Spyt- og fæcesmikrobiomet hos patienter med tilbagevendende aftøs stomatitis før og efter behandling med probiotika

Formålet med undersøgelsen Formålet med denne undersøgelse er at karakterisere spyt- og fæcesmikrobiomet hos patienter med recidiverende aphthous stomatitis (RAS) og at sammenligne resultaterne med resultaterne fra en matchet rask kontrolgruppe. Et andet formål er at undersøge effekten af ​​behandling med probiotika på mikrobiomet i hel spyt og fæces samt sværhedsgraden og antallet af RAS-udbrud. Desuden vil der blive taget en udstrygning fra tilstedeværende aftøse sår før og efter behandling med probiotika for at karakterisere den lokale mikrobiota.

Det antages, at mikrobiomet i hel spyt og fæces fra patienter med RAS (mindre eller større type aphthous ulcers) adskiller sig fra mikrobiomet i hel spyt og fæces fra alders- og kønsmatchede kontrolpersoner.

Det er også en hypotese, at probiotisk behandling har en gavnlig effekt på slimhindesmerter og reducerer sværhedsgraden af ​​RAS og hyppigheden af ​​udbrud. Endvidere antages det, at behandling med probiotika har effekt på mikrobiom i hel spyt og fæces fra patienter med RAS.

Baggrund Tilbagevendende aphthous stomatitis (RAS) er en af ​​de mest almindelige ulcerøse sygdomme, der påvirker mundslimhinden. Prævalensen varierer fra 5-25 %. Ætiologien er stadig ukendt, men adskillige lokale, systemiske, immunologiske, genetiske, allergiske, ernæringsmæssige og mikrobielle faktorer er blevet foreslået som forårsagende stoffer.

Klinisk er RAS karakteriseret ved tilbagevendende anfald af et eller flere afrundede, overfladiske, smertefulde mundsår med et par måneders eller dages mellemrum.

RAS kan klassificeres i tre forskellige typer: mindre, større og herpetiform. Mindre RAS udgør omkring 80 % af tilfældene. Denne type er karakteriseret ved aftøse sår med en diameter på omkring 5 mm, ofte lokaliseret i slimhinden i munden og læberne. Sårene heler inden for 7-10 dage uden at der dannes ar. Større RAS forekommer hos 10-15 % af patienterne. Sårene er ofte krateriforme med en diameter på 10-30 mm, og findes typisk på læbernes slimhinde, den bløde gane, tonsillarområdet og oropharynx. Helingstiden kan variere fra 2 til 6 uger og forlader cicatrix. Disse sår er meget smertefulde, og fødeindtaget kan være kompromitteret. Prævalensen af ​​den herpetiforme type er 5-10%.

Denne type er ofte lokaliseret i mundbunden og den ventrale del af tungen, og den er karakteriseret ved aggregering af flere små sår.

Ætiologien er fortsat ukendt, men en række lokale og systemiske faktorer antages øge dispositionen, herunder slimhindetraumer, stressende hændelser, hormonforandringer, rygestop, allergi over for forskellige fødevarestoffer samt vitamin- og/eller mineralmangel. Det er også en genetisk disposition, da muligheden for at udvikle RAS er 90%, hvis begge forældre har RAS og 20%, hvis en af ​​forældrene har RAS.

Mikrobielle faktorer En række mikroorganismer er blevet foreslået involveret i etiopatogenesen af ​​RAS. Disse omfatter orale streptokokker, især Streptococcus mitis, men krydsreaktionen mellem orale streptokokker og orale slimhindeantigener er uspecifik og anses for at være klinisk ubetydelig. Helicobacter pylori, som er forbundet med gastritis og duodenalsår, kan også ses i tandplak og derfor også foreslås involveret i patogenesen af ​​RAS, men anti-H. pylori seropositivitet er ikke blevet fundet øget hos patienter med RAS. Forskellige vira er blevet fundet i biopsier fra aftøse sår såsom cytomegalovirus og Epstein-Barr virus. Herpes simplex, varicella zoster og adenovirus er også blevet antaget at spille en rolle i aetiopatogenesen. Det har dog ikke været muligt at påvise en årsagssammenhæng mellem virusinfektion og RAS, og virus-DNA kan være til stede på grund af en sekundær infektion.

Nye teknologier forbedrer vores evne til at lave mere dybdegående analyser af mikrobiotaen hos patienter med RAS. Mens der arbejdes på denne undersøgelsesprotokol, er der blevet offentliggjort en undersøgelse af mikrobiomet hos patienter med RAS, der viser en øget andel af Bacteroides-arter i mundslimhinden hos patienter med RAS sammenlignet med raske kontroller. Som tidligere undersøgelser også tyder på, ser den orale mikrobiota således ud til at spille en rolle i udviklingen af ​​RAS såvel som i videreførelsen af ​​RAS.

I denne undersøgelse vil vi karakterisere mikrobiomet i hel spyt, fæces og aftøse sår hos patienter med RAS (med aktive læsioner) og analysere, hvordan det adskiller sig fra mikrobiomet hos raske forsøgspersoner. Denne karakterisering kan være afgørende for vores forståelse af patogenesen af ​​RAS og bidrage til udviklingen af ​​nye strategier til håndtering af disse patienter.

Immunopatologiske faktorer Adskillige undersøgelser indikerer, at patogenesen af ​​RAS omfatter en række cellemedierede mekanismer, men den nøjagtige immunopatogenese er stadig ikke afklaret. Fagocytiske og cytotoksiske T-lymfocytter kan være en rolle i ødelæggelsen af ​​det orale epitel, og tilstedeværelsen af ​​disse immunceller reguleres og vedligeholdes af lokal frigivelse af cytokiner. Patienter med udbrud af RAS har en øget tilstedeværelse af gamma-delta T-celler i blodet sammenlignet med raske kontrolpersoner og patienter uden aktiv RAS. Desuden har patienter med RAS en øget tilstedeværelse af Tumor Necrosis Factor (TNF)-alfa sammenlignet med dem, der ikke har RAS, men også andre proinflammatoriske cytokiner som interleukin-2 og -6 vil sandsynligvis spille en rolle i patogenesen af ​​RAS . Endelig er aftøslignende sår blevet fundet forbundet med en række inflammatoriske tarmsygdomme såsom colitis ulcerosa og Crohns sygdom og cøliaki samt cyklisk neutropeni, HIV-infektion og immunglobulin A (IgA)-mangel. Følgelig kan en immunkomponent være involveret i RAS, som bidrager til en ændring i tarmmikrobiotaen eller omvendt. I dette studie vil vi karakterisere mikrobiotaen i spyt og i fæces fra patienter med RAS før, under og efter behandling med probiotika.

Studiets design og metoder Projektet omfatter et tværsnitsstudie, som undersøger mikrobiomet i hel spyt og fæces fra 20 patienter med RAS og 20 raske kontrolpersoner. Projektet omfatter også en dobbeltblind randomiseret placebokontrolleret intervention med probiotika (Lactobacillus reuteri-holdige sugetabletter 2 tabletter dagligt i 3 måneder) eller placebo. Spyt- og fæcesmikrobiomet hos RAS-patienter sammenlignes før og efter behandling.

Patienterne med RAS rekrutteres blandt patienter henvist til Oral Medicinsk Klinik, Det Sundheds- og Medicinvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet. De 20 raske kontroller rekrutteres via www.forsoegsperson.dk

Metoder omfatter:

• Interview vedr. indtræden af ​​RAS, orale symptomer (vurderet ved hjælp af en visuel analog skala), komorbiditet, medicinindtagelse, ryge- og alkoholvaner, mundhygiejnevaner.
• Indsamling af tyggeparaffinstimuleret helspyt.
• Mundtlig undersøgelse inklusive vurdering af aftøse sår (Ulcer Severity Score), registrering af tandstatus og periodontal status.
• En udstrygning fra et af de aftøse sår.
• En afføringsprøve udtages af forsøgspersonerne selv i deres hjem efter grundig instruktion og håndteres efter manual fra Statens Serum Institut. Fra prøven opsamles 250 mg og opbevares i en fryser holdt ved -80°C indtil videre behandling og analyse.
• En blodprøve inklusive hæmoglobin (HgB), C-reaktivt protein (CRP), jern, cobalamin, folat, transferrin, ferritin og D-vitamin niveauer.

Ekstraktion af bakterielt DNA fra spyt-, fæces- og udstrygningsprøver (ved baseline, 7-dages og 90-dages intervention med henholdsvis probiotika eller placebo) vil blive udført i laboratoriet på Odontologisk Institut, Københavns Universitet ved hjælp af tidligere etablerede procedurer baseret på instruktioner fra Human Microbiome Project.

Metagenomiske analyser på ekstraheret bakterielt DNA fra spyt, udstrygning og fæcesprøver er lavet af Beijing Genomics Institute. Illumina 16S rDNA-sekventering muliggør bestemmelse af bakteriel taksonomi og fylogenetisk diversitet.