Mikrobiom śliny i kału pacjentów z nawracającym aftowym zapaleniem jamy ustnej przed i po leczeniu probiotykami

Cel badania Celem tego badania jest scharakteryzowanie mikrobiomu śliny i kału u pacjentów z nawracającym aftowym zapaleniem jamy ustnej (RAS) oraz porównanie wyników z wynikami grupy kontrolnej osób zdrowych. Kolejnym celem jest zbadanie wpływu leczenia probiotykami na mikrobiom śliny pełnej i kału oraz nasilenie i liczbę ognisk RAS. Ponadto zostanie pobrany wymaz z obecnych owrzodzeń aftowych przed i po leczeniu probiotykami w celu scharakteryzowania miejscowej mikroflory.

Przyjmuje się, że mikrobiom śliny pełnej i kału pacjentów z RAS (aftowe owrzodzenia typu mniejszego lub większego) różni się od mikrobiomu śliny pełnej i kału osób kontrolnych dobranych pod względem wieku i płci.

Przypuszcza się również, że leczenie probiotykami ma korzystny wpływ na ból błony śluzowej oraz zmniejsza nasilenie RAS i częstość napadów. Ponadto zakłada się, że leczenie probiotykiem ma wpływ na mikrobiom w ślinie pełnej i kale pacjentów z RAS.

Wstęp Nawracające aftowe zapalenie jamy ustnej (RAS) jest jedną z najczęstszych chorób wrzodziejących błony śluzowej jamy ustnej. Częstość występowania waha się od 5 do 25%. Etiologia pozostaje nieznana, ale jako czynniki sprawcze zaproponowano kilka czynników lokalnych, ogólnoustrojowych, immunologicznych, genetycznych, alergicznych, żywieniowych i mikrobiologicznych.

Klinicznie RAS charakteryzuje się nawracającymi napadami jednego lub kilku zaokrąglonych, płytkich, bolesnych owrzodzeń jamy ustnej w odstępach kilku miesięcy lub dni.

RAS można podzielić na trzy różne typy: minor, major i herpetiform. Drobny RAS obejmuje około 80% przypadków. Typ ten charakteryzuje się aftowymi owrzodzeniami o średnicy około 5 mm, często zlokalizowanymi na błonie śluzowej policzków i warg. Owrzodzenia goją się w ciągu 7-10 dni bez powstawania blizn. Główne RAS pojawiają się u 10-15% pacjentów. Owrzodzenia są często kraterowate i mają średnicę 10-30 mm i zwykle występują na błonie śluzowej warg, podniebienia miękkiego, okolicy migdałków i części ustnej gardła. Czas gojenia może wahać się od 2 do 6 tygodni i pozostawić bliznę. Te owrzodzenia są bardzo bolesne, a przyjmowanie pokarmu może być zagrożone. Częstość występowania typu opryszczkowego wynosi 5-10%.

Ten typ jest często zlokalizowany w dnie jamy ustnej i brzusznej części języka i charakteryzuje się agregacją wielu małych owrzodzeń.

Etiologia pozostaje nieznana, ale przypuszcza się, że predyspozycję zwiększa szereg czynników miejscowych i ogólnoustrojowych, w tym uraz błony śluzowej, stresujące wydarzenia, zmiany hormonalne, zaprzestanie palenia tytoniu, alergia na różne substancje pokarmowe oraz niedobór witamin i/lub składników mineralnych. Jest to również predyspozycja genetyczna, ponieważ prawdopodobieństwo wystąpienia RAS wynosi 90%, jeśli oboje rodzice mają RAS i 20%, jeśli jedno z rodziców ma RAS.

Czynniki mikrobiologiczne Sugeruje się, że w etiopatogenezie RAS bierze udział wiele mikroorganizmów. Należą do nich paciorkowce jamy ustnej, zwłaszcza Streptococcus mitis, ale reakcja krzyżowa między paciorkowcami jamy ustnej a antygenami błony śluzowej jamy ustnej jest niespecyficzna i uważana za nieistotną klinicznie. Helicobacter pylori, która jest związana z zapaleniem błony śluzowej żołądka i wrzodami dwunastnicy, może być również obserwowana w płytce nazębnej i dlatego sugeruje się, że bierze udział w patogenezie RAS, ale przeciwciała anty-H. pylori seropozytywności nie stwierdzono zwiększonej u pacjentów z RAS. W biopsjach owrzodzeń aftowych znaleziono różne wirusy, takie jak wirus cytomegalii i wirus Epsteina-Barra. Przypuszcza się, że rolę w etiopatogenezie odgrywają również wirus opryszczki pospolitej, półpaśca ospy wietrznej i adenowirus. Jednak nie było możliwe wykazanie związku przyczynowego między infekcją wirusową a RAS, a wirusowe DNA może być obecne z powodu wtórnej infekcji.

Nowe technologie poprawiają naszą zdolność do bardziej dogłębnych analiz mikroflory u pacjentów z RAS. Podczas prac nad tym protokołem badania opublikowano jedno badanie dotyczące mikrobiomu u pacjentów z RAS, wykazujące zwiększoną proporcję gatunków Bacteroides w błonie śluzowej jamy ustnej pacjentów z RAS w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Tak więc, jak sugerują również poprzednie badania, mikroflora jamy ustnej wydaje się odgrywać rolę w rozwoju RAS, jak również w utrwalaniu RAS.

W tym badaniu scharakteryzujemy mikrobiom śliny pełnej, kału i owrzodzeń aftowych pacjentów z RAS (z aktywnymi zmianami) i przeanalizujemy, jak różni się on od mikrobiomu zdrowych osób. Ta charakterystyka może być niezbędna do zrozumienia patogenezy RAS i przyczynić się do opracowania nowych strategii postępowania z tymi pacjentami.

Czynniki immunopatologiczne Kilka badań wskazuje, że patogeneza RAS obejmuje szereg mechanizmów komórkowych, ale dokładna immunopatogeneza wciąż nie jest wyjaśniona. Fagocytarne i cytotoksyczne limfocyty T mogą odgrywać rolę w niszczeniu nabłonka jamy ustnej, a obecność tych komórek odpornościowych jest regulowana i utrzymywana przez miejscowe uwalnianie cytokin. Pacjenci z wybuchem RAS mają zwiększoną obecność limfocytów T gamma-delta we krwi w porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi i pacjentami bez aktywnego RAS. Co więcej, pacjenci z RAS mają zwiększoną obecność czynnika martwicy nowotworów (TNF)-alfa w porównaniu z tymi, którzy nie mają RAS, ale także inne cytokiny prozapalne, takie jak interleukina-2 i -6, prawdopodobnie odgrywają rolę w patogenezie RAS . Wreszcie, stwierdzono, że owrzodzenia przypominające afty są związane z szeregiem chorób zapalnych jelit, takich jak wrzodziejące zapalenie okrężnicy i choroba Leśniowskiego-Crohna oraz celiakia, jak również cykliczna neutropenia, zakażenie wirusem HIV i niedobór immunoglobuliny A (IgA). W związku z tym składnik odpornościowy może być zaangażowany w RAS, które przyczyniają się do zmiany mikroflory jelitowej lub odwrotnie. W tym badaniu scharakteryzujemy mikrobiom w ślinie i kale pacjentów z RAS przed, w trakcie i po leczeniu probiotykami.

Projekt i metody badań Projekt obejmuje badanie przekrojowe, w ramach którego badany jest mikrobiom śliny pełnej i kału 20 pacjentów z RAS i 20 zdrowych osób kontrolnych. Projekt obejmuje również podwójnie ślepą, randomizowaną, kontrolowaną placebo interwencję z probiotykami (zawierającymi Lactobacillus reuteri pastylki do ssania 2 tabletki dziennie przez 3 miesiące) lub placebo. Porównuje się mikrobiom śliny i kału u pacjentów z RAS przed i po leczeniu.

Pacjenci z RAS są rekrutowani spośród pacjentów kierowanych do Kliniki Medycyny Jamy Ustnej Wydziału Zdrowia i Nauk Medycznych Uniwersytetu Kopenhaskiego. 20 zdrowych osób z grupy kontrolnej rekrutuje się za pośrednictwem strony www.forsoegsperson.dk

Metody obejmują:

• Wywiad dot. początek RAS, objawy ze strony jamy ustnej (oceniane za pomocą wizualnej skali analogowej), choroby współistniejące, przyjmowanie leków, palenie tytoniu i spożywanie alkoholu, nawyki dotyczące higieny jamy ustnej.
• Pobieranie pełnej śliny stymulowanej żuciem parafiny.
• Badanie jamy ustnej obejmujące ocenę owrzodzeń aftowych (Ulcer Severity Score), rejestrację stanu uzębienia i stanu przyzębia.
• Wymaz z jednego z aftowych wrzodów.
• Próbki kału zostaną pobrane przez samych pacjentów w ich domach po dokładnym instruktażu i będą traktowane zgodnie z instrukcją Statens Serum Institut. Z próbki pobiera się 250 mg i przechowuje w zamrażarce utrzymywanej w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania i analizy.
• Badanie krwi obejmujące poziom hemoglobiny (HgB), białka C-reaktywnego (CRP), żelaza, kobalaminy, kwasu foliowego, transferyny, ferrytyny i witaminy D.

Ekstrakcja bakteryjnego DNA z próbek śliny, kału i wymazów (na początku, 7-dniowej i 90-dniowej interwencji odpowiednio probiotykami lub placebo) zostanie przeprowadzona w laboratorium Zakładu Odontologii Uniwersytetu w Kopenhadze przy użyciu wcześniej ustalonych procedury oparte na instrukcjach Human Microbiome Project.

Analizy metagenomiczne wyekstrahowanego bakteryjnego DNA ze śliny, rozmazu i próbek kału są wykonywane przez Beijing Genomics Institute. Sekwencjonowanie rDNA Illumina 16S umożliwia określenie taksonomii bakterii i różnorodności filogenetycznej.