Слюнный и фекальный микробиом больных рецидивирующим афтозным стоматитом до и после лечения пробиотиками

Цель исследования Целью данного исследования является характеристика микробиома слюны и фекалий у пациентов с рецидивирующим афтозным стоматитом (РАС) и сравнение результатов с результатами аналогичной здоровой контрольной группы. Другая цель - изучить влияние лечения пробиотиками на микробиом цельной слюны и фекалий, а также на тяжесть и количество вспышек РАН. Кроме того, будет взят мазок из имеющихся афтозных язв до и после лечения пробиотиками, чтобы охарактеризовать местную микробиоту.

Предполагается, что микробиом в цельной слюне и фекалиях пациентов с РАС (афтозные язвы малого или большого типа) отличается от микробиома в цельной слюне и фекалиях контрольных лиц того же возраста и пола.

Также предполагается, что лечение пробиотиками благотворно влияет на боль в слизистой оболочке и снижает тяжесть САС и частоту вспышек. Кроме того, предполагается, что лечение пробиотиком оказывает влияние на микробиом всей слюны и фекалий пациентов с РАС.

Актуальность темы Рецидивирующий афтозный стоматит (РАС) является одним из наиболее частых язвенных заболеваний, поражающих слизистую оболочку полости рта. Распространенность колеблется от 5 до 25%. Этиология остается неизвестной, но в качестве возбудителей были предложены несколько местных, системных, иммунологических, генетических, аллергических, пищевых и микробных факторов.

Клинически РАС характеризуется рецидивирующими приступами одной или нескольких округлых, неглубоких, болезненных язв в полости рта с интервалом в несколько месяцев или дней.

РАС можно разделить на три различных типа: малый, большой и герпетиформный. Малый РАС составляет около 80% случаев. Для этого типа характерны афтозные язвы диаметром около 5 мм, чаще локализующиеся на слизистой оболочке щек и губ. Язвы заживают в течение 7-10 дней без образования рубцов. Большие САС появляются у 10-15% больных. Язвы часто имеют форму кратера диаметром 10-30 мм и обычно располагаются на слизистой оболочке губ, мягком небе, миндалинах и ротоглотке. Время заживления может варьировать от 2 до 6 недель и оставить рубец. Эти язвы очень болезненны, и прием пищи может быть нарушен. Распространенность герпетиформного типа составляет 5-10%.

Этот тип чаще локализуется на дне ротовой полости и вентральной части языка и характеризуется скоплением множественных мелких язв.

Этиология остается неизвестной, но предполагается, что ряд местных и системных факторов увеличивает предрасположенность, включая травму слизистой оболочки, стрессовые события, гормональные изменения, отказ от курения, аллергию на различные пищевые вещества, а также дефицит витаминов и/или минералов. Это также генетическая предрасположенность, так как вероятность развития РАС составляет 90%, если у обоих родителей есть РАС, и 20%, если у одного из родителей есть РАС.

Микробные факторы Предполагается, что в этиопатогенезе РАС участвует ряд микроорганизмов. К ним относятся оральные стрептококки, особенно Streptococcus mitis, но перекрестная реакция между оральными стрептококками и антигенами слизистой оболочки полости рта неспецифична и считается клинически незначительной. Helicobacter pylori, которая связана с гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки, также может быть обнаружена в зубном налете и, следовательно, также может быть вовлечена в патогенез РАС, но анти-H. pylori не было обнаружено увеличения серопозитивности у пациентов с РАС. В биоптатах афтозных язв были обнаружены различные вирусы, такие как цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барр. Предполагается, что в этиопатогенезе также играют роль простой герпес, ветряная оспа и аденовирус. Однако пока не удалось показать причинно-следственную связь между вирусной инфекцией и РАС, и вирусная ДНК может присутствовать из-за вторичной инфекции.

Новые технологии улучшают наши возможности для более глубокого анализа микробиоты у пациентов с РАС. Во время работы над этим протоколом исследования было опубликовано одно исследование микробиома у пациентов с РАН, показывающее повышенную долю видов Bacteroides в слизистой оболочке полости рта пациентов с РАН по сравнению со здоровыми людьми. Таким образом, как показывают предыдущие исследования, микробиота полости рта, по-видимому, играет роль в развитии РАН, а также в сохранении РАН.

В этом исследовании мы охарактеризуем микробиом цельной слюны, фекалий и афтозных язв пациентов с РАС (с активными поражениями) и проанализируем, чем он отличается от микробиома здоровых людей. Эта характеристика может иметь важное значение для нашего понимания патогенеза САС и способствовать разработке новых стратегий ведения этих пациентов.

Иммунопатологические факторы Несколько исследований показывают, что патогенез РАС включает ряд клеточно-опосредованных механизмов, но точный иммунопатогенез до сих пор не выяснен. Фагоцитарные и цитотоксические Т-лимфоциты могут играть роль в разрушении эпителия полости рта, и присутствие этих иммунных клеток регулируется и поддерживается локальным высвобождением цитокинов. У пациентов со вспышкой РАС повышено содержание гамма-дельта Т-клеток в крови по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы и пациентами без активной РАС. Более того, у пациентов с СПА повышенное содержание фактора некроза опухоли (ФНО)-альфа по сравнению с теми, у кого нет СПА, но также другие провоспалительные цитокины, такие как интерлейкин-2 и -6, вероятно, играют роль в патогенезе СПА. . Наконец, были обнаружены афтозные язвы, связанные с рядом воспалительных заболеваний кишечника, таких как язвенный колит, болезнь Крона и глютеновая болезнь, а также с циклической нейтропенией, ВИЧ-инфекцией и дефицитом иммуноглобулина А (IgA). Соответственно, в РАС может участвовать иммунный компонент, который способствует изменению кишечной микробиоты или наоборот. В этом исследовании мы охарактеризуем микробиоту в слюне и фекалиях пациентов с РАС до, во время и после лечения пробиотиками.

Дизайн и методы исследования Проект представляет собой перекрестное исследование, в ходе которого исследуется микробиом цельной слюны и фекалий 20 пациентов с РАС и 20 здоровых лиц контрольной группы. Проект также включает двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое вмешательство с пробиотиками (лепешки, содержащие Lactobacillus reuteri, по 2 таблетки в день в течение 3 месяцев) или плацебо. Слюнный и фекальный микробиом у пациентов с САС сравнивают до и после лечения.

Пациенты с РАС набираются среди пациентов, направленных в Клинику оральной медицины факультета здравоохранения и медицинских наук Копенгагенского университета. 20 здоровых контролей набираются через www.forsoegsperson.dk.

Методы включают в себя:

• Интервью о. начало РАС, оральные симптомы (оценка по визуально-аналоговой шкале), сопутствующая патология, прием лекарственных препаратов, курение и употребление алкоголя, гигиена полости рта.
• Сбор жевательной стимулированной парафином цельной слюны.
• Осмотр полости рта, включая оценку афтозных язв (оценка степени тяжести язвы), регистрацию состояния зубов и пародонта.
• Мазок из одной из афтозных язв.
• Образец фекалий будет взят самими субъектами у себя дома после тщательного инструктажа и обработан в соответствии с руководством Государственного института сывороток. Из образца отбирают 250 мг и хранят в морозильной камере при температуре -80°C до дальнейшей обработки и анализа.
• Анализ крови, включая уровни гемоглобина (HgB), С-реактивного белка (СРБ), железа, кобаламина, фолиевой кислоты, трансферрина, ферритина и витамина D.

Выделение бактериальной ДНК из образцов слюны, фекалий и мазков (исходный уровень, 7-й и 90-й день вмешательства с пробиотиками или плацебо соответственно) будет проводиться в лаборатории кафедры одонтологии Копенгагенского университета с использованием ранее установленных процедуры, основанные на инструкциях проекта «Микробиом человека».

Метагеномный анализ выделенной бактериальной ДНК из образцов слюны, мазков и фекалий проводится Пекинским институтом геномики. Секвенирование рДНК Illumina 16S позволяет определить таксономию и филогенетическое разнообразие бактерий.