益生菌治疗前后复发性口疮性口炎患者的唾液和粪便微生物组

研究目的 本研究的目的是表征复发性口疮性口炎 (RAS) 患者的唾液和粪便微生物组，并将研究结果与匹配的健康对照组的研究结果进行比较。 另一个目的是研究益生菌治疗对整个唾液和粪便中微生物组的影响，以及 RAS 爆发的严重程度和数量。 此外，将在用益生菌治疗之前和之后从存在的口疮性溃疡取涂片以表征局部微生物群。

假设 RAS（轻度或重度阿弗他溃疡）患者的整个唾液和粪便中的微生物组与年龄和性别匹配的对照者的整个唾液和粪便中的微生物组不同。

还假设益生菌治疗对粘膜疼痛具有有益作用，并降低 RAS 的严重程度和发作频率。 此外，假设益生菌治疗对 RAS 患者整个唾液和粪便中的微生物组有影响。

背景 复发性口疮性口炎 (RAS) 是影响口腔粘膜的最常见的溃疡性疾病之一。 患病率从 5-25% 不等。 病因仍然未知，但已提出几种局部、全身、免疫学、遗传、过敏、营养和微生物因素作为致病因子。

临床上，RAS 的特征是每隔几个月或几天反复发作一个或几个圆形、浅表、疼痛的口腔溃疡。

RAS 可分为三种不同类型：轻微型、主要型和疱疹样型。 轻微 RAS 约占病例的 80%。 此型以口疮性溃疡为特征，直径约5mm，常局限于颊、唇黏膜。 溃疡在 7-10 天内愈合，不会形成疤痕。 主要 RAS 出现在 10-15% 的患者中。 溃疡通常为直径10-30mm的火山口状，通常出现在唇粘膜、软腭、扁桃体区和口咽部。 愈合时间可能从 2 到 6 周不等，并留下疤痕。 这些溃疡非常疼痛，食物摄入可能会受到影响。 疱疹型的患病率为5-10%。

本型多发于口底和舌腹，以多发小溃疡聚集为特征。

病因仍然未知，但假设许多局部和全身因素会增加易感性，包括粘膜损伤、应激事件、荷尔蒙变化、戒烟、对各种食物物质过敏以及维生素和/或矿物质缺乏。 这也是一种遗传倾向，因为如果父母双方都患有 RAS，则患 RAS 的可能性为 90%，如果父母之一患有 RAS，则为 20%。

微生物因素 许多微生物被认为与 RAS 的发病机制有关。 这些包括口腔链球菌，尤其是轻链球菌，但口腔链球菌与口腔粘膜抗原之间的交叉反应是非特异性的，在临床上被认为是微不足道的。 与胃炎和十二指肠溃疡相关的幽门螺杆菌也可见于牙菌斑中，因此也被认为参与了 RAS 的发病机制，但抗 H. 在 RAS 患者中未发现幽门螺杆菌血清阳性增加。 在阿弗他溃疡的活组织检查中发现了各种病毒，例如巨细胞病毒和 Epstein-Barr 病毒。 单纯疱疹、水痘带状疱疹和腺病毒也被认为在发病机制中发挥作用。 然而，病毒感染和RAS之间的因果关系尚无法证明，并且病毒DNA可能由于继发感染而存在。

新技术提高了我们对 RAS 患者的微生物群进行更深入分析的能力。 在制定这项研究方案时，一项关于 RAS 患者微生物组的研究已经发表，显示与健康对照组相比，RAS 患者口腔粘膜中拟杆菌属物种的比例增加。 因此，正如之前的研究也表明，口腔微生物群似乎在 RAS 的发展以及 RAS 的持续存在中发挥作用。

在这项研究中，我们将描述 RAS 患者（有活动性病变）的整个唾液、粪便和阿弗他溃疡中的微生物组特征，并分析它与健康受试者的微生物组有何不同。 这种特征对于我们理解 RAS 的发病机制至关重要，并有助于制定管理这些患者的新策略。

免疫病理学因素 多项研究表明，RAS 的发病机制包括多种细胞介导的机制，但确切的免疫发病机制仍未阐明。 吞噬细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞可能在口腔上皮细胞的破坏中发挥作用，并且这些免疫细胞的存在受到细胞因子局部释放的调节和维持。 与健康对照者和没有活动性 RAS 的患者相比，RAS 爆发患者血液中存在更多的 γ-δ T 细胞。 此外，与没有 RAS 的患者相比，RAS 患者的肿瘤坏死因子 (TNF)-α 含量增加，但其他促炎细胞因子如白细胞介素 2 和 -6 也可能在 RAS 的发病机制中发挥作用. 最后，已发现口疮样溃疡与许多炎症性肠病有关，例如溃疡性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻，以及周期性中性粒细胞减少症、HIV 感染和免疫球蛋白 A (IgA) 缺乏症。 因此，免疫成分可能参与 RAS，这有助于改变肠道微生物群，反之亦然。 在这项研究中，我们将描述 RAS 患者在使用益生菌治疗之前、期间和之后的唾液和粪便中的微生物群。

研究设计和方法 该项目包括一项横断面研究，调查了 20 名 RAS 患者和 20 名健康对照者的整个唾液和粪便中的微生物组。 该项目还包括使用益生菌（含罗伊氏乳杆菌的含片，每天 2 片，持续 3 个月）或安慰剂的双盲随机安慰剂对照干预。 比较 RAS 患者治疗前后的唾液和粪便微生物组。

RAS 患者是从转诊到哥本哈根大学健康与医学学院口腔医学诊所的患者中招募的。 20 名健康对照是通过 www.forsoegsperson.dk 招募的

方法包括：

• 面试重新。 RAS 的发作、口腔症状（通过视觉模拟量表评估）、合并症、药物摄入、吸烟和饮酒习惯、口腔卫生习惯。
• 收集咀嚼石蜡刺激的全唾液。
• 口腔检查包括阿弗他溃疡的评估（溃疡严重程度评分）、牙齿状况和牙周状况的登记。
• 一个阿弗他溃疡的涂片。
• 粪便样本将在彻底指导后由受试者自己在家中收集，并根据 Statens Serum Institut 的手册进行处理。 从样品中收集 250 mg 并保存在保持在 -80°C 的冰箱中，直到进一步处理和分析。
• 血液测试包括血红蛋白 (HgB)、C 反应蛋白 (CRP)、铁、钴胺素、叶酸、转铁蛋白、铁蛋白和维生素 D 水平。

从唾液、粪便和涂片样本中提取细菌 DNA（分别在基线、7 天和 90 天益生菌或安慰剂干预时）将在哥本哈根大学牙科学系的实验室中进行，使用先前建立的程序基于人类微生物组计划的说明。

北京基因组研究所对从唾液、涂片和粪便样本中提取的细菌 DNA 进行宏基因组分析。 Illumina 16S rDNA 测序可以确定细菌分类学和系统发育多样性。