsledek byl označen jako Z skóre. Když jsou alespoň dvě škály Z větší než 1,961, bylo zvažováno POCD.

Studijní návštěvy a sběr dat Pacienti budou navštíveni předoperačně a pooperačně den (POD) 1 a 3 a 5. Pacienti budou vyšetřeni podle kritérií pro zařazení. Všichni pacienti, kteří splňují kritéria pro zařazení, budou registrováni v souboru protokolu screeningu. Vyšetřovatelé vysvětlí průběh a účel studie a poskytnou písemné informace o studii. Pacienti, kteří se chtějí studie zúčastnit, budou muset poskytnout písemný informovaný souhlas.

Údaje budou registrovány jak v papírovém formuláři zprávy o případu (CRF), tak v elektronickém formuláři zprávy o případu (eCRF) v systému elektronického sběru dat (EDC) personálem hodnocení nebo klinickým personálem pod dohledem zkoušejících v místě hodnocení. V případě nekonzistence bude jako zlatý standard použit papírový CRF.

Nakládání s daty Monitorování studie budou provádět dva členové výzkumného týmu. Vzdálené monitorování bude prováděno za účelem signalizace časných odchylných vzorců, problémů s konzistencí, důvěryhodností a dalších anomálií. Údaje o pacientech budou shromažďovány v pseudonymní podobě pomocí pacientského (identifikačního) čísla složeného ze čtyř tří číslic. Údaje ze studie budou shromažďovány a spravovány pomocí nástrojů EDC (IIT-EDC) iniciovaných zkoušejícím. IIT-EDC je heslem chráněná intranetová aplikace navržená pro podporu záznamu dat pro výzkumné studie (webová stránka: http://10.15.7.137). Vybraným zkoušejícím bude udělen úplný přístup ke konečnému souboru údajů ze studie. Všechny originály záznamů, včetně formulářů souhlasu, hlášení o podezření na neočekávané závažné nežádoucí příhody (SAE) a relevantní korespondence, budou archivovány na zkušebních místech po dobu 10 let. Soubor databáze čisté zkušební verze bude anonymizován a udržován po dobu 10 let.

Bezpečnost Všechny nežádoucí příhody (AE), o kterých se předpokládá, že souvisejí se studií, budou hlášeny koordinačnímu centru studie. Podle místních zákonů a předpisů mohou účastníci obdržet bezplatné ošetření poskytované naší jednotkou nebo být kompenzováni, pokud dojde k jakémukoli zranění souvisejícímu s touto studií, a všechna podezření na neočekávané SAE budou hlášeny výboru pro monitorování dat a bezpečnosti (DMSC). DMSC je nezávislé na zkoušejících a bude provádět průběžnou kontrolu bezpečnostních parametrů a celkové vedení studie. DMSC se skládá ze dvou nezávislých odborníků na rozsáhlé klinické studie a jednoho nezávislého statistika. DMSC bude odpovědné za ochranu zájmů účastníků studie, hodnocení bezpečnosti a účinnosti intervencí během studie a sledování celkového průběhu klinické studie. Pro posílení integrity studie může DMSC také formulovat doporučení týkající se náboru/udržení účastníků, jejich řízení, zlepšení dodržování režimů stanovených protokolem a udržení účastníků a postupů pro správu dat a kontrolu kvality.

Statistická analýza Velikost vzorku - Pro ověření prediktivní hodnoty relativní hladiny LINC01844 v krvi pro POCD starších lidí po operaci musí být plocha pod křivkou (AUC) měřená pomocí křivky provozní charakteristiky přijímače (ROC) větší než 0,5. Na základě výsledků z předběžné studie byla AUC 0,73 a incidence POCD 33,3 %. Velikost vzorku byla vypočtena pomocí PASS (verze 11.0). Pro sílu 80 % a hladinu významnosti 5 % proti jednostranné alternativní hypotéze je zapotřebí 57 účastníků. Vzhledem k tomu, že se očekává 10% výpadek účastníků, je vyžadován vzorek o velikosti 63.

Analýza - Kolmogorov-Smirnovův test bude použit pro posouzení normální distribuce spojitých dat. Základní charakteristiky budou vyjádřeny jako počty a procenta, průměry a standardní odchylky, případně mediány a mezikvartilní rozmezí. Nezávislé prediktory POCD byly analyzovány binární logistickou regresí a výsledky byly vyjádřeny jako poměry šancí (ORs). Předpovědní výkon LINC01844 pro POCD bude měřen pomocí ROC a výsledky byly stanoveny pomocí 95% intervalů spolehlivosti a AUC. Neočekávají se žádné nebo minimální ztráty na sledování primárních a sekundárních výsledků. Pro analýzu všech výsledků se používá populace s úmyslem léčit (ITT, všechny náhodně přidělené případy). Podpůrná analýza je založena na úplném analytickém souboru (FAS, všichni náhodně přiřazení pacienti, kteří podstupují lumbální dekompresi a fúzi). U všech výsledků bude provedena kompletní případová analýza. Pokud se však pro primární výsledek najde více než 1 % chybějících údajů, provede se analýza citlivosti pomocí vícenásobných imputací a metod odhadování rovnic.

Čištění a uzamčení databáze Soubory dat použité a/nebo analyzované během aktuální studie budou na přiměřenou žádost zpřístupněny od odpovídajícího autora. Databáze bude uzamčena okamžitě po zadání všech údajů a vyřešení všech nesouladných nebo chybějících údajů, nebo pokud bylo vynaloženo veškeré úsilí a domníváme se, že zbývající problémy nelze opravit. V tomto kroku budou data zkontrolována před uzamčením databáze. Databáze studie bude poté uzamčena a exportována pro statistickou analýzu. V této fázi bude všem vyšetřovatelům odebráno oprávnění k přístupu do databáze a databáze bude archivována.