Il microbioma salivare e fecale dei pazienti con stomatite aftosa ricorrente prima e dopo il trattamento con probiotici

Scopo dello studio Lo scopo di questo studio è caratterizzare il microbioma salivare e fecale in pazienti con stomatite aftosa ricorrente (RAS) e confrontare i risultati con quelli di un gruppo di controllo sano abbinato. Un altro scopo è studiare l'effetto del trattamento con probiotici sul microbioma nella saliva e nelle feci intere, nonché la gravità e il numero di focolai di RAS. Inoltre, verrà prelevato uno striscio dalle ulcere aftose presenti prima e dopo il trattamento con probiotici per caratterizzare il microbiota locale.

Si presume che il microbioma dell'intera saliva e delle feci di pazienti con RAS (ulcere aftose di tipo minore o maggiore) differisca dal microbioma dell'intera saliva e delle feci delle persone di controllo corrispondenti per età e sesso.

Si ipotizza inoltre che il trattamento probiotico abbia un effetto benefico sul dolore della mucosa e riduca la gravità della RAS e la frequenza delle epidemie. Inoltre, si presume che il trattamento con probiotici abbia un effetto sul microbioma nella saliva intera e nelle feci di pazienti con RAS.

Background La stomatite aftosa ricorrente (RAS) è una delle malattie ulcerative più comuni che colpiscono la mucosa orale. La prevalenza varia dal 5 al 25%. L'eziologia rimane sconosciuta, ma diversi fattori locali, sistemici, immunologici, genetici, allergici, nutrizionali e microbici sono stati proposti come agenti causali.

Clinicamente, la RAS è caratterizzata da attacchi ricorrenti di una o più ulcere orali arrotondate, superficiali e dolorose a intervalli di pochi mesi o giorni.

La RAS può essere classificata in tre diversi tipi: minore, maggiore ed erpetiforme. La RAS minore comprende circa l'80% dei casi. Questo tipo è caratterizzato da ulcere aftose del diametro di circa 5 mm, spesso localizzate nella mucosa buccale e labiale. Le ulcere guariscono entro 7-10 giorni senza formazione di cicatrici. La RAS maggiore compare nel 10-15% dei pazienti. Le ulcere sono spesso crateriformi con un diametro di 10-30 mm, e sono tipicamente presenti sulla mucosa labiale, sul palato molle, sulla regione tonsillare e sull'orofaringe. Il tempo di guarigione può variare da 2 a 6 settimane e lasciando la cicatrice. Queste ulcere sono molto dolorose e l'assunzione di cibo può essere compromessa. La prevalenza del tipo erpetiforme è del 5-10%.

Questo tipo è spesso localizzato nel pavimento della bocca e nella parte ventrale della lingua, ed è caratterizzato dall'aggregazione di molteplici piccole ulcere.

L'eziologia rimane sconosciuta, ma si presume che una serie di fattori locali e sistemici aumentino la predisposizione, inclusi traumi della mucosa, eventi stressanti, cambiamenti ormonali, cessazione del fumo, allergia a varie sostanze alimentari e carenza di vitamine e/o minerali. C'è anche una predisposizione genetica in quanto la possibilità di sviluppare la RAS è del 90% se entrambi i genitori hanno la RAS e del 20% se uno dei genitori ha la RAS.

Fattori microbici È stato suggerito che un certo numero di microrganismi siano coinvolti nell'eziopatogenesi della RAS. Questi includono streptococchi orali, in particolare Streptococcus mitis, ma la reazione crociata tra streptococchi orali e antigeni della mucosa orale è aspecifica e considerata clinicamente insignificante. L'Helicobacter pylori, che è associato a gastrite e ulcere duodenali, può essere visto anche nella placca dentale e quindi anche essere suggerito coinvolto nella patogenesi della RAS, ma l'anti-H. pylori la sieropositività non è stata trovata aumentata nei pazienti con RAS. Vari virus sono stati trovati nelle biopsie di ulcere aftose come il citomegalovirus e il virus di Epstein-Barr. Si ritiene che anche l'herpes simplex, la varicella zoster e l'adenovirus svolgano un ruolo nell'eziopatogenesi. Tuttavia, non è stato possibile dimostrare una relazione causale tra infezione da virus e RAS e il DNA virale potrebbe essere presente a causa di un'infezione secondaria.

Le nuove tecnologie migliorano la nostra capacità di effettuare analisi più approfondite del microbiota nei pazienti con RAS. Mentre si lavora su questo protocollo di studio, è stato pubblicato uno studio sul microbioma nei pazienti con RAS che mostra una percentuale maggiore di specie Bacteroides nella mucosa orale dei pazienti con RAS rispetto ai controlli sani. Pertanto, come suggeriscono anche studi precedenti, il microbiota orale sembra svolgere un ruolo nello sviluppo della RAS e nella perpetuazione della RAS.

In questo studio caratterizzeremo il microbioma nella saliva intera, nelle feci e nelle ulcere aftose di pazienti con RAS (con lesioni attive) e analizzeremo come differisce dal microbioma di soggetti sani. Questa caratterizzazione potrebbe essere essenziale per la nostra comprensione della patogenesi della RAS e contribuire allo sviluppo di nuove strategie per la gestione di questi pazienti.

Fattori immunopatologici Diversi studi indicano che la patogenesi della RAS include un certo numero di meccanismi cellulo-mediati, ma l'esatta immunopatogenesi non è ancora stata chiarita. I linfociti T fagocitici e citotossici possono svolgere un ruolo nella distruzione dell'epitelio orale e la presenza di queste cellule immunitarie è regolata e mantenuta dal rilascio locale di citochine. I pazienti con focolaio di RAS hanno una maggiore presenza di cellule T gamma-delta nel sangue rispetto alle persone di controllo sane e ai pazienti senza RAS attiva. Inoltre, i pazienti con RAS hanno una maggiore presenza di Tumor Necrosis Factor (TNF)-alfa rispetto a quelli che non hanno RAS, ma è probabile che anche altre citochine proinfiammatorie come l'interleuchina-2 e -6 svolgano un ruolo nella patogenesi della RAS . Infine, le ulcere aftose sono state trovate associate a una serie di malattie infiammatorie intestinali come la colite ulcerosa e il morbo di Crohn e la celiachia, nonché la neutropenia ciclica, l'infezione da HIV e la carenza di immunoglobuline A (IgA). Di conseguenza, nella RAS può essere coinvolta una componente immunitaria che contribuisce a un cambiamento nel microbiota intestinale o viceversa. In questo studio, caratterizzeremo il microbiota nella saliva e nelle feci di pazienti con RAS prima, durante e dopo il trattamento con probiotici.

Il disegno ei metodi dello studio Il progetto comprende uno studio trasversale che indaga il microbioma nella saliva e nelle feci intere di 20 pazienti con RAS e 20 persone sane di controllo. Il progetto prevede anche un intervento in doppio cieco randomizzato controllato con placebo con probiotici (pastiglie contenenti Lactobacillus reuteri 2 compresse al giorno per 3 mesi) o placebo. Il microbioma salivare e fecale nei pazienti con RAS viene confrontato prima e dopo il trattamento.

I pazienti con RAS sono reclutati tra i pazienti riferiti alla Clinica di Medicina Orale, Facoltà di Salute e Scienze Mediche, Università di Copenaghen. I 20 controlli sani vengono reclutati tramite www.forsoegsperson.dk

I metodi includono:

• Intervista rif. insorgenza di RAS, sintomi orali (valutati mediante una scala analogica visiva), comorbidità, assunzione di farmaci, abitudine al fumo e all'alcool, abitudini di igiene orale.
• Raccolta di saliva intera stimolata dalla paraffina da masticare.
• Esame orale compresa la valutazione delle ulcere aftose (Ulcer Severity Score), registrazione dello stato dentale e dello stato parodontale.
• Una macchia di una delle ulcere aftose.
• Un campione fecale sarà raccolto dai soggetti stessi nelle loro case dopo un'accurata istruzione e maneggiato secondo il manuale dello Statens Serum Institut. Dal campione vengono raccolti 250 mg e conservati in un congelatore mantenuto a -80°C fino all'ulteriore elaborazione e analisi.
• Un esame del sangue che include emoglobina (HgB), proteina C reattiva (CRP), ferro, cobalamina, folati, transferrina, ferritina e livelli di vitamina D.

L'estrazione del DNA batterico da campioni di saliva, feci e strisci (al basale, 7 giorni e 90 giorni di intervento con probiotici o placebo, rispettivamente) sarà effettuata nel laboratorio del Dipartimento di Odontoiatria, Università di Copenaghen, utilizzando metodi precedentemente stabiliti procedure basate sulle istruzioni del progetto Human Microbiome.

Le analisi metagenomiche sul DNA batterico estratto da saliva, strisci e campioni fecali sono effettuate dal Beijing Genomics Institute. Il sequenziamento Illumina 16S rDNA consente la determinazione della tassonomia batterica e della diversità filogenetica.