O microbioma salivar e fecal de pacientes com estomatite aftosa recorrente antes e depois do tratamento com probióticos

Objetivo do estudo O objetivo deste estudo é caracterizar o microbioma salivar e fecal em pacientes com estomatite aftosa recorrente (EAR) e comparar os achados com os de um grupo de controle saudável pareado. Outro objetivo é investigar o efeito do tratamento com probióticos no microbioma da saliva total e das fezes, bem como a gravidade e o número de surtos de RAS. Além disso, será feito um esfregaço de úlceras aftosas presentes antes e após o tratamento com probióticos, a fim de caracterizar a microbiota local.

Presume-se que o microbioma na saliva total e nas fezes de pacientes com EAR (úlceras aftosas do tipo menor ou maior) difere do microbioma na saliva total e nas fezes de pessoas de controle com idade e sexo semelhantes.

Também é hipotetizado que o tratamento com probióticos tenha um efeito benéfico na dor da mucosa e reduza a gravidade da EAR e a frequência dos surtos. Além disso, supõe-se que o tratamento com probióticos tenha efeito no microbioma da saliva total e das fezes de pacientes com EAR.

Antecedentes A estomatite aftosa recorrente (EAR) é uma das doenças ulcerativas mais comuns que afetam a mucosa oral. A prevalência varia de 5-25%. A etiologia permanece desconhecida, mas vários fatores locais, sistêmicos, imunológicos, genéticos, alérgicos, nutricionais e microbianos foram propostos como agentes causadores.

Clinicamente, a EAR é caracterizada por surtos recorrentes de uma ou várias úlceras orais arredondadas, rasas e dolorosas em intervalos de alguns meses ou dias.

A EAR pode ser classificada em três tipos diferentes: menor, maior e herpetiforme. A EAR menor compreende cerca de 80% dos casos. Este tipo é caracterizado por úlceras aftosas com um diâmetro de cerca de 5 mm, frequentemente localizadas na mucosa bucal e labial. As úlceras cicatrizam em 7 a 10 dias sem formação de cicatrizes. Major EAR aparecem em 10-15% dos pacientes. As úlceras são frequentemente crateriformes com um diâmetro de 10-30 mm, e tipicamente presentes na mucosa labial, palato mole, região tonsilar e orofaringe. O tempo de cicatrização pode variar de 2 a 6 semanas e deixando cicatriz. Essas úlceras são muito dolorosas e a ingestão de alimentos pode ser comprometida. A prevalência do tipo herpetiforme é de 5-10%.

Este tipo localiza-se frequentemente no soalho da boca e na parte ventral da língua e caracteriza-se pela agregação de múltiplas pequenas úlceras.

A etiologia permanece desconhecida, mas presume-se que vários fatores locais e sistêmicos aumentam a predisposição, incluindo trauma da mucosa, eventos estressantes, alterações hormonais, cessação do tabagismo, alergia a várias substâncias alimentares, bem como deficiência de vitaminas e/ou minerais. Também é uma predisposição genética, pois a possibilidade de desenvolver RAS é de 90% se ambos os pais tiverem RAS e 20% se um dos pais tiver RAS.

Fatores microbianos Vários microrganismos foram sugeridos como envolvidos na etiopatogenia da EAR. Estes incluem estreptococos orais, especialmente Streptococcus mitis, mas a reação cruzada entre estreptococos orais e antígenos da mucosa oral é inespecífica e considerada clinicamente insignificante. O Helicobacter pylori, que está associado à gastrite e úlceras duodenais, também pode ser observado na placa dentária e, portanto, também pode estar envolvido na patogênese da EAR, mas o anticorpo anti-H. pylori soropositividade não foi encontrada aumentada em pacientes com EAR. Vários vírus foram encontrados em biópsias de úlceras aftosas, como citomegalovírus e vírus Epstein-Barr. Herpes simplex, varicela zoster e adenovírus também foram considerados como desempenhando um papel na etiopatogenia. No entanto, não foi possível mostrar uma relação causal entre a infecção pelo vírus e a RAS, e o DNA viral pode estar presente devido a uma infecção secundária.

Novas tecnologias melhoram nossa capacidade de fazer análises mais aprofundadas da microbiota em pacientes com EAR. Enquanto trabalhava neste protocolo de estudo, um estudo sobre o microbioma em pacientes com RAS foi publicado mostrando uma proporção aumentada de espécies de Bacteroides na mucosa oral de pacientes com RAS em comparação com controles saudáveis. Assim, como estudos anteriores também sugerem, a microbiota oral parece desempenhar um papel no desenvolvimento da EAR, bem como na perpetuação da RAS.

Neste estudo iremos caracterizar o microbioma na saliva total, nas fezes e nas úlceras aftosas de pacientes com EAR (com lesões ativas) e analisar como ele difere do microbioma de indivíduos saudáveis. Essa caracterização pode ser essencial para o entendimento da patogênese da EAR e contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para o manejo desses pacientes.

Fatores imunopatológicos Vários estudos indicam que a patogênese da EAR inclui vários mecanismos mediados por células, mas a imunopatogênese exata ainda não está esclarecida. Os linfócitos T fagocíticos e citotóxicos podem desempenhar um papel na destruição do epitélio oral e a presença dessas células imunes é regulada e mantida pela liberação local de citocinas. Pacientes com surto de RAS têm uma presença aumentada de células T gama-delta no sangue em comparação com pessoas saudáveis ​​e pacientes sem RAS ativo. Além disso, os pacientes com RAS têm uma presença aumentada de Fator de Necrose Tumoral (TNF)-alfa em comparação com aqueles que não têm RAS, mas também outras citocinas pró-inflamatórias como interleucina-2 e -6 provavelmente desempenham um papel na patogênese da RAS . Finalmente, úlceras semelhantes a aftosas foram encontradas associadas a várias doenças intestinais inflamatórias, como colite ulcerativa e doença de Crohn e doença celíaca, bem como neutropenia cíclica, infecção por HIV e deficiência de imunoglobulina A (IgA). Assim, um componente imunológico pode estar envolvido no RAS que contribui para uma alteração na microbiota intestinal ou vice-versa. Neste estudo, iremos caracterizar a microbiota na saliva e nas fezes de pacientes com EAR antes, durante e após o tratamento com probióticos.

O desenho do estudo e os métodos O projeto compreende um estudo transversal que investiga o microbioma na saliva total e nas fezes de 20 pacientes com EAR e 20 pessoas de controle saudáveis. O projeto também inclui uma intervenção duplo-cega randomizada controlada por placebo com probióticos (pastilhas contendo Lactobacillus reuteri 2 comprimidos por dia durante 3 meses) ou placebo. O microbioma salivar e fecal em pacientes com EAR é comparado antes e depois do tratamento.

Os pacientes com EAR são recrutados entre os pacientes encaminhados à Clínica de Medicina Oral da Faculdade de Saúde e Ciências Médicas da Universidade de Copenhague. Os 20 controles saudáveis ​​são recrutados via www.forsoegsperson.dk

Os métodos incluem:

• Entrevista ref. aparecimento de EAR, sintomas orais (avaliados por meio de escala visual analógica), comorbidade, uso de medicamentos, tabagismo e etilismo, hábitos de higiene bucal.
• Coleta de saliva total mastigada estimulada com parafina.
• Exame oral, incluindo avaliação de úlceras aftosas (Ulcer Severity Score), registro do estado dentário e estado periodontal.
• Um esfregaço de uma das úlceras aftosas.
• Uma amostra fecal será coletada pelos próprios sujeitos em suas casas após instrução minuciosa e manuseada de acordo com o manual do Statens Serum Institut. Da amostra, 250 mg são coletados e mantidos em freezer a -80°C até posterior processamento e análise.
• Um exame de sangue incluindo níveis de hemoglobina (HgB), proteína C reativa (PCR), ferro, cobalamina, folato, transferrina, ferritina e vitamina D.

A extração de DNA bacteriano de amostras de saliva, fezes e esfregaço (no início, 7 dias e 90 dias de intervenção com probióticos ou placebo, respectivamente) será realizada no laboratório do Departamento de Odontologia da Universidade de Copenhague, usando métodos previamente estabelecidos procedimentos baseados nas instruções do Projeto Microbioma Humano.

As análises metagenômicas do DNA bacteriano extraído da saliva, esfregaço e amostras fecais são feitas pelo Beijing Genomics Institute. O sequenciamento Illumina 16S rDNA permite a determinação da taxonomia bacteriana e da diversidade filogenética.