Slinný a fekální mikrobiom pacientů s recidivující aftózní stomatitidou před a po léčbě probiotiky

Účel studie Účelem této studie je charakterizovat slinný a fekální mikrobiom u pacientů s recidivující aftózní stomatitidou (RAS) a porovnat nálezy s výsledky odpovídající zdravé kontrolní skupiny. Dalším účelem je prozkoumat účinek léčby probiotiky na mikrobiom v celých slinách a stolici a také závažnost a počet propuknutí RAS. Navíc bude odebrán stěr z přítomných aft před a po léčbě probiotiky za účelem charakterizace místní mikroflóry.

Předpokládá se, že mikrobiom v celých slinách a stolici pacientů s RAS (menší nebo větší typ aft) se liší od mikrobiomu v celých slinách a stolici od věkově a genderově odpovídajících kontrolních osob.

Rovněž se předpokládá, že probiotická léčba má příznivý účinek na bolest sliznic a snižuje závažnost RAS a frekvenci propuknutí. Dále se předpokládá, že léčba probiotiky má vliv na mikrobiom v celých slinách a stolici pacientů s RAS.

Pozadí Rekurentní aftózní stomatitida (RAS) je jedním z nejčastějších ulcerózních onemocnění postihujících ústní sliznici. Prevalence se pohybuje od 5 do 25 %. Etiologie zůstává neznámá, ale bylo navrženo několik lokálních, systémových, imunologických, genetických, alergických, nutričních a mikrobiálních faktorů jako kauzálních agens.

Klinicky je RAS charakterizován opakujícími se záchvaty jednoho nebo několika zaoblených, mělkých, bolestivých vředů v ústech v intervalech několika měsíců nebo dnů.

RAS lze klasifikovat do tří různých typů: minor, major a herpetiform. Menší RAS zahrnuje asi 80 % případů. Pro tento typ jsou charakteristické afty o průměru kolem 5 mm, často lokalizované v bukální a labiální sliznici. Vředy se hojí během 7-10 dnů bez tvorby jizev. Velký RAS se objevuje u 10-15 % pacientů. Vředy jsou často kráterovité o průměru 10-30 mm a typicky se vyskytují na sliznici pysků, měkkého patra, tonzilární oblasti a orofaryngu. Doba hojení se může lišit od 2 do 6 týdnů a zanechání jizvy. Tyto vředy jsou velmi bolestivé a příjem potravy může být ohrožen. Prevalence herpetiformního typu je 5–10 %.

Tento typ je často lokalizován ve spodní části úst a ventrální části jazyka a vyznačuje se agregací mnoha malých vředů.

Etiologie zůstává neznámá, ale předpokládá se, že predispozici zvyšuje řada lokálních a systémových faktorů, včetně slizničního traumatu, stresových událostí, hormonálních změn, odvykání kouření, alergie na různé potravinové látky a také nedostatek vitamínů a/nebo minerálů. Je to také genetická predispozice, protože možnost rozvoje RAS je 90%, pokud mají oba rodiče RAS a 20%, pokud jeden z rodičů má RAS.

Mikrobiální faktory Předpokládá se, že na etiopatogenezi RAS se podílí řada mikroorganismů. Patří mezi ně orální streptokoky, zejména Streptococcus mitis, ale zkřížená reakce mezi orálními streptokoky a antigeny ústní sliznice je nespecifická a považuje se za klinicky nevýznamnou. Helicobacter pylori, který je spojen s gastritidou a duodenálními vředy, může být také pozorován v zubním plaku, a proto se také předpokládá, že se podílí na patogenezi RAS, ale anti-H. pylori nebyla zjištěna zvýšená séropozitivita u pacientů s RAS. V biopsiích z aftových vředů byly nalezeny různé viry, jako je cytomegalovirus a virus Epstein-Barrové. Herpes simplex, varicella zoster a adenovirus se také předpokládá, že hrají roli v etiopatogenezi. Nebylo však možné prokázat kauzální vztah mezi virovou infekcí a RAS a virová DNA může být přítomna v důsledku sekundární infekce.

Nové technologie zlepšují naši schopnost provádět podrobnější analýzy mikroflóry u pacientů s RAS. Při práci na tomto protokolu studie byla publikována jedna studie o mikrobiomu u pacientů s RAS, která ukazuje zvýšený podíl druhů Bacteroides v ústní sliznici pacientů s RAS ve srovnání se zdravými kontrolami. Jak tedy naznačují předchozí studie, zdá se, že orální mikroflóra hraje roli ve vývoji RAS i při zachování RAS.

V této studii budeme charakterizovat mikrobiom v celých slinách, stolici a aftech pacientů s RAS (s aktivními lézemi) a analyzovat, jak se liší od mikrobiomu zdravých jedinců. Tato charakterizace by mohla být zásadní pro naše pochopení patogeneze RAS a přispět k vývoji nových strategií pro léčbu těchto pacientů.

Imunopatologické faktory Několik studií naznačuje, že patogeneze RAS zahrnuje řadu buněčně zprostředkovaných mechanismů, ale přesná imunopatogeneze stále není objasněna. Fagocytární a cytotoxické T-lymfocyty mohou hrát roli při destrukci ústního epitelu a přítomnost těchto imunitních buněk je regulována a udržována lokálním uvolňováním cytokinů. Pacienti s propuknutím RAS mají zvýšenou přítomnost gama-delta T-buněk v krvi ve srovnání se zdravými kontrolními osobami a pacienty bez aktivního RAS. Kromě toho mají pacienti s RAS zvýšenou přítomnost faktoru nekrotizujícího nádory (TNF)-alfa ve srovnání s těmi, kteří RAS nemají, ale v patogenezi RAS pravděpodobně hrají roli i další prozánětlivé cytokiny, jako je interleukin-2 a -6. . Konečně byly nalezeny vředy podobné aftům spojené s řadou zánětlivých onemocnění střev, jako je ulcerózní kolitida a Crohnova choroba a celiakie, stejně jako cyklická neutropenie, infekce HIV a nedostatek imunoglobulinu A (IgA). V souladu s tím může být v RAS zapojena imunitní složka, která přispívá ke změně střevní mikrobioty nebo naopak. V této studii budeme charakterizovat mikrobiotu ve slinách a ve stolici pacientů s RAS před, během a po léčbě probiotiky.

Návrh studie a metody Projekt obsahuje průřezovou studii, která zkoumá mikrobiom v celých slinách a stolici od 20 pacientů s RAS a 20 zdravých kontrolních osob. Součástí projektu je také dvojitě zaslepená randomizovaná placebem kontrolovaná intervence s probiotiky (pastilky s obsahem Lactobacillus reuteri 2 tablety denně po dobu 3 měsíců) nebo placebem. Slinný a fekální mikrobiom u pacientů s RAS je porovnán před a po léčbě.

Pacienti s RAS se rekrutují mezi pacienty odeslanými na Kliniku ústní medicíny Fakulty zdravotnictví a lékařských věd Kodaňské univerzity. 20 zdravých kontrol je nabráno prostřednictvím www.forsoegsperson.dk

Mezi metody patří:

• Rozhovor re. nástup RAS, orální symptomy (hodnocené pomocí vizuální analogové škály), komorbidita, příjem léků, kuřácké a alkoholové návyky, návyky ústní hygieny.
• Sběr celých slin stimulovaných žvýkacím parafinem.
• Ústní vyšetření včetně hodnocení aft (Ulcer Severity Score), registrace stavu chrupu a stavu parodontu.
• Stěr z jednoho z aft.
• Vzorek stolice si po důkladné instruktáži odeberou sami subjekty ve svých domovech a bude s ním zacházeno podle manuálu od Statens Serum Institut. Ze vzorku se odebere 250 mg a uchovává se v mrazničce při -80 °C až do dalšího zpracování a analýzy.
• Krevní test zahrnující hladiny hemoglobinu (HgB), C reaktivního proteinu (CRP), železa, kobalaminu, folátu, transferinu, feritinu a vitaminu D.

Extrakce bakteriální DNA ze vzorků slin, stolice a nátěru (v základním stavu, 7denní a 90denní intervence s probiotiky nebo placebem, v tomto pořadí) bude provedena v laboratoři na Odontologickém oddělení Kodaňské univerzity za použití dříve zavedených postupy založené na pokynech z Human Microbiome Project.

Metagenomické analýzy extrahované bakteriální DNA ze slin, nátěrů a vzorků stolice provádí Pekingský institut genomiky. Sekvenování rDNA Illumina 16S umožňuje stanovení bakteriální taxonomie a fylogenetické diverzity.